本申請(qǐng)涉及禽流感病毒檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑、檢測(cè)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：禽流感(avianinfluenza,ai)是由正黏病毒科a型流感病毒屬中的禽流感病毒引起的發(fā)生于各種家禽和野禽的病毒性傳染病。該病于1978年在意大利雞群中首次暴發(fā)，現(xiàn)已遍布世界許多國(guó)家。由于不同禽流感病毒的ha和na有不同的抗原性，目前已發(fā)現(xiàn)有16個(gè)ha亞型和9個(gè)na亞型，此外，還從蝙蝠體內(nèi)分離到了兩種新的a型流感病毒亞型，h17n10和h18n11。根據(jù)禽流感病毒對(duì)人工感染雞的致病性，可將其分為高致病性禽流感(縮寫(xiě)hpaiv)和低致病力禽流感(縮寫(xiě)lpaiv)，病毒ha裂解位點(diǎn)的分子標(biāo)準(zhǔn)也可作為致病性的補(bǔ)充依據(jù)。目前所有的高致病性禽流感病毒都屬于h5或h7亞型，低致病性禽流感病毒以h9n2亞型居多。h7n9亞型禽流感病毒是一種新型禽流感病毒，可感染禽和人。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)報(bào)告統(tǒng)計(jì)，自2013年3月中國(guó)首次報(bào)道人感染h7n9亞型禽流感以來(lái)，截止到2017年2月14日，共有1223例人感染h7n9亞型禽流感實(shí)驗(yàn)室確診病例，包括至少380名死亡病例。2016年入冬以來(lái)，我國(guó)出現(xiàn)人感染該亞型病毒病例數(shù)直線(xiàn)上升的情況，特別是2016年12月的最后兩周，全國(guó)新增人間病例92例，死亡10例，這說(shuō)明該亞型病毒對(duì)人的健康威脅仍然很大。活禽零售市場(chǎng)環(huán)境污染率與人感染病例數(shù)在時(shí)空維度表現(xiàn)一致，即隨著污染水平升高，人的感染風(fēng)險(xiǎn)也增加。值得關(guān)注的是，2015年-2016年間報(bào)告人感染病例數(shù)位居前列的廣東、浙江、江蘇、福建等省份市也已在養(yǎng)雞場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)h7n9亞型禽流感病毒。雖然目前只是散發(fā)，但對(duì)其流行態(tài)勢(shì)要高度關(guān)注。重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增技術(shù)rpa(recombinasepolymeraseamplification，rpa)被稱(chēng)為是可以替代pcr的核酸檢測(cè)技術(shù)，rpa能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行37℃-42℃常溫下的單分子核酸檢測(cè)。rpa技術(shù)主要依賴(lài)于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈dna結(jié)合蛋白(ssb)和鏈置換dna聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，其擴(kuò)增原理是：重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-dna復(fù)合物，能在雙鏈dna中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)dna合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的dna鏈與ssb結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過(guò)程進(jìn)行得非?？?，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。目前尚沒(méi)有h7亞型禽流感病毒的rpa檢測(cè)研究和報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本申請(qǐng)的目的是提供一種用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑、檢測(cè)方法和應(yīng)用。本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案：本申請(qǐng)的一方面公開(kāi)了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑，該試劑包括引物對(duì)和探針，引物對(duì)的上游引物為seqidno.1所示序列，引物對(duì)的下游引物為seqidno.2所示序列，探針為seqidno.3所示序列或者seqidno.3所示序列的反向互補(bǔ)序列；seqidno.1：5’-gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc-3’seqidno.2：5’-gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc-3’seqidno.3：5’-gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa-3’seqidno.3所示序列的探針中，第32個(gè)堿基修飾bhq1-dt、第36個(gè)堿基修飾6-fam-dt、第34個(gè)堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。需要說(shuō)明的是，在熒光檢測(cè)中，探針是特異性的結(jié)合到雙鏈的其中一條鏈的，只要pcr擴(kuò)增的時(shí)候，將結(jié)合的探針破壞，即可產(chǎn)生熒光信號(hào)，因此，可以采用seqidno.3所示序列的探針結(jié)合到其中一條鏈上，也可以采用seqidno.3所示序列的反向互補(bǔ)序列作為探針結(jié)合到另一條鏈上，探針的修飾方式不變。還需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的引物對(duì)和探針，是特別針對(duì)h7亞型禽流感病毒的rpa檢測(cè)而設(shè)計(jì)的，不同于常規(guī)pcr引物或一般的實(shí)時(shí)熒光pcr探針。此外，本申請(qǐng)的引物對(duì)和探針能夠特異性的檢測(cè)h7亞型禽流感病毒，而不是僅僅針對(duì)h7n9毒株設(shè)計(jì)的引物探針；也就是說(shuō)，本申請(qǐng)的檢測(cè)試劑和方法，能夠特異性的對(duì)包括h7n9毒株在內(nèi)的所有h7亞型禽流感病毒進(jìn)行檢測(cè)，即便其na基因發(fā)生變異，也不會(huì)影響本申請(qǐng)的檢測(cè)特異性和靈敏度。本申請(qǐng)的試劑包括引物對(duì)和探針，其中，探針是為了方便對(duì)rpa產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，可以理解，如果不是采用熒光檢測(cè)對(duì)rpa產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，則整個(gè)試劑可以不包含探針，只要一對(duì)引物即可完成rpa擴(kuò)增。本申請(qǐng)的另一面公開(kāi)了本申請(qǐng)的用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑在h7亞型禽流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。本申請(qǐng)的另一面公開(kāi)了本申請(qǐng)的用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑在制備h7亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒或設(shè)備中的應(yīng)用?？梢岳斫猓旧暾?qǐng)的試劑，實(shí)際上就針對(duì)h7亞型禽流感病毒設(shè)計(jì)的特異性探針和引物對(duì)，當(dāng)然可以用于h7亞型禽流感病毒的檢測(cè)，或者用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑盒或設(shè)備。本申請(qǐng)的再一面公開(kāi)了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒中含有本申請(qǐng)的用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑。本申請(qǐng)的再一面公開(kāi)了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒中含有至少一組混合試劑，每組混合試劑由rt-rpa反應(yīng)緩沖液29.5μl、10μm的上游引物2.1μl、10μm的下游引物2.1μl和10μm的探針0.6μl組成；上游引物為seqidno.1所示序列，下游引物為seqidno.2所示序列，探針為seqidno.3所示序列或者seqidno.3所示序列的反向互補(bǔ)序列，并且，no.3所示序列的探針中，第27個(gè)堿基修飾bhq1-dt，第30個(gè)堿基修飾6-fam-dt，第28個(gè)堿基替換為dspacer，3’端修飾c3spacer。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的試劑實(shí)際上是針對(duì)h7亞型禽流感病毒的rpa檢測(cè)而設(shè)計(jì)的，為了方便使用，本申請(qǐng)將反應(yīng)體系中使用的反應(yīng)緩沖液、引物和探針統(tǒng)一配制成混合試劑，每一組混合試劑就是一個(gè)反應(yīng)體系，直接向其中加入rna樣品、水和/或添加劑就可以進(jìn)行檢測(cè)，使用簡(jiǎn)單方便，不僅避免了配制反應(yīng)體系的繁瑣步驟，而且避免了配制反應(yīng)體系過(guò)程造成的污染。本申請(qǐng)?jiān)噭┖械幕旌显噭┲?，各組分的用量是在本申請(qǐng)的試驗(yàn)條件和環(huán)境下，根據(jù)本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方式而得出的，可以理解，根據(jù)不同的試驗(yàn)環(huán)境，混合試劑中各組分的用量可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，在此不做具體限定。本申請(qǐng)的再一面公開(kāi)了一種用于h7亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：(1)提取待測(cè)樣品的核酸；(2)采用本申請(qǐng)的試劑盒，向試劑盒的混合試劑中加入步驟(1)提取的核酸，再加入depc水和醋酸鎂，配制成反應(yīng)溶液；(3)將步驟(2)配制的反應(yīng)溶液，在41℃恒溫反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程采集熒光信號(hào)。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的試劑盒或者本申請(qǐng)的試劑，其關(guān)鍵就是針對(duì)h7亞型禽流感病毒設(shè)計(jì)的特異性的rpa檢測(cè)引物和探針，試劑盒的混合試劑，實(shí)際上就是本申請(qǐng)的rpa檢測(cè)反應(yīng)體系。優(yōu)選的，41℃恒溫反應(yīng)具體包括，先將步驟(2)配制的反應(yīng)溶液，在41℃保溫5min，然后取出裝反應(yīng)溶液的pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，瞬時(shí)離心，再繼續(xù)41℃下反應(yīng)15min，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程采集熒光信號(hào)。需要說(shuō)明的是，反應(yīng)5min后取出混勻，目的是使反應(yīng)能夠更均勻的進(jìn)行。優(yōu)選的，采集熒光信號(hào)的過(guò)程中，fam熒光通道光源強(qiáng)度設(shè)置為28％。優(yōu)選的，本申請(qǐng)的檢測(cè)方法還包括，采集41℃恒溫反應(yīng)前5min各點(diǎn)熒光值，計(jì)算其平均值，作為第一熒光值；采集41℃恒溫反應(yīng)5min后任意時(shí)間點(diǎn)的熒光值，作為第二熒光值；根據(jù)熒光增量判斷待測(cè)樣品為陽(yáng)性或陰性，具體的，熒光增量大于55％，且持續(xù)的時(shí)間超過(guò)2分鐘，判為陽(yáng)性，否則判為陰性；熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％。優(yōu)選的，步驟(1)提取待測(cè)樣品的核酸，采用magmaxtm-96viralrnaisolationkit磁珠提取試劑盒，或者trizol核酸抽提法。本申請(qǐng)的有益效果在于：本申請(qǐng)的用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑，對(duì)禽流感h7亞型具有很強(qiáng)的特異性，能夠準(zhǔn)確靈敏的從眾多禽流感病毒中特異性的檢測(cè)出h7亞型，并且可以同時(shí)檢出h7亞型中的各個(gè)毒株，為h7亞型禽病毒的預(yù)防和監(jiān)控提供了一種有效的方法和途徑。并且，基于本申請(qǐng)的試劑或試劑盒的h7亞型禽流感病毒檢測(cè)方法，耗時(shí)短、靈敏度高、對(duì)硬件設(shè)備要求低，不需要復(fù)雜的樣本處理，特別適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，這對(duì)于控制流感的流行，減少經(jīng)濟(jì)損失，最大限度的保護(hù)全社會(huì)人群的健康和生命安全具有重大意義。附圖說(shuō)明圖1是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為38℃時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖2是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為39℃時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖3是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為40℃時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖4是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為41℃時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖5是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為42℃時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖6是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為12％時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖7是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為16％時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖8是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為20％時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖9是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為24％時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖10是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為28％時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖11是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為32％時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；圖12是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)結(jié)果；圖13是本申請(qǐng)實(shí)施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果；圖14是本申請(qǐng)實(shí)施例中作為對(duì)比的h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。圖1-圖5中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、6為h7亞型0.00523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)；圖6-圖11中，1為h7亞型0.0523μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、2為h7亞型5.23ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、3為h7亞型0.523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、4為h7亞型0.0523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、5為h7亞型0.00523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、6為h7亞型0.523pg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)；圖12中，具有熒光信號(hào)的曲線(xiàn)由上到下依序?yàn)榈椭虏⌒缘膆7亞型禽流感病毒核酸的檢測(cè)曲線(xiàn)和高致病性的h7亞型禽流感病毒核酸的檢測(cè)曲線(xiàn)；圖13中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、6為h7亞型5.23pg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)；圖14中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、6為h7亞型5.23pg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、7為h7亞型0.523pg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)、8為h7亞型0.0523pg/ml的檢測(cè)曲線(xiàn)。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例僅對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。實(shí)施例一、材料1.病毒rna本例分別采用了禽流感h3n2、h4n9、h5n1、h6n2、低致病性h7n9、高致病性h7n9、h9n2、h11n9和h1n1亞型和新城疫病毒的rna進(jìn)行試驗(yàn)。2.rt-rpa和qrt-pcr試劑twistamptmexolyophilizedkit(twistdx,cambridge,uk)；agpath-idtmone-steprt-pcrreagents；magmaxtm-96viralrnaisolationkit(thremofisherscientific,usa)；rpa試驗(yàn)用引物及探針、實(shí)時(shí)熒光rt-pcr試驗(yàn)用引物及探針均由上海生工生物工程有限公司合成。3.主要儀器設(shè)備便攜式等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀(t16-iso)，購(gòu)置于英國(guó)twistdx公司；abi7500-fast實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)儀，購(gòu)置于美國(guó)ab公司；超微量核酸檢測(cè)儀；離心機(jī)；微量移液器。二、方法1.引物探針的設(shè)計(jì)選取禽流感h基因作為靶標(biāo)基因，采用dnastar軟件對(duì)10株h7亞型禽流感病毒株及其它亞型禽流感病毒株，包括h1、h3、h4、h5、h6、h9和h11，的h基因核苷酸全序列進(jìn)行序列比對(duì)。選擇h7亞型禽流感特異性序列來(lái)設(shè)計(jì)引物和探針，并與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)核苷酸序列進(jìn)行blast比對(duì)，確定其序列的特異性。為建立快速敏感的rpa檢測(cè)方法需要選擇合適的擴(kuò)增引物，而目前無(wú)法跟實(shí)時(shí)熒光pcr方法一樣可利用商業(yè)軟件來(lái)設(shè)計(jì)并預(yù)測(cè)擴(kuò)增性能。因此本例自行設(shè)計(jì)了一系列候選引物及探針，用于試驗(yàn)篩選，如表1所示。此外，本例還采用了實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)作為對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光pcr的引物和探針為oie推薦用引物與探針，如表1所示。oie為officeinternationaldesepizooties縮寫(xiě)，即世界動(dòng)物衛(wèi)生組織。表1引物和探針序列名稱(chēng)序列(5’→3’)seqidno.h7-1026-p-1gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa3h7-991-f-1gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc1h7-1119-r1-1gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatcaattagg4h7-1119-r2-1gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc2h7-501-f-2gtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatg5h7-536-p-2ctaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctataatagtatgggggatcc6h7-658-r1-2cccaactgtcaccagtttgtttccactcccatatag7h7-658-r2-2cccaactgtcaccagtttgtttccactccc8aiv-h7-fggcaatgcaaaatagaatacagattg9aiv-h7-pfam-cccagtcaaactaagcagcggc-bhq110aiv-h7-rccccgaagctaaaccaaagtatc11注：h7-1026-p-1探針標(biāo)記與修飾為：第32個(gè)堿基修飾bhq1-dt、第36個(gè)堿基修飾6-fam-dt、第34個(gè)堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。h7-536-p-2探針標(biāo)記與修飾為：第35個(gè)堿基修飾bhq1-dt、第37個(gè)堿基修飾6-fam-dt、第36個(gè)堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。2.病毒核酸的提取采用magmaxtm-96viralrnaisolationkit磁珠提取試劑盒提取上述病毒核酸，并用超微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定核酸濃度，作為rpa試驗(yàn)用樣品模板。3.引物和探針篩選以提取的低致病性h7n9和高致病性h7n9病毒的核酸作為模板，將設(shè)計(jì)好的引物，從h7-991-f-1和h7-501-f-2中任選一個(gè)作為上游引物，從h7-1119-r1-1、h7-1119-r2-1、h7-658-r1-2和h7-658-r2-2中任選一個(gè)作為下游引物，上游引物和下游引物兩兩配對(duì)，再分別配以h7-1026-p-1探針、h7-536-p-2探針，進(jìn)行rt-rpa反應(yīng)，篩選快速敏感的最佳引物對(duì)和探針。rt-rpa反應(yīng)體系為：反應(yīng)緩沖液(即rehydrationbuffer)29.5μl，然后加入10μm濃度的上、下游引物各2.1μl，10μm濃度的探針0.6μl，再加入模板及depc水13.2μl，共47.5μl，混勻，加入280mm醋酸鎂2.5μl，反應(yīng)體系共計(jì)50μl。反應(yīng)條件為：在38℃保溫5min，然后取出裝反應(yīng)溶液的pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，瞬時(shí)離心，再繼續(xù)38℃下反應(yīng)15min，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程采集熒光信號(hào)。fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為20％。4.rt-rpa反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化(1)rt-rpa反應(yīng)體系的配置取出twistamptmexolyophilizedkit試劑盒反應(yīng)管并置于冰上，里面含有白色固體小顆粒，為凍干混合酶，包括能結(jié)合單鏈核酸即寡核苷酸引物的重組酶、單鏈dna結(jié)合蛋白(縮寫(xiě)ssb)和鏈置換dna聚合酶，加入試劑盒中的反應(yīng)緩沖液(即rehydrationbuffer)29.5μl，然后加入10μm濃度的上、下游引物各2.1μl，10μm濃度的探針0.6μl，再加入模板及depc水13.2μl，共47.5μl，混勻，加入280mm醋酸鎂2.5μl，反應(yīng)體系共計(jì)50μl，混勻后放入t16-iso儀器后開(kāi)始試驗(yàn)。(2)rt-rpa反應(yīng)條件的基本設(shè)置將配置好的反應(yīng)混合液置于t16-iso儀器中，設(shè)置反應(yīng)程序，38-42℃反應(yīng)5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，迅速置于離心機(jī)上2000rpm/min，離心30s，放入t-16中繼續(xù)在38-42℃下反應(yīng)15min。設(shè)置熒光通道光源強(qiáng)度，并在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程收集fam熒光信號(hào)。rt-rpa反應(yīng)條件的優(yōu)化具體如下：本例將提取到的低致病性h7亞型禽流感病毒核酸作6個(gè)10倍系列稀釋?zhuān)偌由详幮詫?duì)照的h5亞型禽流感病毒核酸，共計(jì)7個(gè)樣品模板，采用優(yōu)化好的引物對(duì)與探針組合，配置反應(yīng)體系。其中，h7亞型禽流感病毒核酸的6個(gè)10倍系列稀釋的濃度分別為，0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml、0.00523ng/ml；h5亞型禽流感病毒核酸的濃度為0.262μg/ml。反應(yīng)程序的優(yōu)化具體如下：將配置好的反應(yīng)管放入t-16儀器中，在38℃反應(yīng)5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，迅速置于離心機(jī)上2000rpm/min，離心30s，再放入t-16中繼續(xù)反應(yīng)15min，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程全程收集fam熒光。取同樣的反應(yīng)體系和樣品數(shù)量，將反應(yīng)溫度分別設(shè)置為38℃、39℃、40℃、41℃和42℃，其它條件均不變，篩選出最優(yōu)的反應(yīng)溫度。fam通道的熒光強(qiáng)度的優(yōu)化具體如下：采用優(yōu)化的反應(yīng)溫度，并取同樣的反應(yīng)體系和樣品數(shù)量，設(shè)置led燈fam通道的熒光強(qiáng)度，分別設(shè)置為12％、16％、20％、24％、28％和32％六個(gè)不同的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，篩選出最優(yōu)的led燈fam通道的熒光強(qiáng)度值。5.rt-rpa方法判定標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定將上述各樣品的反應(yīng)結(jié)果按下列公式進(jìn)行計(jì)算：首先，采集恒溫反應(yīng)前5min各點(diǎn)熒光值，計(jì)算其平均值，作為第一熒光值；然后采集5min后任意時(shí)間點(diǎn)的熒光值，作為第二熒光值。檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度增加百分?jǐn)?shù)，即熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％。分析各稀釋度樣品的熒光強(qiáng)度增加值，以及陰性樣品的熒光強(qiáng)度增加值，選取合適的熒光強(qiáng)度增加值作為臨界閾值，設(shè)定本例檢測(cè)方法的判定標(biāo)準(zhǔn)。6.rt-rpa方法特異性試驗(yàn)以提取的h3n2、h4n9、h5n1、h6n2、低致病性h7n9、高致病性h7n9、h9n2、h11n9和h1n1亞型和新城疫病毒的rna為模板，采用篩選的引物對(duì)和探針，以及優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行h7亞型禽流感病毒rpa特異性檢測(cè)。7.rt-rpa方法靈敏性試驗(yàn)本例將提取到的低致病性h7亞型禽流感病毒核酸作8個(gè)10倍系列稀釋?zhuān)偌由详幮詫?duì)照的h5亞型禽流感病毒核酸，共計(jì)9個(gè)樣品模板，采用優(yōu)化好的引物對(duì)與探針組合，配置反應(yīng)體系，并按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行h7亞型禽流感病毒rpa靈敏度檢測(cè)。其中，h7亞型禽流感病毒核酸的8個(gè)10倍系列稀釋的濃度分別為，0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml、0.00523ng/ml、0.523pg/ml、0.0523pg/ml；h5亞型禽流感病毒核酸的濃度為0.262μg/ml。同時(shí)，采用相同的9份核酸樣品作為模板，以oie推薦用引物與探針，按照其方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，比較本例的rpa方法和現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr方法兩者的檢測(cè)靈敏度。8.rt-rpa方法的初步應(yīng)用采集來(lái)自多地養(yǎng)殖場(chǎng)、活禽交易市場(chǎng)的雞泄殖腔拭子和咽拭子30份，以及標(biāo)準(zhǔn)毒株5份，分別采用oie推薦用引物與探針，和本例的rpa檢測(cè)方法，對(duì)采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者的符合性。三、結(jié)果1.引物對(duì)和探針的篩選將設(shè)計(jì)好的引物采取兩兩搭配的方式組合，篩選出快速敏感的最佳引物對(duì)和探針，本例的篩選結(jié)果顯示，在相同的條件下，h7-991-f-1和h7-1119-r2-1引物對(duì)，配合h7-1026-p-1探針，其敏感度最高，即在相同的時(shí)間點(diǎn)，熒光增量更大。2.最佳反應(yīng)條件的確定(1)不同反應(yīng)溫度rpa試驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)溫度設(shè)置為38℃時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表2，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。表2h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為38℃時(shí)的熒光值結(jié)果表2中，熒光值1為相應(yīng)時(shí)間下h7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.523μg/ml時(shí)檢測(cè)的熒光值，熒光值1后面對(duì)應(yīng)的熒光增量，即在相應(yīng)時(shí)間下，熒光值1相對(duì)于恒溫反應(yīng)前5min各點(diǎn)熒光值的平均值的增量。熒光值2、3、4、5依序?yàn)閔7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml的熒光值。以下表3至表6都與表2相同。反應(yīng)溫度設(shè)置為39℃時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表3，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。表3h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為39℃時(shí)的熒光值結(jié)果反應(yīng)溫度設(shè)置為40℃時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表4，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。表4h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為40℃時(shí)的熒光值結(jié)果反應(yīng)溫度設(shè)置為41℃時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表5，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。表5h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為41℃時(shí)的熒光值結(jié)果反應(yīng)溫度設(shè)置為42℃時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表6，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。表6h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法反應(yīng)溫度為42℃時(shí)的熒光值結(jié)果本例選取0.0523ng/ml濃度陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增效率來(lái)選擇最優(yōu)的反應(yīng)溫度，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，0.0523ng/ml濃度的h7亞型禽流感病毒核酸樣品在反應(yīng)溫度設(shè)置為41℃時(shí)，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分?jǐn)?shù)更大。因此，本例建立的檢測(cè)h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法的最佳反應(yīng)程序?yàn)椋簩⑴渲煤玫姆磻?yīng)體系放入溫度設(shè)置為41℃的t-16儀器中反應(yīng)5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，迅速置于離心機(jī)上2000rpm/min，離心30s，再放入t-16儀器中，繼續(xù)在41℃下反應(yīng)15min。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程全程收集fam熒光。(2)不同光源強(qiáng)度下的rpa試驗(yàn)結(jié)果本例將led燈fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為12％時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表7，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。表7h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法熒光強(qiáng)度為12％時(shí)的熒光值結(jié)果表7中，熒光值1為相應(yīng)時(shí)間下h7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.0523μg/ml時(shí)檢測(cè)的熒光值，熒光值1后面對(duì)應(yīng)的熒光增量，即在相應(yīng)時(shí)間下，熒光值1相對(duì)于恒溫反應(yīng)前5min各點(diǎn)熒光值的平均值的增量。熒光值2、3、4、5依序?yàn)閔7亞型禽流感病毒核酸濃度為5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml的熒光值。以下表8至表12都與表7相同。將led燈fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為16％時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表8，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。表8h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法熒光強(qiáng)度為16％時(shí)的熒光值結(jié)果將led燈fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為20％時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表9，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。表9h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法熒光強(qiáng)度為20％時(shí)的熒光值結(jié)果將led燈fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為24％時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表10，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。表10h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法熒光強(qiáng)度為24％時(shí)的熒光值結(jié)果將led燈fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為28％時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表11，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖10。表11h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法熒光強(qiáng)度為28％時(shí)的熒光值結(jié)果將led燈fam通道的熒光強(qiáng)度設(shè)置為32％時(shí)，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時(shí)的實(shí)時(shí)熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗(yàn)具體結(jié)果見(jiàn)表12，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖11。表12h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測(cè)方法熒光強(qiáng)度為32％時(shí)的熒光值結(jié)果本文選取0.0523ng/ml和0.00523ng/ml濃度陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增效率來(lái)綜合分析fam熒光通道光源強(qiáng)度的最優(yōu)設(shè)置，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，0.0523ng/ml濃度樣品在熒光強(qiáng)度設(shè)置時(shí)，fam通道強(qiáng)度占led光源強(qiáng)度的28％時(shí)，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分?jǐn)?shù)更大；而0.00523ng/ml濃度樣品在熒光強(qiáng)度設(shè)置時(shí)，fam通道強(qiáng)度占led光源強(qiáng)度的32％時(shí)，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分?jǐn)?shù)更大，但0.0523ng/ml濃度樣品在熒光強(qiáng)度設(shè)置時(shí)，fam通道強(qiáng)度占led光源強(qiáng)度的32％時(shí)，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分?jǐn)?shù)出現(xiàn)降低。綜合分析，本文在建立檢測(cè)h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法時(shí)，fam熒光通道光源強(qiáng)度設(shè)置成28％為最佳。3.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取最佳反應(yīng)條件及設(shè)置，其中最佳反應(yīng)溫度為41℃，fam通道強(qiáng)度設(shè)置為占led光源強(qiáng)度28％時(shí)，按熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％計(jì)算出圖4和圖10中最低濃度陽(yáng)性樣品的最大熒光增加值為63％和53％，其中圖4增加值超過(guò)55％時(shí)持續(xù)時(shí)間為2分鐘。另外，在后續(xù)的應(yīng)用試驗(yàn)中，本例采集的30份陰性雞咽拭子樣品，提取核酸后按最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加值均低于15％，因此本例將試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：試驗(yàn)5分鐘后的采集點(diǎn)熒光值與前5分鐘采集到的各點(diǎn)熒光值的平均值之比，即熒光增量大于55％，且持續(xù)的時(shí)間超過(guò)2分鐘，則判為陽(yáng)性；否則判為陰性。4.rt-rpa方法特異性試驗(yàn)結(jié)果本例qrt-rpa試驗(yàn)特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖12，結(jié)果顯示，只有高致病性h7亞型禽流感病毒和低致病性h7亞型禽流感病毒出現(xiàn)了擴(kuò)增，其他亞型h1、h3、h4、h5、h6、h9和h11亞型流感病毒、新城疫病毒樣品未見(jiàn)有擴(kuò)增。5.rt-rpa方法靈敏性試驗(yàn)結(jié)果本例qrt-rpa試驗(yàn)靈敏性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖13，結(jié)果顯示，本例建立的檢測(cè)h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.00523ng/ml。取相同的9個(gè)核酸樣品，采用oie推薦用引物、探針和實(shí)時(shí)熒光pcr方法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖14，結(jié)果顯示，oie推薦的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)0.00523ng/ml。可見(jiàn)，本例的用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的引物對(duì)和探針，及rpa檢測(cè)方法，與目前使用的oie推薦的實(shí)時(shí)熒光pcr方法相比，靈敏度相當(dāng)，而本例的rpa檢測(cè)方法所用的時(shí)間大大縮短，所需設(shè)備也簡(jiǎn)便，適合于野外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。6.rt-rpa檢測(cè)方法田間樣本應(yīng)用本例對(duì)采集的30份雞泄殖腔拭子和咽拭子，以及5份標(biāo)準(zhǔn)毒株，分別采用oie推薦的引物與探針，和本例的rpa檢測(cè)方法，進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩個(gè)檢測(cè)方法的結(jié)果一致，30份雞泄殖腔拭子和咽拭子為陰性，5份標(biāo)準(zhǔn)毒株為陽(yáng)性?？梢?jiàn)，本例的rpa檢測(cè)方法可以替代現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本申請(qǐng)所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本申請(qǐng)的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本申請(qǐng)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本申請(qǐng)構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請(qǐng)的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>用于h7亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑、檢測(cè)方法和應(yīng)用<130>17i24394<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>31<212>dna<213>人工序列<400>1gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc31<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<400>2gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc32<210>3<211>52<212>dna<213>人工序列<400>3gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa52<210>4<211>39<212>dna<213>人工序列<400>4gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatcaattagg39<210>5<211>34<212>dna<213>人工序列<400>5gtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatg34<210>6<211>54<212>dna<213>人工序列<400>6ctaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctataatagtatgggggatcc54<210>7<211>36<212>dna<213>人工序列<400>7cccaactgtcaccagtttgtttccactcccatatag36<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列<400>8cccaactgtcaccagtttgtttccactccc30<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<400>9ggcaatgcaaaatagaatacagattg26<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10cccagtcaaactaagcagcggc22<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11ccccgaagctaaaccaaagtatc23當(dāng)前第1頁(yè)12