本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種馬乳酒樣乳桿菌菌株及其篩選培養(yǎng)基、篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人體腸道的正常微生物，如雙岐桿菌，乳酸桿菌等能合成多種人體生長發(fā)育必須的維生素，還能利用蛋白質(zhì)殘渣合成非必需氨基酸，并參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝，同時還能促進(jìn)鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收。這些營養(yǎng)物質(zhì)對人類的健康有著重要作用，一旦缺少會引起多種疾病。腸道菌群按一定的比例組合，各菌間互相制約，互相依存，在質(zhì)和量上形成一種生態(tài)平衡，一旦機(jī)體內(nèi)外環(huán)境發(fā)生變化，敏感腸菌被抑制，未被抑制的細(xì)菌而乘機(jī)繁殖，從而引起菌群失調(diào)，其正常生理組合被破壞，而產(chǎn)生病理性組合，引起臨床癥狀就稱為腸道菌群失調(diào)。目前，調(diào)節(jié)腸道菌群的方法有很多，例如，公開號為cn104623478的專利公開了采用中藥配伍制成的藥物，具體由芡實、白扁豆、山藥、益智仁、陳皮和木瓜組成按照一定劑量配比組成，具有較好的調(diào)節(jié)腸道菌群恢復(fù)正常的效果，但是療效較慢，難以短時間內(nèi)起效。公開號為cn104546914的專利公開了一種在短時間內(nèi)起效的藥物，主要成分為健康兒童大便和生理鹽水配置而成，該藥不僅具有恢復(fù)腸道正常菌群的功能，而且還能促進(jìn)消化吸收，還能抑制危害人體健康的致病菌，效果顯著，但是該藥用戶體驗不佳，來源有限等原因，嚴(yán)重影響了市場的認(rèn)可度。雖然腸道中含有大量益生菌，這些益生菌通過協(xié)同作用調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，降低有害菌的增長，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，提高機(jī)體的健康水平的功能。單一微生物調(diào)節(jié)腸道菌群的研究也有報道，例如，公開號為cn102994416的專利公開了一株地衣芽孢桿菌中的應(yīng)用，該菌具有耐酸、耐鹽、抑菌效果好降低腹瀉率的特點，但是該菌株的應(yīng)用針對犬類，并未公開對人體有效。另外，腸道中還含有多種致病微生物，如何從眾多微生物中篩選得到單一有益菌也是比較重要的研究方向。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種馬乳酒樣乳桿菌菌株及其應(yīng)用，使所述菌株具有促進(jìn)腸道有益菌的生長，抑制有害菌繁殖，從而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，保護(hù)腸道健康；同時所述菌株具有增強(qiáng)干酪拉絲效果。本發(fā)明的目的還在于提供一種馬乳酒樣乳桿菌菌株的篩選用培養(yǎng)基及所述菌株的篩選方法，具有準(zhǔn)確篩選的特點同時能顯著縮短篩選的周期。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒亞種菌株lactobacilluskefiranofacienssubsp.kefiranofaciens，保藏編號cgmccno.2809，菌株編號zw3。本發(fā)明提供了一種所述馬乳酒樣乳桿菌菌株的篩選用培養(yǎng)基，每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液包含以下質(zhì)量的組分，葡萄糖8～15g，乳糖8～14g，吐溫-801～7ml，32°～38°白酒8～65ml，酸性指示劑2～10ml，抗霉菌類抗生素1～2ng，瓊脂12～22g。優(yōu)選的，每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液包含以下質(zhì)量的組分，葡萄糖10～12g，乳糖10～12g，吐溫-802～5ml，32°～38°白酒10～60ml，酸性指示劑4～8ml，抗霉菌類抗生素1.2～1.8ng，瓊脂15～20g。本發(fā)明提供了一種分離所述馬乳酒樣乳桿菌菌株的篩選方法，包括以下步驟：1)取西藏開菲爾粒加入富集培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)，得到富集乳液；2)將所述步驟1)中得到的富集乳液接種到所述篩選培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)，得到菌落；3)從所述步驟2)中得到的菌落中篩選得到黃色菌落接種至所述篩選培養(yǎng)基中，得到初篩菌；4)從所述步驟3)中的初篩菌中挑選顏色為黃色或乳白色且質(zhì)地粘稠的菌落劃線接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，重復(fù)劃線接種培養(yǎng)步驟2～4次，得到純化馬乳酒樣乳桿菌菌株。優(yōu)選的，所述富集培養(yǎng)基為羊奶粉水溶液或鮮羊奶；所述羊奶粉水溶液的質(zhì)量濃度為10％～14％。優(yōu)選的，復(fù)篩培養(yǎng)基包括質(zhì)量濃度為15～25％的脫脂牛奶粉和質(zhì)量濃度為2～3.5％的瓊脂。優(yōu)選的，所述步驟1)或步驟4)中厭氧培養(yǎng)的時間為48～72h；所述步驟2)中厭氧培養(yǎng)的時間為72～120h。優(yōu)選的，所述步驟1)、步驟2)或步驟4)中厭氧培養(yǎng)的溫度為30～37℃。本發(fā)明還提供了所述菌株或所述方法篩選得到的菌株在制備功能性食品或預(yù)防或治療便秘和腹瀉及提高機(jī)體抵抗力的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述的菌株或所述方法篩選得到的菌株在在改善干酪品質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種所述馬乳酒樣乳桿菌菌株的篩選培養(yǎng)基，每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液包含以下質(zhì)量的組分，葡萄糖8～15g，乳糖8～14g，吐溫-801～7ml，32°～38°白酒8～65ml，酸性指示劑2～10ml，抗霉菌類抗生素1～2ng，瓊脂12～22g。本發(fā)明篩選用培養(yǎng)基中通過脫蛋白羊奶乳清提供菌體生長的氮源，葡萄糖、乳糖提供碳源，吐溫-80作為固溶劑，白酒作為有效殺菌劑，酸性指示劑提供顏色指示，抗霉菌類抗生素有效抑制霉菌的生長，省去了蛋白胨，牛肉膏，檸檬酸二銨、硫酸鎂等組分，節(jié)省了成本，簡化了工藝。本發(fā)明利用所述篩選培養(yǎng)基使馬乳酒樣乳桿菌菌株從眾多雜菌中篩選出來，所述篩選培養(yǎng)基較常規(guī)篩選培養(yǎng)基篩選馬乳酒樣乳桿菌菌株菌數(shù)提高了2～3倍，說明所述篩選培養(yǎng)基的篩選能力較強(qiáng)，并且所述菌株形成的菌落時間較常規(guī)篩選培養(yǎng)基縮短了8～10h。本發(fā)明提供了一種分離所述馬乳酒樣乳桿菌菌株的篩選方法，包括以下步驟：1)取西藏開菲爾粒加入富集培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)，得到富集乳液；2)將所述步驟1)中得到的富集乳液接種到所述的篩選培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)，得到菌落；3)從所述步驟2)中得到的菌落中篩選得到黃色菌落接種至所述篩選培養(yǎng)基中，得到初篩菌；4)從所述步驟3)中的初篩菌中挑選顏色為黃色或乳白色且質(zhì)地粘稠的菌落劃線接種到富篩培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，重復(fù)劃線接種培養(yǎng)步驟2～4次，得到純化馬乳酒樣乳桿菌菌株。本發(fā)明所述篩選方法，利用篩選培養(yǎng)基將馬乳酒樣乳桿菌菌株從眾多雜菌中篩選出來，篩選時間較常規(guī)方法縮短了8～10h，同時篩選步驟簡便，重復(fù)性好，菌體活力強(qiáng)適合后續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)和藥物的制備。本發(fā)明還提供了所述菌株或所述方法篩選得到的菌株在制備功能性食品或預(yù)防或治療便秘和腹瀉及提高機(jī)體抵抗力的藥物中應(yīng)用。將所述菌株用于便秘或腹瀉的小鼠中，經(jīng)過菌群結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃后的小鼠腸道中，產(chǎn)生丁酸的毛螺菌科和乳桿菌科明顯增多，而致病性理研菌科和紅球菌屬明顯減少，說明所述菌株可以有效促進(jìn)腸道有益菌的生長，抑制有害菌繁殖，從而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，保護(hù)腸道健康。同時菌株zw3還能有效的促進(jìn)巨噬細(xì)胞株raw264.7的增殖，加任何刺激物質(zhì)的空白組提高20％。本發(fā)明還提供了所述的菌株或所述方法篩選得到的菌株在在改善干酪品質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明利用菌株由于含有大量的開菲爾多糖和保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵，使其發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的彈性和拉絲效果，將所述菌株應(yīng)用到制備干酪中，與對照組相比，其實驗組的馬蘇里拉干酪(mozzarella)的拉絲效果是原來的1.5倍，大大提高了干酪的彈性和拉絲效果。附圖說明圖1為實施例1中馬乳酒樣乳桿菌zw3的個體形態(tài)(5000x)圖；圖2為實施例1中馬乳酒樣乳桿菌zw3的菌落形態(tài)；圖3為實施例7中馬乳酒樣乳桿菌zw3發(fā)酵培養(yǎng)基生長曲線及ph曲線；圖4為實施例7中馬乳酒樣乳桿菌zw3在發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)糖曲線；圖5為實施例8中馬乳酒樣乳桿菌zw3小鼠灌胃實驗設(shè)計圖；圖6為實施例8中馬乳酒樣乳桿菌zw3的腸道菌群變化圖；圖7為實施例9中干酪發(fā)酵對照組的mazirilla拉伸效果圖；圖8為實施例9中干酪發(fā)酵實驗組的mazirilla拉伸效果圖。生物保藏信息馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒亞種菌株lactobacilluskefiranofacienssubsp.kefiranofaciens，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物生物中心，地址為中國.北京.北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏機(jī)構(gòu)簡稱cgmcc，保藏日期為2008年12月18日，保藏編號cgmccno.2809，菌株編號zw3。具體實施方式本發(fā)明提供了一種馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒亞種菌株lactobacilluskefiranofacienssubsp.kefiranofaciens，保藏編號cgmccno.2809，菌株編號zw3。本發(fā)明提供了一種所述馬乳酒樣乳桿菌菌株的篩選培養(yǎng)基，每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液包含以下質(zhì)量的組分，葡萄糖8～15g，乳糖8～14g，吐溫-801～7ml，32°～38°白酒8～65ml，酸性指示劑2～10ml，抗霉菌類抗生素1～2ng，瓊脂12～22g。本發(fā)明提供的篩選培養(yǎng)基包括脫蛋白羊奶乳清溶液。所述脫蛋白羊奶乳清溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為10～14％，更優(yōu)選為12％。所述脫蛋白羊奶乳清溶液作為溶劑。所述脫蛋白羊奶乳清溶液的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的脫蛋白羊奶乳清溶液即可。本發(fā)明中，所述脫蛋白羊奶乳清溶液為提供菌體生長的氮源。本發(fā)明提供的篩選培養(yǎng)基包括葡萄糖。按照每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液計，所述葡萄糖的質(zhì)量為8～15g，更優(yōu)選為10～12g，最優(yōu)選為11g。所述葡萄糖的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的葡萄糖即可。本發(fā)明中，所述葡萄糖為提供菌體生長的碳源。本發(fā)明提供的篩選培養(yǎng)基包括乳糖。按照每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液計，所述乳糖的質(zhì)量為8～14g，更優(yōu)選為10～12g，最優(yōu)選為11g。所述乳糖的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的乳糖即可。本發(fā)明中，所述乳糖為提供菌體生長的碳源。本發(fā)明提供的篩選培養(yǎng)基包括吐溫-80。按照每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液計，所述吐溫-80的體積為1～7m，更優(yōu)選為2～5ml，最優(yōu)選為3ml。所述吐溫-80的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的吐溫-80即可。本發(fā)明中，所述吐溫-80為提供原料組分的固溶劑。本發(fā)明提供的篩選培養(yǎng)基包括32°～38°白酒。按照每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液計，所述白酒的體積為8～65ml，更優(yōu)選為10～60ml，最優(yōu)選為3g。所述白酒的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的白酒即可。本發(fā)明中，所述白酒作為抑菌劑使用。本發(fā)明提供的篩選培養(yǎng)基包括酸性指示劑。按照每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液計，所述酸性指示劑的體積為2～10ml，更優(yōu)選為4～8ml，最優(yōu)選為5ml。所述酸性指示劑的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的酸性指示劑即可。本發(fā)明中，所述酸性指示劑為產(chǎn)酸指示劑的作用。本發(fā)明中，所述酸性指示劑優(yōu)選為溴甲酚紫溶液或石蕊溶液。所述溴甲酚紫溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為1.5～2.0％，最優(yōu)選為1.6％。所述溴甲酚紫溶液的體積優(yōu)選為2～4ml，更優(yōu)選為3ml。所述石蕊溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為1.8～2.2％，更優(yōu)選為2％。所述石蕊溶液的體積優(yōu)選為7～12ml，更優(yōu)選為8～10ml，最優(yōu)選為9ml。本發(fā)明提供的篩選培養(yǎng)基包括抗霉菌類抗生素。按照每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液計，所述抗霉菌類抗生素的質(zhì)量濃度為1～2ng，更優(yōu)選為1.2～1.8ng，最優(yōu)選為1.5ng。所述抗霉菌類抗生素的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的抗霉菌類抗生素即可。本發(fā)明中，所述抗霉菌類抗生素為抗霉菌的作用。所述抗霉菌類抗生素優(yōu)選為制霉菌素。本發(fā)明提供的篩選培養(yǎng)基包括瓊脂。按照每1000ml的脫蛋白羊奶乳清溶液計，所述瓊脂的質(zhì)量為12～22g，更優(yōu)選15～20g，最優(yōu)選為18g。所述瓊脂的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的瓊脂即可。本發(fā)明中，所述瓊脂為凝固劑。本發(fā)明中，篩選培養(yǎng)基的ph值優(yōu)選為5.0～6.0，更優(yōu)選為5.5。本發(fā)明中，所述篩選培養(yǎng)基的配制方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的培養(yǎng)基的配制方法即可。本發(fā)明提供了一種分離所述馬乳酒樣乳桿菌菌株的篩選方法，包括以下步驟：1)取西藏開菲爾粒加入富集培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)，得到富集乳液；2)將所述步驟1)中得到的富集乳液接種到所述篩選培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)，得到菌落；3)從所述步驟2)中得到的菌落中篩選得到黃色菌落接種至所述篩選培養(yǎng)基中，得到初篩菌；4)從所述步驟3)中的初篩菌中挑選顏色為黃色或乳白色且質(zhì)地粘稠的菌落劃線接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，重復(fù)劃線接種培養(yǎng)步驟2～4次，得到純化馬乳酒樣乳桿菌菌株。本發(fā)明取西藏開菲爾粒加入富集培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)，得到富集乳液。本發(fā)明中，所述西藏開菲爾粒的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的西藏開菲爾粒即可。本發(fā)明實施例中，西藏開菲爾粒的來源為西藏傳統(tǒng)民間發(fā)酵乳。本發(fā)明中，所述西藏開菲爾粒的接種量優(yōu)選為1％～10％，更優(yōu)選為5％。本發(fā)明中，所述富集培養(yǎng)基優(yōu)選為羊奶粉水溶液或鮮羊奶，更優(yōu)選為鮮羊奶。所述羊奶粉水溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為10％～14％，更優(yōu)選為13％。所述鮮羊奶優(yōu)選采集1～5h的鮮羊奶。本發(fā)明中，所述厭氧培養(yǎng)的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的厭氧培養(yǎng)的方法即可。所述厭氧培養(yǎng)的時間優(yōu)選為48～72h，更優(yōu)選為54～65h，最優(yōu)選為60h。所述厭氧培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30～37℃，更優(yōu)選為35℃。本發(fā)明中，所述富集乳液的制備優(yōu)選反復(fù)傳代2～3次。得到富集乳液后，本發(fā)明將所述富集乳液接種到上述技術(shù)方案的篩選培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)，得到菌落。本發(fā)明中，所述厭氧培養(yǎng)的時間優(yōu)選為72～120h，更優(yōu)選為80～110h，更優(yōu)選為100h。本發(fā)明中，所述厭氧培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30～37℃，更優(yōu)選為35℃。本發(fā)明中，所述接種的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的接種方案即可。所述接種的接種量優(yōu)選為2～6％，更優(yōu)選為5％。得到菌落后，本發(fā)明從所述菌落中篩選得到黃色菌落接種至所述篩選培養(yǎng)基中，得到初篩菌。本發(fā)明中，所述篩選的方法優(yōu)選為挑取目的菌落接種至篩選培養(yǎng)基中。得到初篩菌后，本發(fā)明從所述初篩菌中挑選顏色為黃色或乳白色且質(zhì)地粘稠的菌落劃線接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，重復(fù)劃線接種培養(yǎng)步驟2～4次，得到純化馬乳酒樣乳桿菌菌株。本發(fā)明中，復(fù)篩培養(yǎng)基優(yōu)選包括質(zhì)量濃度為15～25％的脫脂牛奶粉和質(zhì)量濃度為2～3.5％的瓊脂。所述復(fù)篩培養(yǎng)基的ph值優(yōu)選為6.0～7.0，更優(yōu)選為6.5。本發(fā)明中，所述劃線接種的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的劃線接種方法即可。本發(fā)明中，所述厭氧培養(yǎng)的時間優(yōu)選為48～72h，更優(yōu)選為54～65h，最優(yōu)選為60h。本發(fā)明中，所述厭氧培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30～37℃，更優(yōu)選為35℃。本發(fā)明中，所述質(zhì)地粘稠的菌落表明菌體產(chǎn)多糖較高，視為候選菌落。本發(fā)明中，所述馬乳酒樣乳桿菌菌株優(yōu)選進(jìn)行驗證。所述驗證方法包括16srdna分子鑒定法、生化試驗和多糖含量測定法進(jìn)行。所述16srdna分子鑒定法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的16srdna分子鑒定法即可。所述多糖含量測定法優(yōu)選采用苯酚-硫酸法測定。所述生化試驗為革蘭氏染色法、觸酶試驗、形態(tài)學(xué)觀察和菌落質(zhì)地觀察等。所述形態(tài)學(xué)觀察是在顯微鏡下觀察單個菌為長桿狀。觸酶試驗為陰性。革蘭氏染色法為陽性。菌落質(zhì)地為粘稠狀態(tài)。本發(fā)明還提供了所述菌株或所述方法篩選得到的菌株在制備功能性食品或預(yù)防或治療便秘和腹瀉及提高機(jī)體抵抗力的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述的菌株或所述方法篩選得到的菌株在改善干酪品質(zhì)中的應(yīng)用。所述應(yīng)用優(yōu)選所述的菌株和保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種馬乳酒樣乳桿菌菌株及其篩選用培養(yǎng)基、篩選方法和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實施例1(1)富集培養(yǎng)：取數(shù)粒西藏開菲爾粒按照接種量為10％的量加入富集培養(yǎng)基(e)中，35℃厭氧培養(yǎng)60小時，反復(fù)傳代3次；富集培養(yǎng)基為14％的羊奶粉水溶液或鮮羊奶，115℃滅菌20min制備得到。(2)初篩與純化：取上述含有開菲爾粒的開菲爾乳液在無菌研缽中研碎均勻，將富集液體按照接種量為2％的量接種在篩選培養(yǎng)基(s1)的平板上梯度稀釋，在37℃厭氧箱中培養(yǎng)72小時，挑取典型黃色菌落至另一個初篩培養(yǎng)基(s1)的平板上，進(jìn)一步挑取黃色或乳白色及粘稠菌落的菌株劃線純化，反復(fù)至單一菌落。初篩培養(yǎng)基(s1)為：脫蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖10g，半乳糖12g，吐溫-801ml，32-38度白酒60ml(或0.5-1％95的酒精)，2ml1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液10ml，制霉菌素1ng，瓊脂20g。具體制備方法：將羊奶用乳酸將其ph調(diào)節(jié)到5.5，100℃加熱30mim，8000rpm離心20min，棄沉淀后上清液備用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分鐘滅菌，瓊脂采用121℃滅菌30min。其中脫蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐溫-80ml采用115℃滅菌20min；白酒、制霉菌素分別用用0.25um的微濾膜過濾除菌，按比例將上述備用成分在60-70℃條件下無菌混勻，倒平板。(3)菌株純化：將初篩出來的菌株于復(fù)篩培養(yǎng)基s2平板上劃線，置于30～37℃厭氧箱中繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次在顯微鏡下觀察形態(tài)單一的長桿狀菌體，則認(rèn)為已純化。復(fù)篩培養(yǎng)基為：20％的脫脂牛奶粉，與等體積的3％的瓊脂混合，115℃滅菌20min，混合均勻，倒平板。(4)將純化后的單菌落，如果革蘭氏染色法為陽性，觸酶試驗為陰性，顯微鏡下觀察為長桿狀(見圖1)，菌落粘稠(圖2)，為疑似馬乳酒樣乳桿菌，編號為zw3。實施例2(1)富集培養(yǎng)：取數(shù)粒西藏開菲爾粒按照接種量為8％的量加入富集培養(yǎng)基(e)中，30℃厭氧培養(yǎng)48小時，反復(fù)傳代2次；富集培養(yǎng)基為12％的羊奶粉水溶液或鮮羊奶，115℃滅菌20min制備得到。(2)初篩與純化：取上述含有開菲爾粒的開菲爾乳液10～50g，無菌研缽中研碎均勻，將富集液體按照接種量為2％的量接種在篩選培養(yǎng)基(s1)的平板上梯度稀釋，在30℃厭氧箱中培養(yǎng)120小時，挑取典型黃色菌落至另一個初篩培養(yǎng)基(s1)的平板上，進(jìn)一步挑取黃色或乳白色及粘稠菌落的菌株劃線純化，反復(fù)至單一菌落。初篩培養(yǎng)基(s1)為：脫蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖12g，半乳糖10g，吐溫-805ml，32度白酒10ml(或0.5-1％95的酒精)，2ml1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液10ml，制霉菌素2ng，瓊脂15g。具體制備方法：將羊奶用乳酸將其ph調(diào)節(jié)到5.5，100℃加熱30mim，8000rpm離心20min，棄沉淀后上清液備用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分鐘滅菌，瓊脂采用121℃滅菌30min。其中脫蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐溫-80ml采用115℃滅菌20min；白酒、制霉菌素分別用用0.25um的微濾膜過濾除菌，按比例將上述備用成分在60-70℃條件下無菌混勻，倒平板。(3)菌株純化：將初篩出來的菌株于復(fù)篩培養(yǎng)基s2平板上劃線，置于30～37℃厭氧箱中繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次在顯微鏡下觀察形態(tài)單一的長桿狀菌體，則認(rèn)為已純化。復(fù)篩培養(yǎng)基為：20％的脫脂牛奶粉，與等體積的3％的瓊脂混合，115℃滅菌20min，混合均勻，倒平板。(4)將純化后的單菌落，如果革蘭氏染色法為陽性，觸酶試驗為陰性，顯微鏡下觀察為長桿狀，菌落粘稠，為疑似馬乳酒樣乳桿菌。實施例3(1)富集培養(yǎng)：取數(shù)粒西藏開菲爾粒按照接種量為5％的量加入富集培養(yǎng)基(e)中，30℃厭氧培養(yǎng)72小時，反復(fù)傳代2次；富集培養(yǎng)基為10％的羊奶粉水溶液或鮮羊奶，115℃滅菌20min制備得到。(2)初篩與純化：取上述含有開菲爾粒的開菲爾乳液10～50g，無菌研缽中研碎均勻，將富集液體按照接種量為3％的量接種在篩選培養(yǎng)基(s1)的平板上梯度稀釋，在35℃厭氧箱中培養(yǎng)90小時，挑取典型黃色菌落至另一個初篩培養(yǎng)基(s1)的平板上，進(jìn)一步挑取黃色或乳白色及粘稠菌落的菌株劃線純化，反復(fù)至單一菌落。初篩培養(yǎng)基(s1)為：脫蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖11g，乳糖11g，吐溫-803ml，38度白酒40ml(或0.5-1％95的酒精)，3ml1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液9ml，制霉菌素1.5ng，瓊脂18g。具體制備方法：將羊奶用乳酸將其ph調(diào)節(jié)到5.5，100℃加熱30mim，8000rpm離心20min，棄沉淀后上清液備用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分鐘滅菌，瓊脂采用121℃滅菌30min。其中脫蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐溫-80ml采用115℃滅菌20min；白酒、制霉菌素分別用用0.25um的微濾膜過濾除菌，按比例將上述備用成分在60-70℃條件下無菌混勻，倒平板。(3)菌株純化：將初篩出來的菌株于復(fù)篩培養(yǎng)基s2平板上劃線，置于30～37℃厭氧箱中繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次在顯微鏡下觀察形態(tài)單一的長桿狀菌體，則認(rèn)為已純化。復(fù)篩培養(yǎng)基為：20％的脫脂牛奶粉，與等體積的3％的瓊脂混合，115℃滅菌20min，混合均勻，倒平板。(4)將純化后的單菌落，如果革蘭氏染色法為陽性，觸酶試驗為陰性，顯微鏡下觀察為長桿狀，菌落粘稠，為疑似馬乳酒樣乳桿菌。實施例4(1)富集培養(yǎng)：取數(shù)粒西藏開菲爾粒按照接種量為5％的量加入富集培養(yǎng)基(e)中，36℃厭氧培養(yǎng)54小時，反復(fù)傳代2～3次；富集培養(yǎng)基為12％的羊奶粉水溶液或鮮羊奶，115℃滅菌20min制備得到。(2)初篩與純化：取上述含有開菲爾粒的開菲爾乳液10～50g，無菌研缽中研碎均勻，將富集液體按照接種量為4％的量接種在篩選培養(yǎng)基(s1)的平板上梯度稀釋，在32℃厭氧箱中培養(yǎng)100小時，挑取典型黃色菌落至另一個初篩培養(yǎng)基(s1)的平板上，進(jìn)一步挑取黃色或乳白色及粘稠菌落的菌株劃線純化，反復(fù)至單一菌落。初篩培養(yǎng)基(s1)為：脫蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖8g，乳糖14g，吐溫-801ml，38度白酒65ml(或0.5-1％95的酒精)，4ml1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液10ml，制霉菌素1.8ng，瓊脂12g。具體制備方法：將羊奶用乳酸將其ph調(diào)節(jié)到5.5，100℃加熱30mim，8000rpm離心20min，棄沉淀后上清液備用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分鐘滅菌，瓊脂采用121℃滅菌30min。其中脫蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐溫-80ml采用115℃滅菌20min；白酒、制霉菌素分別用用0.25um的微濾膜過濾除菌，按比例將上述備用成分在60-70℃條件下無菌混勻，倒平板。(3)菌株純化：將初篩出來的菌株于復(fù)篩培養(yǎng)基s2平板上劃線，置于30～37℃厭氧箱中繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次在顯微鏡下觀察形態(tài)單一的長桿狀菌體，則認(rèn)為已純化。復(fù)篩培養(yǎng)基為：20％的脫脂牛奶粉，與等體積的3％的瓊脂混合，115℃滅菌20min，混合均勻，倒平板。(4)將純化后的單菌落，如果革蘭氏染色法為陽性，觸酶試驗為陰性，顯微鏡下觀察為長桿狀，菌落粘稠，為疑似馬乳酒樣乳桿菌。實施例5(1)富集培養(yǎng)：取數(shù)粒西藏開菲爾粒按照接種量為2％的量加入富集培養(yǎng)基(e)中，32℃厭氧培養(yǎng)65小時，反復(fù)傳代2次；富集培養(yǎng)基為13％的羊奶粉水溶液或鮮羊奶，115℃滅菌20min制備得到。(2)初篩與純化：取上述含有開菲爾粒的開菲爾乳液10～50g，無菌研缽中研碎均勻，將富集液體按照接種量為5％的量接種在篩選培養(yǎng)基(s1)的平板上梯度稀釋，在36℃厭氧箱中培養(yǎng)80小時，挑取典型黃色菌落至另一個初篩培養(yǎng)基(s1)的平板上，進(jìn)一步挑取黃色或乳白色及粘稠菌落的菌株劃線純化，反復(fù)至單一菌落。初篩培養(yǎng)基(s1)為：脫蛋白羊奶乳清溶液1000ml，葡萄糖15g，乳糖8g，吐溫-807ml，32-38度白酒8ml(或0.5-1％95的酒精)，2ml1.6％溴甲酚紫溶液或2％的石蕊溶液10ml，制霉菌素1.2ng，瓊脂22g。具體制備方法：將羊奶用乳酸將其ph調(diào)節(jié)到5.5，100℃加熱30mim，8000rpm離心20min，棄沉淀后上清液備用。溴甲酚紫或石蕊溶液采用8磅15分鐘滅菌，瓊脂采用121℃滅菌30min。其中脫蛋白羊奶乳清溶液、葡萄糖、半乳糖、吐溫-80ml采用115℃滅菌20min；白酒、制霉菌素分別用用0.25um的微濾膜過濾除菌，按比例將上述備用成分在60-70℃條件下無菌混勻，倒平板。(3)菌株純化：將初篩出來的菌株于復(fù)篩培養(yǎng)基s2平板上劃線，置于30～37℃厭氧箱中繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次在顯微鏡下觀察形態(tài)單一的長桿狀菌體，則認(rèn)為已純化。復(fù)篩培養(yǎng)基為：20％的脫脂牛奶粉，與等體積的3％的瓊脂混合，115℃滅菌20min，混合均勻，倒平板。(4)將純化后的單菌落，如果革蘭氏染色法為陽性，觸酶試驗為陰性，顯微鏡下觀察為長桿狀，菌落粘稠，為疑似馬乳酒樣乳桿菌。實施例6將實施例1～5篩選得到的疑似馬乳酒樣乳桿菌利用16srdna分子鑒定法進(jìn)行菌種分類學(xué)鑒定，具體步驟如下：細(xì)菌全基因組dna提取方法采用康為世紀(jì)細(xì)菌全基因組提取試劑盒,按照說明書步驟操作。分離菌株細(xì)菌16srrna鑒定pcr擴(kuò)增采用通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增：通用引物核苷酸序列如下：正向引物為27f：gagtttgatcctggctcag(seqidno.1)；反向引物為1492r:taccgcggctgctggcac(seqidno.2)。以提取的細(xì)菌全基因組為模板，以細(xì)菌16srrna序列通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr引物合成及序列測定均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。反應(yīng)體系為：dna模板1.0μl2×taqpcrmix25.0μl正向引物(10μμ)1.0μl反向引物(10μμ)1.0μlddh2o22.0μl總體系50.0μlpcr反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性8min；95℃變性45s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳分析。序列測序完成后，得到實施例1～5的菌株序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)5段dna片段序列一致性達(dá)到100％(核苷酸序列見seqidno.3)，這說明實施例1～5篩選的菌株為同一種菌。將測序得到的dna片段利用ncbi數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性比對，得到序列相似度為100％。實施例7將實施例1篩選得到菌種進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量，具體步驟如下：將實施例1純化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基(s3)中，容量為250ml的三角瓶中裝有25～30ml的種子培養(yǎng)基，在溫度35℃下，厭氧培養(yǎng)60小時，然后再以5％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為：500ml三角瓶中裝含有250ml培養(yǎng)基，在溫度為37℃下，厭氧培養(yǎng)72小時，每隔8小時測定發(fā)酵液的多糖含量、菌體數(shù)量和ph值變化情況。將發(fā)酵液8000r/min離心10min，上清液。用苯酚-硫酸法測定多糖含量，具體是取三支試管，分別吸取200μl濃度為1mg/ml的多糖溶液至三支試管內(nèi)，三支試管依次加入200μl蒸餾水，6％的苯酚溶液，1ml濃硫酸，室溫靜置10min，搖勻后再室溫靜置20min，酶標(biāo)儀在490nm處測定其吸光度值。發(fā)酵過程中菌體含量和ph值變化情況如圖3所示。由圖3可以看出，從發(fā)酵24h開始菌體進(jìn)入對數(shù)期，發(fā)酵48h時菌體生長進(jìn)入平穩(wěn)期。ph值的變化情況，從發(fā)酵開始到發(fā)酵40h內(nèi)，發(fā)酵液的ph值迅速下降，說明這階段是菌體大量產(chǎn)酸的過程。發(fā)酵過程中多糖含量變化情況如圖4所示。由圖4可以看出，從發(fā)酵16h到48h內(nèi)，多糖含量迅速升高，到56h時多糖含量達(dá)到最高值，為2300mg/l，這說明本發(fā)明篩選得到的菌株具有產(chǎn)多糖含量的特點。實施例8馬乳酒樣乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的測定(1)實驗選取spf級balb/c雄性小鼠，體重(33±3.1)g，小鼠飼養(yǎng)于相對濕度55±5％，溫度25℃，12h晝夜光照交替，試驗期間小鼠自由攝水和飲食。所有試驗均按照《實驗動物管理與使用指南》進(jìn)行操作。在實驗前進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)4周，所有實驗小鼠保證健康狀態(tài)。(2)選用12周齡的成年小鼠作為研究對象，所有小鼠均身體健康，正常攝食，皮毛光滑，適應(yīng)4周后，為了研究zw3對于小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，三只小鼠連續(xù)灌胃0.4mlzw3菌懸液(108cfu/ml)14天，并且在第0天、第7天、第14天和第21天采用腹部按摩法收集小鼠0.5-0.8g糞便，進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌胃后的小鼠腸道中，產(chǎn)生丁酸的毛螺菌科和乳桿菌科明顯增多，而致病性理研菌科和紅球菌屬明顯減少，說明zw3菌株可以一定程度上促進(jìn)腸道有益菌的生長，抑制有害菌繁殖，從而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，保護(hù)腸道健康。實施例9馬乳酒樣乳桿菌具有提升馬蘇里拉干酪(mozzarella)干酪拉伸性的測定(1)本研究以一株胞外多糖生產(chǎn)菌株一種馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒亞種菌株lactobacilluskefiranofacienssubsp.kefiranofacienszw3作為輔助發(fā)酵劑，和保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌共同用于馬蘇里拉奶酪的制備。(2)干酪的制作流程為：鮮奶→巴氏殺菌(63.5℃30min)→冷卻(32℃)→添加發(fā)酵劑(2％)→加入凝乳劑→攪拌和加溫→乳清排放→加鹽(2％)→成型壓榨→成熟和貯存。馬蘇里拉干酪(mozzarella)的制作參考scott,r(1981)所描述的方法。新鮮牛奶72℃巴氏殺菌15秒，之后冷卻至30℃。隨后進(jìn)行接種發(fā)酵。發(fā)酵至ph為5.4后，將牛奶溫度降低至10℃，隨后添加凝乳酶(添加單位不同，凝乳時間不同)。將溫度升至30℃后，進(jìn)行切割，將凝固的牛奶切割至小的立方體。30℃條件下保持20-25分鐘后，在45℃進(jìn)行熱處理45min。隨后讓乳清盡量析出，酪蛋白形成圓形的小球，待乳清析出完畢之后，放于磨具中成型。將干酪保存在4℃。(3)為了比較zw3對干酪品質(zhì)的改善作用，本研究設(shè)計了實驗組和對照組，其中發(fā)酵劑分別為實驗組(zw3、德式乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌)和對照組(德式乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌)，研究結(jié)果表明含有zw3的實驗組制得的馬蘇里拉奶酪樣品拉伸長度可超過60cm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組，熟化4周之后奶酪的拉伸性能也有一定程度的提高，含有zw3實驗組組的奶酪拉伸長度增加至112～120cm，對照組為70～74cm，因此添加產(chǎn)eps的zw3菌株可以增加馬蘇里拉干酪的拉伸性能。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>諾佰克（武漢）生物科技有限公司<120>一種調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的菌株及其篩選培養(yǎng)基、篩選方法和應(yīng)用<130>2017<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1gagtttgatcctggctcag19<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2taccgcggctgctggcac18<210>3<211>1574<212>dna<213>人工序列<400>3ttcaaaatgagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgc60aagtcgagcgagcggaaccagcagaatcacttcggtgaggacgctgggaaagcgagcggc120ggatgggtgagtaacacgtggggaacctgcccttaagtctgggataccacttggaaacag180gtgctaataccggataagaaagcagttcgcatgaacagcttttaaaaggcggcgcaagct240gtcgctaaaggatggacccgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggcctaccaagg300cagtgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggccca360aactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagca420acgccgcgtgagtgaagaaggttttcggaccgtaaagctctgttgttggtgaagaaggat480agaggtagtaactggcctttatttgacggtaatcaaccagaaagtcacggctaactacgt540gccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagc600gagcgcaggcggaagaataagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaattgcat660cggaaactgtttttcttgagtgcagaagaggagagtagaactccatgtgtagcggtggaa720tgcgtagatatatggaagaataccagtggcgaaggcggctctctggtctgcaactgacgc780tgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaa840cgatgagtgctaagtgttgggaggcttccgcctctcagtgctgcagctaacgcattaagc900actccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgca960caagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgac1020atctagtgccatttgtagagatacaaagttcccttcggggacgctaagacaggtggtgca1080tggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccct1140tgttattagttgccagcattaagttgggcactctaatgagactgccggtgacaaaccgga1200ggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgcta1260caatgggcagcacaacgagcagcgagcctgcaaaggcaagcaaatctctgaaagctgttc1320tcagttcggactgcagtctgcaactcgactgcacgaagctggaatcgctagtaatcgcgg1380atcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgg1440gagtctgcaatgcccaaagccggtggcctaaccgcaaggaaggagccgtctaaggcaggg1500cagatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggagaacctgcggctggatcacc1560tcctttctaaggaa1574當(dāng)前第1頁12