本發(fā)明涉及病毒和細菌的核酸提取和檢測
技術領域：
，具體涉及一種用于提取病毒、細菌核酸的裂解液及采用該裂解液進行熒光定量pcr的檢測方法。
背景技術：
：在現(xiàn)有技術中，血清、血漿中病毒提取方法主要有以下幾種：一、煮沸法：向血清或血漿等病毒、細菌樣本中加入裂解液，水浴或者干浴煮沸，高速離心取上清作為pcr模板，其優(yōu)點是操作簡單，缺點是提取的核酸雜質含量高，容易抑制后期pcr擴增，另外由于煮沸產(chǎn)生局部高壓，容易造成氣溶膠污染，導致檢測結果陰陽不分。二、離心柱提取法：血清或血漿等病毒、細菌樣本通過加入高鹽低ph的裂解液，然后使用核酸吸附膜吸附，再使用洗滌液洗滌2-3次，最后使用低鹽高ph值的洗脫液將核酸洗脫下來作為pcr模板。該方法提取的核酸純度高，但是缺點是需要多次高速離心，手工操作繁雜，效率低，而且無法實現(xiàn)自動化。三、磁珠法：磁珠法可以視為離心柱法的改進，將吸附膜同功能物包裹在磁性納米微粒上，血清或血漿等病毒、細菌樣本通過加入高鹽低ph值的裂解液，然后使用包裹了核酸吸附膜的納米磁性微粒吸附，再使用洗滌液洗滌2-3次，最后使用低鹽高ph值的洗脫液將核酸洗脫下來作為pcr模板。該方法提取的核酸純度高，而且可以實現(xiàn)自動化提取，但是該技術需要操作人員具有較高的實驗技能，不易推廣，如果配備自動化設備，則會增加檢測成本。上述幾種提取方法中，采用了化學方法實現(xiàn)細胞破裂、核酸釋放，再基于核酸比蛋白質、多糖、脂肪等其他生物大分子物質更具親水性的特性將核酸進行分離、純化，純化步驟操作時間長、成本高。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、成本低廉的病毒/細菌的裂解液及熒光定量pcr檢測方法，其能滿足絕大多數(shù)臨床常見病毒、細菌無需核酸純化直接進行熒光定量pcr檢測的要求，用以解決現(xiàn)有核酸提取過程中純化時間長、操作繁瑣、成本高的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明方法采用一種快速裂解病毒、細菌外殼蛋白釋放出其遺傳物質的裂解液，直接將其加入相應的pcr反應液中，即可實現(xiàn)針對待測病原微生物的定量或者定性檢測。具體地，該病毒/細菌的裂解液，由nacl、tritonx-100、十二烷基硫酸鋰和edta-2na與純化水混勻而成，各組分的終濃度：nacl為0.8～1.2m，tritonx-100為10v.％～15v.％，十二烷基硫酸鋰為0.01％～0.05％w/v(即質量體積比)，edta-2na為5～10mm。優(yōu)選的，各組分的終濃度配比：nacl為1m，tritonx-100為10v.％，十二烷基硫酸鋰為0.02％，edta-2na為5mm。優(yōu)選的，各組分的終濃度配比：nacl為1m，tritonx-100為12v.％，十二烷基硫酸鋰為0.04％，edta-2na為8mm。上述技術方案中，采用高濃度氯化鈉有利于蛋白鹽析變性從而與核酸分離；tritonx-100和十二烷基硫酸鋰分別屬于非離子型和離子型表面活性劑，利于病毒外殼蛋白裂解以及核酸與蛋白的分離，其中非離子型表面活性劑對后期pcr不會產(chǎn)生明顯抑制，因此使用體積濃度優(yōu)選10～15v.％，更優(yōu)選10v.％，離子型活性劑在高劑量時會抑制掉pcr，因此優(yōu)選使用0.01～0.05％w/v(質量體積比)，更優(yōu)選0.04％w/v。edta-2na可以與樣品中二價金屬離子形成螯合物，從而使得dna酶沒有催化劑，從而間接保護dna不受降解。上述各組分之間協(xié)同作用，將病毒或細菌裂解后可以直接進行pcr擴增，繞開核酸提純過程。本發(fā)明還提供了一種病毒/細菌的熒光定量pcr檢測方法，包括以下步驟：a、按照上述病毒/細菌的裂解液的配比，配制裂解液；b、提取病毒/細菌核酸：向pcr反應管中加入步驟a中所得裂解液和待檢測血清或血漿樣本，混勻、靜置5～15min，得病毒/細菌的dna樣本；c、pcr擴增：向步驟b中所得dna樣本的pcr反應管中加入pcr反應液，置于熒光定量pcr儀上，設置循環(huán)參數(shù)，進行pcr擴增和熒光檢測。步驟a中配制裂解液的方法如下：向容器中加入46.8～70.2克(即0.8～1.2mol)氯化鈉，100～150mltritonx-100，1～5克的十二烷基硫酸鋰，0.5mph值為8.0的edta-2na10～20ml，然后加純化水600ml，混勻后，定容到1000ml。步驟b中所述pcr反應液包括：pcr緩沖溶液(pcrbuffer)、mgcl2、dntps、檢測病毒/細菌的引物對和對應探針以及taqdna聚合酶或酶混合液。本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點：采用本發(fā)明的裂解液，在pcr反應的過程中可以省略提純dna的步驟，樣本的核酸提取和擴增檢測在一個反應管中進行，無需加熱，離心，震蕩等分離或純化操作，操作過程簡單、方便、成本低廉，對操作人員要求極低，大幅度壓縮了檢測時間，特別適用于重大疾病的床邊診斷和爆發(fā)重大疫情時的現(xiàn)場檢驗檢疫工作。附圖說明圖1是實施例2中4個梯度大腸桿菌的擴增曲線，其中橫坐標表示循環(huán)數(shù)，縱坐標表示熒光強度。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1以豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的熒光定量pcr檢測為例，說明本發(fā)明裂解液的應用。a、配制裂解液：向容器中加入58.5克氯化鈉，100mltritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，2克的十二烷基硫酸鋰，濃度為0.5m、ph值為8.0的edta-2na溶液10ml，然后加純化水600ml，混勻后，轉移至容量瓶中，定容到1000ml。b、提取病毒/細菌核酸：向pcr反應管中加入步驟a中配制的裂解液5μl和待檢測血清或血漿樣本5μl，使用移液器反復吹打3次混勻，靜置10min，得細菌的dna樣本；c、pcr擴增：向步驟b中所得dna樣本的pcr反應管中加入配制好的pcr反應液40μl，將pcr反應管置于熒光定量pcr儀上，設置循環(huán)參數(shù)，進行pcr擴增和熒光檢測，pcr擴增反應程序參見表1。本實施例采用型號為宏石slan-48p的熒光定量pcr儀進行檢測。同時以純化水作為陰性對照，以含有豬圓環(huán)病毒2型細菌的培養(yǎng)液作為陽性對照，分別按照上述條件進行pcr擴增和熒光檢測。表1pcr反應程序和條件其中，pcr反應液的組分和濃度參見表2。表2pcr反應液的組分和濃度組分單人份用量(μl)5×pcrbuffer10mgcl2(1m)0.5dntps(25mm)0.5pcv-2-f(50pmol/μl)0.4pcv-2-r(50pmol/μl)0.4pcv-2-p(50pmol/μl)0.2taqdna聚合酶(5u/μl)1純化水補足到40上述pcrbuffer的組分及濃度為：250mmtrishcl、ph值為8.0,375mmkcl，25％(體積比)甘油，25％硫酸銨(體積比)。用于擴增豬圓環(huán)病毒2型的上游引物pcv-2-f、下游引物pcv-2-r和檢測擴增豬圓環(huán)病毒2型的探針pcv-2-p采用現(xiàn)有技術中已經(jīng)成熟的核苷酸序列即可，本實施例采用的核苷酸序列參見表3。表3用于檢測豬圓環(huán)病毒2型的引物和探針序列按照上述的方法對54例豬圓環(huán)病毒2型血清樣品進行檢測。同時作為對照，對每例樣品按照離心柱提取法進行核酸提純，具體方法如下：在血清樣本中加入高鹽低ph值的裂解液，然后使用核酸吸附膜吸附，再使用洗滌液洗滌2-3次，最后使用低鹽高ph值的洗脫液將核酸洗脫下來作為pcr模板，加入表2中配制好的pcr反應液，按照表1的pcr反應程序和條件進行擴增和檢測。本實施例采用的是濟凡生物科技(北京)有限公司提供的finepure病毒dna/rna柱式提取試劑盒。將本實施例和對照例的檢測結果進行比對，參見表4。表4實施例1與對照例的檢測結果比對以上結果表明：采用本實施例的裂解劑和相應的方法與經(jīng)典離心柱提取檢測陽性率接近，而且本實施例操作簡單，可以規(guī)避離心柱提取過程中產(chǎn)生的失誤導致假陰性結果的出現(xiàn)。實施例2a、配制裂解液：向容器中加入58.5克氯化鈉，150mltritonx-100，4克的十二烷基硫酸鋰，濃度為0.5m、ph為8.0的edta-2na溶液16ml，然后加純化水600ml，混勻后，轉移至容量瓶中，定容到1000ml。b、制備待測樣本：將已知濃度的大腸桿菌菌液稀釋到1×107cfu/ml、1×106cfu/ml、1×105cfu/ml、1×104cfu/ml四個10倍稀釋梯度濃度。取多個pcr反應管，分別加入步驟a中配制的裂解液5μl，并依次加入上述四個濃度的大腸桿菌菌液5μl，使用移液器反復吹打3次混勻、靜置10min，得病毒裂解體系；c、pcr擴增：向步驟b中所述病毒裂解體系中加入配制好的pcr反應液40μl，按照表1中pcr反應程序和條件進行擴增，檢測。其中以純化水作為陰性對照。本實施例pcr反應液的組分和濃度參見表5。表5pcr反應液的組分和濃度組分單人份用量(μl)5×pcrbuffer10mgcl2(1m)0.5dntps(25mm)0.5ec-f(50pmol/μl)0.2ec-r(50pmol/μl)0.2ec-p(50pmol/μl)0.1taqdna聚合酶(5u/μl)1rox(50μm)0.1純化水補足到40本實施例中5×pcrbuffer的濃度和組分與實施例1相同。用于檢測大腸桿菌上游引物ec-f、下游引物ec-r和探針ec-p是現(xiàn)有技術中已經(jīng)成熟的技術。本實施例中所采用的核苷酸序列參見表6。表6用于擴增環(huán)病毒2型的引物和探針序列擴增結果參見圖1，測得的ct值見表7。表7大腸桿菌的檢測結果大腸桿菌溶液檢測結果(ct值)1×107cfu/ml20.011×106cfu/ml23.111×105cfu/ml26.731×104cfu/ml29.88以上結果表明：本實施例的裂解液針對細菌樣本具有良好的靈敏性，并且ct值隨濃度減少呈梯度改變。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。sequencelisting<110>濟凡生物科技（北京）有限公司<120>一種病毒/細菌的裂解液及熒光定量pcr檢測方法<130>2010<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>artificalsequence<400>1cccgcagtattctgattac19<210>2<211>23<212>dna<213>artificalsequence<400>2gacagcagttgaggagtaccatt23<210>3<211>22<212>dna<213>artificalsequence<400>3gaccccgttggaatggtactcc22<210>4<211>19<212>dna<213>artificalsequence<400>4ggttgattgaacgccgctc19<210>5<211>22<212>dna<213>artificalsequence<400>5gtgagacgctgaataaggagtg22<210>6<211>25<212>dna<213>artificalsequence<400>6tccgcgactatcgtcgttaatcacc25當前第1頁12