本發(fā)明涉及檢測(cè)人體基因組中具有多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，尤其涉及的是人類(lèi)y-str29個(gè)基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增試劑盒。
背景技術(shù)：
：人類(lèi)dna短串重復(fù)序列(shorttandemrepeat，str)基因座是一類(lèi)由2-6個(gè)核苷酸為重復(fù)單元組成的幾十至一百多個(gè)的核苷酸重復(fù)序列，在人類(lèi)基因組中分布廣泛，多態(tài)性好，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)擴(kuò)增，電泳分型，適合于各種樣品檢測(cè)，因此被廣泛地應(yīng)用于遺傳學(xué)、i臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及法科學(xué)等領(lǐng)域中，被譽(yù)為新一代最重要的dna指紋。同一str基因座的基因型分布有群體差異，str基因座的等位基因片段大小差異小，擴(kuò)增條件相似，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因座的同步擴(kuò)增，既可節(jié)約時(shí)間、試劑和檢材，又可提高工作效率和個(gè)人識(shí)別機(jī)率。目前市場(chǎng)上主流的商品化試劑盒通常采用的是五色熒光檢測(cè)技術(shù),有yfiler、yfilerplus、powerplexy23、goldeneyey26、strtyper27y、agcudatabasey24等熒光檢測(cè)試劑盒，基因座數(shù)量分別為17個(gè)、27個(gè)、23個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、24個(gè)，會(huì)存在包含的基因座少，識(shí)別率低，不適合也不能滿(mǎn)足科研和辦案實(shí)際的需要的問(wèn)題；此外，由于地域、種族、民族之間遺傳學(xué)特點(diǎn)不同，采用有些y-str商業(yè)化試劑盒對(duì)中國(guó)群體進(jìn)行分型檢驗(yàn)的個(gè)體識(shí)別率較低。因此，需要開(kāi)發(fā)出更適用于我國(guó)群體特征的穩(wěn)定性好、個(gè)體別率更高、檢測(cè)基因座數(shù)更多的y-str試劑盒。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的遺傳學(xué)特點(diǎn)不同、個(gè)體識(shí)別率較低、具有等位基因越界的風(fēng)險(xiǎn)的缺陷，提供一種針對(duì)中國(guó)人群的多態(tài)性高、性能穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單和能同時(shí)檢測(cè)更多基因座的檢測(cè)體系：人類(lèi)29個(gè)y-str基因座的熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒來(lái)解決上述問(wèn)題。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：人類(lèi)y-str29個(gè)基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒包含29對(duì)str基因座的特異性擴(kuò)增引物，其中str基因座為:dys391、dys456、dys19、dys448、dys385a/b、dys392、dys389i、dys449、dys389ii、dys438、dys570、dys390、dys437、dys460、dys533、dys481、dys576、dys549、dys518、dyf387s1a/b、dys557、dys393、gatah4、dys439、dys447、dys458、dys635，針對(duì)上述29個(gè)y-str基因座，在其重復(fù)序列的側(cè)翼分別設(shè)計(jì)特異性熒光標(biāo)記引物。優(yōu)選地，復(fù)合擴(kuò)增體系個(gè)基因座引物序列如下表：優(yōu)選地，所述的29對(duì)str基因座的特異性擴(kuò)増引物分為五組:第一組，dys391、dys456、dys19、dys448、dys385a、dys385b；第二組，dys392、dys389i、dys449、dys389ii、dys438、dys570；第三組，dys390、dys437、dys460、dys533、dys481、dys576；第四組，dys549、dys518、dyf387s1a、dyf387s1b、dys557；第五組，dys393、gatah4、dys439、dys447、dys458、dys635。作為優(yōu)選，將所述的五組引物依次分別用紅色pet、黃色ned、藍(lán)色fam、綠色vic、和紫色熒光素vig標(biāo)記其5'端。優(yōu)選地，所述的試劑盒內(nèi)設(shè)有內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)由一組大小固定且不同的dna片段組成，內(nèi)標(biāo)用siz橙色熒光標(biāo)記物。優(yōu)選地，所述的試劑盒包括反應(yīng)混合液、29對(duì)str基因座的特異性擴(kuò)増引物、29個(gè)基因座的等位基因、熱啟動(dòng)taq酶、dna標(biāo)準(zhǔn)品、sdh20和熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)。作為優(yōu)選，所述的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒具體成分為：優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系具體成分為：組分反應(yīng)體積反應(yīng)混合液10uly29熒光引物6ul熱啟動(dòng)taq酶1ul人類(lèi)dna樣本0.2-0.3ngsdh2o補(bǔ)足至25.0ul作為優(yōu)選，所述的擴(kuò)增反應(yīng)的條件如下：反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共29個(gè)循環(huán)；72℃10min。本發(fā)明提供的人類(lèi)y-str29個(gè)基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增試劑盒，所述的試劑盒包含29對(duì)str基因座的特異性擴(kuò)增引物，所述的29對(duì)str基因座的特異性擴(kuò)増引物分為五組，分別采用不同的熒光色標(biāo)記，即五組引物依次分別用紅色pet、黃色ned、藍(lán)色fam、綠色vic、和紫色熒光素vig標(biāo)記其5'端，擴(kuò)增上述基因座的引物，本發(fā)明通過(guò)上述基因座的特異性引物的設(shè)計(jì)以及獨(dú)特的基因座組合熒光標(biāo)記方式，使得本發(fā)明復(fù)合擴(kuò)增體系中，僅采用五種標(biāo)記就可以在同一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系中同時(shí)擴(kuò)增本發(fā)明的29個(gè)基因座，靈敏度非常高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增試劑盒更針對(duì)中國(guó)人群，多態(tài)性高、性能穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單和能同時(shí)檢測(cè)更多基因座的檢測(cè)體系。此外，本試劑盒具有較好的溫度耐受性，使用不同質(zhì)量的pcr儀均可獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1本試劑盒包括：反應(yīng)混合液、29對(duì)str基因座的特異性擴(kuò)増引物、29個(gè)基因座的等位基因、熱啟動(dòng)taq酶、dna標(biāo)準(zhǔn)品、sdh20和熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)。1、y-str29個(gè)基因座的篩選通過(guò)對(duì)dys391、dys456、dys19、dys448、dys385a/b、dys392、dys389i、dys449、dys389ii、dys438、dys570、dys390、dys437、dys460、dys533、dys481、dys576、dys549、dys518、dyf387s1a/b、dys557、dys393、gatah4、dys439、dys447、dys458、dys635共29個(gè)y染色體str基因座的基因多態(tài)性和突變率的研究，最后篩選出，共29個(gè)y-str基因座。每個(gè)基因座相應(yīng)信息表如下：2、五色熒光系統(tǒng)的建立法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室采用熒光檢測(cè)技術(shù)的具體過(guò)程為：激光轟擊連接在dna末端的熒光集團(tuán)(染料)，熒光集團(tuán)吸收能力后發(fā)出較低能量的光，用濾光片收集特定波長(zhǎng)范圍的發(fā)射光，用光電倍增管或電耦合裝置用以收集和放大來(lái)自熒光集團(tuán)的信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，最終生成毛細(xì)管電泳的峰圖。3、29y-str個(gè)基因座排布第一組，dys391、dys456、dys19、dys448、dys385a、dys385b；第二組，dys392、dys389i、dys449、dys389ii、dys438、dys570；第三組,dys390、dys437、dys460、dys533、dys481、dys576；第四組,dys549、dys518、dyf387s1a、dyf387s1b、dys557；第五組,dys393、gatah4、dys439、dys447、dys458、dys635。將五組引物分別用紅色pet、黃色ned、藍(lán)色fam、綠色vic、和紫色熒光素vig標(biāo)記其5'端。4、調(diào)整pcr反應(yīng)混合液在pcr擴(kuò)增體系中，對(duì)mg2+濃度、dntps濃度兩個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，最終將，mg2+濃度定位2.5mm，dntps濃度為0.25mm，tris-hcl濃度為100mm，kcl濃度為100mm，并且利用上述材料制備成pcr反應(yīng)混合液。最終pcr體系組成見(jiàn)下表：5、調(diào)整pcr反應(yīng)程序及pcr擴(kuò)增本發(fā)明為包裝不同檢材的適應(yīng)性及不同退火溫度的耐受性，分別對(duì)循環(huán)數(shù)和退火溫度進(jìn)行測(cè)試。其中，循環(huán)數(shù)測(cè)試了27、28、29、30、31、32個(gè)循環(huán)，最佳為29和循環(huán)；分別測(cè)試了58℃、59℃、60℃、61℃、62℃，最佳溫度為62℃。最終反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共29個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃forever。6、pcr擴(kuò)增反應(yīng)取反應(yīng)混合液、引物混合液按照下表配成混合液，震蕩混勻后分裝至pcr反應(yīng)管中，每管25ul。綜上所述，本發(fā)明提供的人類(lèi)y-str29個(gè)基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增試劑盒，所述的試劑盒包含29對(duì)str基因座的特異性擴(kuò)增引物，所述的29對(duì)str基因座的特異性擴(kuò)増引物分為五組，分別采用不同的熒光色標(biāo)記，即五組引物依次分別用紅色pet、黃色ned、藍(lán)色fam、綠色vic、和紫色熒光素vig標(biāo)記其5'端，擴(kuò)增上述基因座的引物，本發(fā)明通過(guò)上述基因座的特異性引物的設(shè)計(jì)以及獨(dú)特的基因座組合熒光標(biāo)記方式，使得本發(fā)明復(fù)合擴(kuò)增體系中，僅采用五種標(biāo)記就可以在同一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系中同時(shí)擴(kuò)增本發(fā)明的29個(gè)基因座，靈敏度非常高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增試劑盒更針對(duì)中國(guó)人群，多態(tài)性高、性能穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單和能同時(shí)檢測(cè)更多基因座的檢測(cè)體系。此外，本試劑盒具有較好的溫度耐受性，使用不同質(zhì)量的pcr儀均可獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12