本發(fā)明屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大分子溫敏驅(qū)動器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞膜受體蛋白能識別、結(jié)合專一的生物活性配體生成復(fù)合物，從而激活和啟動一系列物理化學(xué)變化，進(jìn)而導(dǎo)致該物質(zhì)的最終生物效應(yīng)。這些生物效應(yīng)包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等等。現(xiàn)有調(diào)控膜受體蛋白寡聚化的方法主要有三種：1)利用生物活性配體；2)光遺傳學(xué)；3)磁調(diào)控。但每種方法都有各自的弊端。生物活性配體無法實(shí)現(xiàn)對受體蛋白在時間空間上的操控。光遺傳學(xué)依賴于轉(zhuǎn)基因技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染光敏感的蛋白，過程復(fù)雜，且應(yīng)用局限，無法實(shí)現(xiàn)對運(yùn)動能力差的受體蛋白調(diào)控。磁調(diào)控方法雖然可以實(shí)現(xiàn)對受體蛋白在時間空間上的主動調(diào)控，但是該方法依賴于復(fù)雜的儀器加工設(shè)計。

cn106397577a公開了一種雙重刺激響應(yīng)性膠原蛋白多肽聚合物，所述聚合物以膠原蛋白多肽為主鏈，其側(cè)鏈上的氨基通過動態(tài)鍵聯(lián)反應(yīng)接枝烷氧醚樹枝化基元側(cè)鏈，使得制備得到的膠原蛋白多肽聚合物具有溫度和ph雙重響應(yīng)，然而該材料并非是基于細(xì)胞膜表面的溫度和ph響應(yīng)，不能直接用于細(xì)胞水平的調(diào)控。

因此，在本領(lǐng)域，期望得到一種具有膜受體蛋白寡聚化調(diào)控的溫敏材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種大分子溫敏驅(qū)動器及其制備方法和應(yīng)用。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種大分子溫敏驅(qū)動器，所述大分子溫敏驅(qū)動器包括由多肽配體構(gòu)成的靶向模塊、由溫敏聚合物構(gòu)成的驅(qū)動模塊和由光熱轉(zhuǎn)換分子構(gòu)成的觸發(fā)模塊，所述觸發(fā)模塊連接在靶向模塊上，所述靶向模塊與驅(qū)動模塊連接。

在本發(fā)明中，所述大分子溫敏驅(qū)動器也可以稱為大分子溫敏材料。

本發(fā)明的溫敏驅(qū)動器利用溫度響應(yīng)性聚合物材料在特定溫度上下發(fā)生相變，從舒展態(tài)轉(zhuǎn)變成塌縮的聚集態(tài)，產(chǎn)生機(jī)械拉動力。其在物理器件構(gòu)建以及生物遞藥中有很重要的應(yīng)用。

本發(fā)明通過共價鍵將多肽配體與溫敏聚合物進(jìn)行連接，并在分子中連接具有光熱轉(zhuǎn)換性質(zhì)的分子作為熱源，得到大分子的溫敏驅(qū)動器材料，該驅(qū)動器可以通過多肽配體靶向到細(xì)胞膜蛋白，在細(xì)胞膜表面通過局部升溫激活驅(qū)動器使其塌縮聚集產(chǎn)生拉拽力，利用其相變產(chǎn)生的拉拽力對細(xì)胞膜表面的受體蛋白寡聚化進(jìn)行簡單、主動而精準(zhǔn)的操控。該溫敏驅(qū)動器體系，為信號通路研究提供了新材料，為免疫細(xì)胞激活及腫瘤治療等提供新的有效策略。

優(yōu)選地，所述多肽配體為能夠與細(xì)胞膜表面受體蛋白結(jié)合的任意氨基酸序列多肽中的任意一種或至少兩種的組合；

優(yōu)選地，所述多肽配體的氨基酸序列為msrtms、gyhwygytpqnvi、rgd或cnscwskd，進(jìn)一步優(yōu)選msrtms。

在本發(fā)明中，所述多肽配體為具有特定的氨基酸序列的多肽，其對應(yīng)的特定的識別蛋白，例如msrtms對應(yīng)的識別蛋白為her2(人類表皮生長因子受體-2)蛋白，gyhwygytpqnvi對應(yīng)的識別蛋白為her1(人類表皮生長因子受體-1)蛋白，rgd對應(yīng)的識別蛋白為整合素αvβ3，cnscwskd對應(yīng)的識別蛋白為dr4/5(死亡受體4或5)。

優(yōu)選地，所述溫敏聚合物為聚n-異丙基丙烯酰胺、聚n,n-二乙基丙烯酰胺、聚n-羥甲基丙基甲基丙烯酰胺、聚n-2,2-二甲基1,3-二氧戊環(huán)甲基丙烯酰胺、聚n-2-甲氧基1,3-二氧乙環(huán)甲基丙烯酰胺、聚n-2-乙氧基1,3-二氧乙環(huán)甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯、聚n-乙烯基異丁酰胺、聚甲基乙烯基醚、聚n-乙烯基己內(nèi)酰胺或聚2-乙基噁唑啉中的任意一種或至少兩種的組合物。

優(yōu)選地，所述溫敏聚合物為n-異丙基丙烯酰胺和n-2羥異丙基丙烯酰胺的共聚物、n-異丙基丙烯酰胺和n-羥乙基丙烯酰胺的共聚物或者n-異丙基丙烯酰胺和丙烯酸的共聚物中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選n-異丙基丙烯酰胺和/或n-2羥異丙基丙烯酰胺的共聚物。

優(yōu)選地，所述溫敏聚合物為共聚物時，其合成方法為活性/可控自由基聚合，優(yōu)選raft聚合(可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合)。

優(yōu)選地，所述raft聚合的鏈轉(zhuǎn)移試劑為n,n'-二甲基n,n'-二(4-吡啶基)秋蘭姆二硫化物、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸、雙(十二烷基硫烷基硫代羰基)二硫化物、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯、氰甲基甲基(苯基)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-丙酸甲基(4-吡啶)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-(十二烷基三硫代碳酸酯)-2-甲基丙酸酯或2-苯基-2-丙基苯并二硫中的任意一種或至少兩種的組合，進(jìn)一步優(yōu)選2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯。

優(yōu)選地，所述溫敏聚合物為具有如式i所示結(jié)構(gòu)的聚合物：

其中x＝200-1200(例如200、230、250、280、300、350、380、400、440、480、500、530、550、580、600、620、650、680、700、750、780、810、850、880、900、1000、1100或1200)，y＝1-60(例如1、3、5、8、10、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60)，且x/y＝19-280(例如19、20、23、25、28、30、35、40、50、60、80、100、130、150、180、200、230、250或280)，例如x＝1168,y＝60或x＝1127,y＝40或x＝1158,y＝14或x＝1447,y＝9或x＝624,y＝34或x＝596,y＝18或x＝642,y＝7或x＝698,y＝4或x＝258,y＝14或x＝252,y＝11或x＝251,y＝3或x＝280,y＝1，優(yōu)選x＝642，y＝7；

優(yōu)選地，所述溫敏聚合物的分子量為20-80kd，例如20kd、25kd、30kd、35kd、40kd、45kd、50kd、55kd、60kd、65kd、70kd、75kd或80kd，優(yōu)選40kd。當(dāng)溫敏聚合物的分子量小于20kd時，會使得本發(fā)明所述的大分子溫敏驅(qū)動器(或稱為大分子溫敏驅(qū)動器)的響應(yīng)性變差，并且分子量太小或太大，均會使得材料對細(xì)胞的毒性增大。

優(yōu)選地，所述多肽配體作為側(cè)鏈接枝在溫敏聚合物骨架上。在溫敏聚合物骨架上可以接枝多個多肽配體。

優(yōu)選地，所述接枝通過邁克爾加成法實(shí)現(xiàn)，即通過溫敏聚合物中的雙鍵與多肽配體中巰基進(jìn)行邁克爾加成，從而實(shí)現(xiàn)將多肽配體序列接枝在溫敏聚合物的骨架上。

優(yōu)選地，所述多肽配體連接比例為0.5-5％，例如0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.2％、4.5％、4.8％或5％，優(yōu)選1％。在本發(fā)明中，所述多肽配體連接比例指的是多肽配體連接在溫敏聚合物骨架上的量，具體的是：多肽配體與構(gòu)成溫敏聚合物的單體或單體混合物(當(dāng)聚合物由兩種以上單體聚合得到時，單體混合物指兩種以上單體的總和)的摩爾百分比。

在本發(fā)明中將聚合物骨架鏈長及多肽配體連接比例控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)可以有利于調(diào)節(jié)本發(fā)明所述大分子溫敏驅(qū)動器的響應(yīng)溫度區(qū)間和響應(yīng)靈敏度。

優(yōu)選地，所述光熱轉(zhuǎn)換分子為紫紅素-18(purpurin-18)、焦脫鎂葉綠素、cy5、cy6或cy7中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選紫紅素-18。

在本發(fā)明中，光熱轉(zhuǎn)換分子的作用是作為分子熱源給溫敏聚合物提供熱量促使其從親水性的舒展?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷乃s狀態(tài)。分子熱源的優(yōu)勢在于可以局部給熱、可控性高，對于生物應(yīng)用有利。

優(yōu)選地，所述光熱轉(zhuǎn)換分子通過酰胺鍵連接在多肽配體上。

另一方面，本發(fā)明提供如上所述的大分子溫敏驅(qū)動器的制備方法，所述制備方法為：通過多肽固相合成法合成多肽配體序列，在多肽序列上連接上光熱轉(zhuǎn)換分子，并通過邁克爾加成將連接有光熱轉(zhuǎn)換分子的多肽配體序列接枝在溫敏聚合物的骨架上得到所述的大分子溫敏驅(qū)動器。

在本發(fā)明中，所述固相合成法以及在多肽序列上連接上光熱轉(zhuǎn)換分子以及邁克爾加成等均可以采用本領(lǐng)域已知的方法來實(shí)現(xiàn)，在此處不再做具體的敘述。

另一方面，本發(fā)明提供一種調(diào)控膜受體蛋白聚集的材料，所述材料包括如上所述的大分子溫敏驅(qū)動器。

本發(fā)明所述的大分子溫敏驅(qū)動器可以有效通過分子識別的主動靶向方式特異性的與膜蛋白結(jié)合，溫敏聚合物骨架在給溫度的情況下驅(qū)動膜蛋白寡聚化，寡聚化的膜蛋白影響了下游信號通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物功能，從而實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞水平的免疫細(xì)胞激活及腫瘤治療等。

另一方面，本發(fā)明提供一種藥物遞送材料，所述藥物遞送材料包括如上所述的大分子溫敏驅(qū)動器。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的大分子溫敏驅(qū)動器利用溫度響應(yīng)性聚合物-多肽雜化材料構(gòu)筑，該驅(qū)動器可以通過多肽配體靶向到細(xì)胞膜蛋白，有效通過分子識別的主動靶向方式特異性的與膜蛋白結(jié)合，在細(xì)胞膜表面通過局部升溫激活驅(qū)動器使其塌縮聚集產(chǎn)生拉拽力，實(shí)現(xiàn)不同膜受體蛋白的組裝調(diào)控，為信號通路研究、免疫細(xì)胞激活及腫瘤治療等提供新的有效策略。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的大分子溫敏驅(qū)動器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為實(shí)施例1制備的連接有紫紅素-18的多肽配體ck(p18)ggmsrtms的maldi-tof譜圖；

圖3為實(shí)施例1制備的大分子溫敏驅(qū)動器的核磁氫譜圖；

圖4為實(shí)施例2制備的連接有紫紅素-18的多肽配體ck(p18)gyhwygytpqnvi的maldi-tof譜圖；

圖5為實(shí)施例2制備的大分子溫敏驅(qū)動器的核磁氫譜圖；

圖6為利用實(shí)施例1中制備的大分子溫敏驅(qū)動器在細(xì)胞膜表面調(diào)控膜受體蛋白寡聚化的示意圖；

圖7為實(shí)施例1制備得到的大分子溫敏驅(qū)動器在細(xì)胞膜表面的熒光共聚焦顯微鏡圖，其中a圖為無激光照射時的熒光共聚焦顯微鏡圖，b圖為有激光照射時的熒光共聚焦顯微鏡圖，其標(biāo)尺均為10μm；

圖8為實(shí)施例1制備得到的大分子溫敏驅(qū)動器在細(xì)胞膜表面的掃描電鏡圖，其中a圖為無激光照射時的掃描電鏡圖，b圖為有無激光照射時的掃描電鏡圖，其標(biāo)尺均為2μm；

圖9是用熒光共聚焦顯微鏡的fret通道觀測到的實(shí)施例1制備得到的大分子溫敏驅(qū)動器在細(xì)胞表面聚集的發(fā)生熒光共振轉(zhuǎn)移的情況圖；

圖10是實(shí)施例1制備得到的大分子溫敏驅(qū)動器對skbr3細(xì)胞增殖的抑制情況曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中制備的大分子溫敏驅(qū)動器的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，其包括由多肽配體構(gòu)成的靶向模塊、由溫敏聚合物構(gòu)成的驅(qū)動模塊和由光熱轉(zhuǎn)換分子構(gòu)成的觸發(fā)模塊，所述觸發(fā)模塊連接在靶向模塊上，所述靶向模塊與驅(qū)動模塊連接。其中光熱轉(zhuǎn)換分子為紫紅素-18，多肽配體為ckggmsrtms(為了接紫紅素-18，添加了氨基酸k；為了將多肽與聚合物相連，添加了氨基酸c。gg是柔性間隔)，連接有紫紅素-18的多肽配體ck(p18)ggmsrtms的分子結(jié)構(gòu)如下所示：

在本實(shí)施例中，大分子溫敏驅(qū)動器的合成方法如下：

1)多肽配體的合成：

合成選用0.35mm負(fù)載量的wang樹脂，其中第一個氨基酸(絲氨酸)的n端被fmoc保護(hù)，c端固定于樹脂上。用20％(v/v)的六氫吡啶的dmf溶液脫去n端的fmoc保護(hù)，然后用茚三酮測試法檢測脫保護(hù)結(jié)果。然后將下一個氨基酸的羧基用0.4m的n-甲基嗎啉(nmm)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)的dmf溶液活化，并加入到脫去保護(hù)的樹脂中反應(yīng)1小時。按此方法，將剩余的所有氨基酸都通過縮合反應(yīng)連接上去，形成固定于樹脂的連接多肽，其中賴氨酸使用的是fmoc-lys(dde)-oh。

2)紫紅素-18連接多肽的合成：

在步驟1)完成所有氨基酸的合成后，用2％的水合肼脫除賴氨酸側(cè)鏈的dde，然后將活化好的紫紅素-18分子重復(fù)上述步驟偶聯(lián)在賴氨酸的n端；然后用含有2.5％水和2.5％三異丙基硅烷的三氟乙酸溶液將合成好的多肽從樹脂上脫除，同時脫除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)；將三氟乙酸用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除，然后多肽的粗產(chǎn)物用無水乙醚沉淀，洗滌并干燥；最后選用反相制備液相色譜，將多肽純化。

純化過程的條件為：流動相是含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的雙蒸水；參數(shù)是梯度洗脫從5％乙腈/95％水到60％乙腈/40％水，流速為10ml/min，處理時間為30min。上述方法所得到的紫紅素-18連接多肽的maldi-tof圖譜如圖2所示，由圖可知，連接有紫紅素-18的多肽配體的分子量為1604.8。

3)溫敏聚合物骨架的合成：

將n-異丙基丙烯酰胺及n-2羥異丙基丙烯酰胺按不同摩爾比(99：1)加入到史萊克瓶中，然后加入2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯及偶氮二異丁腈，以n,n’-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，濃度為1.5g/ml，攪拌溶解后，密封體系，通入氮?dú)?0分鐘，恒溫70℃反應(yīng)10小時；將反應(yīng)后的溶液加入透析袋中，透析3天，冷凍干燥得到淡黃色粉末狀固體。

將還有14mmol量的上述聚合物與0.35g的4,4'-亞甲基雙(2,6-二叔丁基苯酚)加入到反應(yīng)容器中，并用35ml無水dmf溶解。將30mmol的丙烯酸異丙腈乙酯及50mg的二月桂酸二丁基錫加入到反應(yīng)容器中，次子攪拌溶解。恒溫40℃反應(yīng)48小時。將反應(yīng)后的溶液用乙醚沉淀過濾并透析1天，冷凍干燥得到雙鍵修飾的淡黃色粉末狀固體。通過核磁及凝膠滲透色譜確定聚合物結(jié)構(gòu)及分子量。

4)聚合物-多肽連接物的合成：

將0.045mmol多肽分子ck(p18)ggmsrtms與0.03mmol雙鍵量的聚合物共聚物溶于1mldmso中，并置于反應(yīng)容器中，加入1滴三乙胺，攪拌溶解，密封體系，通入氮?dú)?0分鐘，恒溫37℃反應(yīng)3天；將反應(yīng)后的溶液加入透析袋中，透析24小時，通過熱沉淀的方法得到純的溫敏聚合物-多肽連接物，冷凍干燥得到粉末狀固體。

得到的大分子溫敏驅(qū)動器的結(jié)構(gòu)如下所示：

在本實(shí)施例中制備得到的連接有紫紅素-18的多肽配體ck(p18)ggmsrtms的maldi-tof譜圖如圖2所示，由圖可以看出，多肽的分子量1604.8

利用核磁氫譜對得到的大分子溫敏驅(qū)動器進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果如圖3所示，由圖可以看出，化學(xué)位移值δ＝3.43ppm和δ＝3.18ppm分別對應(yīng)-och2-跟-ch2-；δ＝7.5-7.0，δ＝3.85ppm和δ＝1.05ppm對應(yīng)n-異丙基丙烯酰胺中的-nh-，-ch-以及-ch3。δ＝9.0-8.0對應(yīng)多肽上的-conh-。

實(shí)施例2

利用與實(shí)施例1的步驟(1)相同的多肽配體合成方法合成了多肽配體ck(p18)gyhwygytpqnvi，其結(jié)構(gòu)如下：

利用與實(shí)施例1的步驟(2)相同的方法將紫紅素-18連接在所述多肽配體上，而后進(jìn)行與實(shí)施例1相同的步驟(3)和(4)制備得到大分子溫敏驅(qū)動器，其結(jié)構(gòu)如下：

在本實(shí)施例中制備得到的連接有紫紅素-18的多肽配體ck(p18)gyhwygytpqnvi的maldi-tof譜圖如圖4所示，由圖可以看出，多肽的分子量為2375.0，分子加鈉離子的峰為2397.0。

利用核磁氫譜對得到的大分子溫敏驅(qū)動器進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果如圖5所示，由圖可以看出，化學(xué)位移值δ＝3.43ppm和δ＝3.18ppm分別對應(yīng)-och2-跟-ch2-；δ＝3.85ppm和δ＝1.05ppm對應(yīng)n-異丙基丙烯酰胺中的-ch-以及-ch3。δ＝9.0-8.0對應(yīng)多肽上的-conh-。

實(shí)施例3

實(shí)施例1制備得到的大分子溫敏驅(qū)動器以圖6所示方式在細(xì)胞膜表面調(diào)控膜受體蛋白寡聚化，對驅(qū)動器拉動受體蛋白寡聚化進(jìn)行驗(yàn)證，方法如下：

將fitc標(biāo)記的溫敏驅(qū)動器分子以3μm的濃度在confocal皿中與貼壁的skbr3細(xì)胞共孵育半小時，使分子與細(xì)胞表面受體蛋白結(jié)合；激光共聚焦顯微鏡成像結(jié)果如圖7所示，其中a圖為無激光照射時的掃描電鏡圖，b圖為有無激光照射時的掃描電鏡圖，在不給激光照射時，驅(qū)動器分子由于處于伸展?fàn)顟B(tài)，鋪展在細(xì)胞表面，且?guī)缀鯖]有入胞，細(xì)胞表面熒光較弱；當(dāng)在655nm的波長下，用4.77wcm^-2的激光密度照射樣品，局部溫度升高到驅(qū)動器分子相轉(zhuǎn)變溫度之上，導(dǎo)致分子塌縮聚集，形成的聚集體熒光變強(qiáng)。同時，利用熱場掃描電鏡觀察驅(qū)動器分子在細(xì)胞表面激光照射前后的形貌像，圖8中a圖和b圖分別是大分子溫敏驅(qū)動器在細(xì)胞膜表面無激光及有激光照射時的掃描電鏡圖，由此可知，驅(qū)動器分子確實(shí)由激光照射前的鋪展?fàn)顟B(tài)(a圖)變成激光照射后的塌縮聚集狀態(tài)(b圖)。綜上，通過激光共聚焦熒光成像及熱場掃描電鏡的表面成像共同證明驅(qū)動器分子在激光照射后發(fā)生聚集塌縮，這種聚集塌縮產(chǎn)生的拉動力具有潛在的調(diào)控蛋白聚集的能力。

為了驗(yàn)證驅(qū)動器分子的聚集拉動并導(dǎo)致了受體蛋白的寡聚化，將具有fret效應(yīng)的融合蛋白ecfp-her2及eyfp-her2轉(zhuǎn)染到hek-293t細(xì)胞內(nèi)。用熒光共聚焦顯微鏡的fret通道觀測發(fā)生熒光共振轉(zhuǎn)移的量。結(jié)果如圖9所示，可以看到對比沒有激光照射的細(xì)胞或者空白對照細(xì)胞，激光照射組的fret水平明顯提升，證明了溫敏驅(qū)動器拉動受體寡聚化。

利用相同的實(shí)驗(yàn)過程可以驗(yàn)證得到實(shí)施例2制備得到的大分子溫敏驅(qū)動器對her1受體寡聚化具有調(diào)控作用。

實(shí)施例4

在本實(shí)施例中對實(shí)施例1制備得到的大分子溫敏驅(qū)動器進(jìn)行增殖抑制檢測：

將上述溫敏驅(qū)動器分子溶于磷酸緩沖液(pbs溶液)中，用結(jié)晶紫測試方法評價驅(qū)動器對skbr3細(xì)胞生長的抑制。將skbr3細(xì)胞種在12孔板中，密度為20000個細(xì)胞/孔。細(xì)胞的量可以通過結(jié)晶紫的吸收進(jìn)行定量。在不同的時間點(diǎn)(0天，2天，4天，6天，8天，12天)用4％的多聚甲醛固定細(xì)胞，并用0.1％的結(jié)晶紫溶液對細(xì)胞染色15分鐘，pbs洗三次后，用1ml1％的十二烷基磺酸鈉溶液萃取結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀在570nm波長下測試吸收值。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

結(jié)果如圖10所示，可以看出，不同處理對細(xì)胞的增殖有影響，本發(fā)明的溫敏驅(qū)動器在激光觸發(fā)下，對skbr3細(xì)胞的增殖有很好的抑制效果，這是由于her2受體的寡聚化干擾了惡性信號向胞內(nèi)的傳遞，最終引起增殖抑制。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的大分子溫敏驅(qū)動器及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。