本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種谷氨酸棒桿菌突變株與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

色氨酸是唯一有吲哚支鏈的芳香族氨基酸，化學(xué)名稱為2-氨基-3-吲哚基丙酸。色氨酸是人體和動物體中的必需限制性氨基酸之一，在體內(nèi)合成極微，需從外界攝取。它對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用。在生物體內(nèi)，色氨酸是合成5-羥基色胺、吲哚乙酸、煙酸、色素、生物堿和輔酶等激素和生理活性物質(zhì)的前體物。目前色氨酸被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域。

色氨酸的生產(chǎn)方法有蛋白水解提取法、化學(xué)合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法。蛋白水解法原料來源有限?；瘜W(xué)合成需要高溫高壓，合成的是D-色氨酸和L-色氨酸的混合物，需要另外的精制過程。酶催化所用底物吲哚和絲氨酸價格昂貴，且酶本身也不安全。因此，前三種方法在工業(yè)生產(chǎn)中受到極大限制。目前微生物發(fā)酵法是色氨酸生產(chǎn)的主要方法。主要生產(chǎn)菌種為大腸桿菌，而大腸桿菌發(fā)酵過程易積累乙酸等副產(chǎn)物，嚴(yán)重抑制菌體生長、產(chǎn)酸水平和糖酸轉(zhuǎn)化率；另外，大腸桿菌產(chǎn)內(nèi)毒素嚴(yán)重限制了產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域。

谷氨酸棒桿菌為GRAS生物安全菌，為潛在的色氨酸生產(chǎn)菌種。谷氨酸棒狀桿菌在氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域有著舉足輕重的地位，至今已經(jīng)被安全應(yīng)用了近60年。目前，包括谷氨酸、賴氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等大多數(shù)氨基酸都是利用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。在谷氨酸棒桿菌中，由莽草酸途徑的中間物分支酸合成色氨酸的4個酶由6個基因組成的trpEGDCBA色氨酸操縱子編碼。trpE和trpG分別編碼鄰氨基苯甲酸合酶(ANS)的大小亞基，ANS催化分支酸到鄰氨基苯甲酸的第一步反應(yīng)。trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(PRT)，trpC編碼雙功能酶磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶/吲哚-3-甘油磷酸合酶，trpB和trpA分別編碼色氨酸合酶(TS)的β鏈和α鏈。ANS受終產(chǎn)物色氨酸的強烈抑制，抑制50％酶活的色氨酸濃度為0.0015mM(Sugimoto和Shiio(1983).Agricultural and Biological Chemistry.47:2295 2305)。對PRT和TS的50％酶活抑制濃度分別為0.15mM(Sugimoto和Shiio(1983).Agricultural and Biological Chemistry.47:2295 2305)和7.7mM(Sugimoto和Shiio(1982).Agricultural and Biological Chemistry.46:2711 2718)。Matsui等通過5-氟色氨酸抗性選育的谷氨酸棒桿菌AJ12036編碼ANS大亞基的trpE基因上一個點突變使得絲氨酸密碼子(AGC)變?yōu)榫彼崦艽a子(CGC)，相應(yīng)多肽鏈上氨基酸的改變(Ser38Arg)導(dǎo)致ANS對色氨酸的反饋抑制不敏感(Matsui等(1987).Journal of Bacteriology.109:5330 5332)。O’GARA和Dunican發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生色氨酸的谷氨酸棒桿菌ATCC 21850編碼PRT的trpD基因上兩個點突變，帶來多肽鏈上兩個氨基酸的改變(Ser149Phe，Ala162Glu)，導(dǎo)致PRT對色氨酸和5-甲基色氨酸具有更高的抗性(O’GARA和Dunican(1995).Applied and Environmental Microbiology.61(12):4477 4479)。綜上所述，谷氨酸棒桿菌色氨酸操縱子編碼的酶受到終產(chǎn)物色氨酸的反饋抑制，成為限制利用谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)色氨酸的重要因素，而目前有關(guān)解除色氨酸反饋調(diào)節(jié)的報道較少，相應(yīng)菌株色氨酸生產(chǎn)水平也很低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種谷氨酸棒桿菌突變株。

本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供由上述谷氨酸棒桿菌突變株的應(yīng)用，用于高產(chǎn)色氨酸。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種谷氨酸棒桿菌突變株，是以谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)ATCC13032為出發(fā)菌株，通過常壓室溫等離子體(ARTP)誘變，在含2g/L 5-甲基色氨酸基本培養(yǎng)基上篩選獲得的谷氨酸棒桿菌TP607，菌株鄰氨基苯甲酸合酶(ANS)小亞基編碼基因trpG發(fā)生2個點突變，突變基因的序列為序列表<400>1(<400>2)所示序列。

上述谷氨酸棒桿菌突變株，具有5-甲基色氨酸抗性、可以高產(chǎn)色氨酸。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒桿菌突變株，保藏號為CGMCC No.12302。

上述谷氨酸棒桿菌突變株在制備色氨酸方面的應(yīng)用。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒桿菌突變株的應(yīng)用，制備色氨酸的具體步驟如下：首先將菌體谷氨酸棒桿菌突變株接種到試管斜面活化培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)接搖瓶進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)中期時轉(zhuǎn)接到5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵34h時菌體OD₆₀₀為108。

上述谷氨酸棒桿菌突變株的應(yīng)用，培養(yǎng)基中積累2.9g/L色氨酸，實現(xiàn)了利用谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)色氨酸。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒桿菌突變株的應(yīng)用，制備色氨酸的具體步驟如下：

(1)菌種活化

斜面培養(yǎng)：取-80℃保藏菌種劃線接種于活化斜面，32℃培養(yǎng)12h，并傳代一次；

(2)種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：使用5L發(fā)酵罐培養(yǎng)種子，用無菌水沖洗二代斜面制備菌懸液，按10％接種到種子培養(yǎng)基中，終體積為2L。發(fā)酵溫度32℃、pH 7.0±0.2，相對溶氧控制在40±5％，培養(yǎng)12h，菌體OD₆₀₀達(dá)到15±2時，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；

(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)：采用分批流加補料工藝，發(fā)酵罐放液種子培養(yǎng)基1.4L，添加2.4L的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為20±2％；培養(yǎng)溫度為32±2℃，pH 7.0±0.2，相對溶氧控制在25±5％，發(fā)酵周期為36h。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒桿菌突變株的應(yīng)用，所述步驟(1)中使用的活化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl 2.5，玉米漿15mL/L，瓊脂25，pH 7.0-7.2，滅菌條件：121℃、20min。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒桿菌突變株的應(yīng)用，所述步驟(2)中使用的種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖35，酵母粉5，玉米漿60mL/L，豆粕水解液20mL/L，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄ 0.5，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，VB₁ 0.001，pH7.0-7.2，滅菌條件：121℃、20min。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒桿菌突變株的應(yīng)用，所述步驟(3)中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿25mL/L，豆粕水解液25mL/L，(NH₄)₂SO₄ 3，KH₂PO₄ 2.2，MgSO₄ 0.7，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，VB₁ 0.001，pH 7.0-7.2，滅菌條件：121℃，20min。

優(yōu)選的，上述谷氨酸棒桿菌突變株的應(yīng)用，所述菌體谷氨酸棒桿菌突變株的保存條件為-80℃、保存于16％甘油管中。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的谷氨酸棒桿菌突變株是通過等離子體誘變谷氨酸棒桿菌13032，獲得的新的谷氨酸棒桿菌突變株C.glutamicum TP607，該菌株具有5-甲基色氨酸(色氨酸結(jié)構(gòu)類似物)抗性，相對于親本菌株13032不能產(chǎn)生色氨酸，該突變株C.glutamicum TP607培養(yǎng)液中可以積累2.9g/L色氨酸，是非常有利于用作開發(fā)色氨酸發(fā)酵菌株的出發(fā)菌株，所含trpG突變基因也適用于采用基因工程手段構(gòu)建重組菌株；通過分析與色氨酸生物合成有關(guān)的基因，為色氨酸合成及基因研究提供了新的方向與途徑。

保藏信息

分類名詞：谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum

保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2016年03月22日

保藏號：CGMCC No.12302

附圖說明

圖1為PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；

圖2為trpG突變基因(編碼蛋白)與出發(fā)基因(編碼蛋白)同源比對圖，圖中顯示，70位堿基G突變成A，對應(yīng)的氨基酸的變化為24位的Ala突變成Thr；95位堿基G突變成A，對應(yīng)的氨基酸的變化為32位的Arg突變成His；

圖3為發(fā)酵過程中菌體生長圖；

圖4為發(fā)酵過程中色氨酸的積累量圖；

圖5為發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中色氨酸濃度的HPLC檢測圖，其中，A：0.5g/L色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，出峰時間為3.731min，B：發(fā)酵樣品，色氨酸出峰時間3.754min。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實施例1

谷氨酸棒桿菌突變株TP607的篩選

1.出發(fā)菌株：C.glutamicum13032

2.常壓室溫等離子體誘變

(1)菌體培養(yǎng)：從保菌管挑取少量菌體，三區(qū)劃線接種到含活化培養(yǎng)基(見實施例3)的培養(yǎng)皿中，32℃培養(yǎng)24h；從平板上挑單菌落接含有相同培養(yǎng)基的搖管，32℃、200rpm培養(yǎng)12h；按1％接種量接種搖瓶(培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基，見實施例3)，32℃、200rpm培養(yǎng)8-10h。

(2)菌懸液制備：離心收集培養(yǎng)好的菌體，無菌生理鹽水洗滌3次后，再用無菌生理鹽水適量稀釋制成OD₆₀₀值在0.6-0.8的菌懸液，取10μL菌懸液涂在載片上待處理。

(3)ARTP誘變：ARTP處理參數(shù)為：載片處于氣流端口2mm處；功率為120W；氣流量為10SLM；作用時間為40s。

3.5-甲基色氨酸抗性突變株篩選

將經(jīng)過ARTP誘變處理后的菌懸液涂布在含有2g/L 5-甲基色氨酸基本培養(yǎng)基上(CGXII)平板上，32℃培養(yǎng)24h。挑取菌落大的菌株進(jìn)行基因序列測定和色氨酸發(fā)酵測試。

CGXII基本培養(yǎng)基配方：

葡萄糖40g/L，尿素5g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，CuSO₄ 0.2mg/L，NiCl₂·6H₂O 0.02mg/L，原兒茶酸0.03mg/L，生物素0.2mg/L，CaCl₂ 10mg/L。添加42g/L MOPS使pH維持在7.3左右。

實施例2

突變株TP607中trpG基因的克隆與序列分析

1.谷氨酸棒桿菌TP607基因組DNA的提取

將單菌落接種于CGXII搖管中，32℃過夜培養(yǎng)12h后，按2％接種量接入30mL CGXII培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)過夜。提取基因組步驟如下：

(1)將菌液13000rpm離心2min，去上清液，收集到1.5mL的EP管中。

(2)加600μL pH 8.0的TE buffer懸浮菌體，13000rpm離心2min，棄上清液。

(3)加600μL TE重新懸浮菌體，加入6μL RNAase(10μg/mL)，30μl溶菌酶(50μg/mL)混勻，37℃保溫30min以上。

(4)加30μL 10％SDS和10μL蛋白酶K，混勻，65℃保溫15min以上。

(5)加入100μL 5mol/L NaCl溶液混勻后，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，顛倒混勻50次，65℃水浴10min。

(6)加入750μL酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)抽提，顛倒混勻50次，13000rpm離心15min。

(7)將上清液吸入新的1.5mL EP管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)抽提，顛倒混勻50次，13000rpm離心15min。

(8)將上清液吸入新的1.5mL EP管中，加1倍體積異丙醇，顛倒混合，-80℃冷激15min，13000rpm離心10min，棄上清。

(9)加入70％乙醇，輕彈重懸，靜置6-7min，13000rpm離心2-5min，去上清。

(10)烘箱干燥(37℃)后，加入50μL去離子水，溶解DNA，測DNA濃度，于-20℃保存。

2.谷氨酸棒桿菌TP607中trpG基因的擴增

根據(jù)GenBank公布的谷氨酸棒桿菌13032中trpG基因的序列(Gene ID：1020973)，設(shè)計特異性引物：

上游引物P1：5’-ATTCTAATCCTCAATCTGAAGCCG-3’；

下游引物P2：5’-TTATCCAAGTAGGCGTTGAGAACTT-3’。

以TP607的基因組為模板，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，98℃變性10s，57℃退火5s，72℃延伸40s，30個循環(huán)后，72℃最后延伸10min。72℃延伸20min后補加0.5μL Ex Taq酶加Poly A尾。反應(yīng)結(jié)束后取5μL擴增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。圖1中1號泳道中條帶與marker相比，大小符合理論值796bp。

3.PCR產(chǎn)物回收與連接克隆載體

步驟2中PCR產(chǎn)物采用液相回收純化DNA試劑盒回收，將回收的DNA片段連接到pMD18-T-simple載體上。連接反應(yīng)中各組分及加樣量比例：回收PCR產(chǎn)物4.5，pMD18-T-simple載體0.5，Solution I 5，總體積10μL。在16℃連接過夜。

4.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定

用CaCl₂法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定。

5.重組質(zhì)粒上trpG基因的序列測定

對上述(步驟4)鑒定正確的陽性菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)，利用甘油管保存菌液，送去金唯智公司進(jìn)行測序。所得序列見發(fā)明內(nèi)容中描述的序列表<400>1。

6.TP607的trpG基因序列同源對比

用DNAMAN軟件對trpG基因測序結(jié)果與C.glutamicum 13032菌株的trpG基因序列(GenBank中編號Gene ID：1020973，見序列表<400>3)進(jìn)行比對，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)突變株氨基苯甲酸合酶小亞基編碼基因trpG的第70位堿基G突變?yōu)锳，對應(yīng)氨基酸殘基的變化是使得所編碼的氨基酸由丙氨酸變成蘇氨酸(A24S)；95位點G也突變?yōu)锳，對應(yīng)氨基酸殘基的變化是精氨酸變成組氨酸(R32H)。谷氨酸棒桿菌突變后的氨基酸序列與突變前的氨基酸序列分別見序列表<400>2和<400>4。

實施例3

突變株TP607在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行色氨酸發(fā)酵

1.菌種活化

斜面培養(yǎng)：取-80℃保藏菌種劃線接種于活化斜面，32℃培養(yǎng)12h，并傳代一次。

活化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl 2.5，玉米漿15mL/L，瓊脂25，pH 7.0-7.2，滅菌條件：121℃、20min。

2.種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：使用5L發(fā)酵罐培養(yǎng)種子，用無菌水沖洗二代斜面制備菌懸液，按10％接種到種子培養(yǎng)基中，終體積為2L。發(fā)酵溫度32℃、pH 7.0±0.2，相對溶氧控制在40±5％，培養(yǎng)12h，菌體OD₆₀₀達(dá)到15±2時，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖35，酵母粉5，玉米漿60mL/L，豆粕水解液20mL/L，KH₂PO₄1.5，MgSO₄ 0.5，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，VB₁ 0.001，pH7.0-7.2，滅菌條件：121℃、20min。

3.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)：采用分批流加補料工藝，5L發(fā)酵罐放液種子培養(yǎng)基1.4L，添加2.4L的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為20±2％。培養(yǎng)溫度為32±2℃，pH 7.0±0.2，相對溶氧控制在25±5％，發(fā)酵周期為36h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿25mL/L，豆粕水解液25mL/L，(NH₄)₂SO₄ 3，KH₂PO₄ 2.2，MgSO₄ 0.7，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂ O0.01，VB₁ 0.001，pH 7.0-7.2，滅菌條件：121℃，20min。

4.分析方法

(1)菌體濃度的測定：

發(fā)酵過程中每隔2h取樣，菌液稀釋到合適倍數(shù)，使用V1200紫外分光光度計，在600nm測定樣品的吸光度。發(fā)酵過程中菌體生長的OD₆₀₀曲線見圖3。

(2)色氨酸產(chǎn)量的測定：

發(fā)酵液中的色氨酸濃度采用HPLC測定。發(fā)酵6h開始每隔2h取樣，12000rpm離心，取上清液稀釋10倍，用0.22μm膜過濾后測定。所用儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀；色譜柱：ZORBAX Eclipse AAA(150×4.6mm，安捷倫)；流動相：流動相A(水)和流動相B(100％乙腈)配比為9：1；柱溫：33℃；流速1mL/min；檢測波長：278nm。

根據(jù)HPLC檢測結(jié)果計算發(fā)酵過程中不同時期的色氨酸積累量，繪制過程曲線見圖4。

圖5為發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中的色氨酸濃度HPLC檢測圖。由圖5可知，樣品中色氨酸出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品一致；根據(jù)0.5g/L色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積計算樣品中色氨酸濃度，乘以稀釋倍數(shù)10可得發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中色氨酸濃度達(dá)到2.9g/L。

上述參照具體實施方式對該一種谷氨酸棒桿菌突變株與應(yīng)用進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。