本發(fā)明聚焦于運(yùn)用生物轉(zhuǎn)化手段，以一碳化合物作為起始原料來生產(chǎn)l-絲氨酸的工程菌構(gòu)建方法及其實際應(yīng)用，屬于基因工程。

背景技術(shù)：

1、l-絲氨酸（l-serine）是一種功能多樣且應(yīng)用廣泛的生物基化學(xué)品，在制藥、化妝品、食品及精細(xì)化工等多個領(lǐng)域具有較高市場價值和廣闊市場前景。它不僅是蛋白質(zhì)和磷脂合成的關(guān)鍵前體，還參與一碳代謝、神經(jīng)遞質(zhì)合成以及免疫調(diào)節(jié)等生理過程，因此在醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)和生物材料等方面?zhèn)涫荜P(guān)注。傳統(tǒng)上，l-絲氨酸的生產(chǎn)主要依賴于化學(xué)合成或蛋白水解法，但這些方法通常存在原料成本高、工藝復(fù)雜、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。近年來，隨著合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)的快速發(fā)展，以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)l-絲氨酸成為研究熱點(diǎn)。研究人員通過改造大腸桿菌（ escherichia?coli）和谷氨酸棒桿菌（ corynebacterium?glutamicum），優(yōu)化糖代謝途徑、增強(qiáng)絲氨酸合成能力、減少副產(chǎn)物積累，并利用可再生原料（如葡萄糖、木糖等）作為碳源，成功構(gòu)建了高效的l-絲氨酸生產(chǎn)菌株。然而，盡管近年來在菌株改造和工藝優(yōu)化方面取得了一定進(jìn)展，但現(xiàn)有發(fā)酵體系仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，如前體供給受限、代謝流分配不均衡、產(chǎn)物毒性影響細(xì)胞生長以及底物利用效率不高等。這些因素導(dǎo)致l-絲氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量和得率仍難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，限制了該技術(shù)的進(jìn)一步推廣與應(yīng)用。

2、與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法、蛋白水解法和微生物發(fā)酵法相比，生物酶催化法因其反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于手性化學(xué)品的工業(yè)生產(chǎn)，尤其是在醫(yī)藥中間體和精細(xì)化學(xué)品領(lǐng)域。該方法依賴于高效酶催化反應(yīng)，以減少副產(chǎn)物生成，提高目標(biāo)產(chǎn)物的收率，同時降低環(huán)境污染，被認(rèn)為是一種綠色可持續(xù)的生物制造策略。目前，l-絲氨酸的生物合成過程中涉及的關(guān)鍵酶主要是絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（shmt）。該酶催化的反應(yīng)較為復(fù)雜，不僅需要磷酸吡哆醛（plp）作為輔酶，還依賴于四氫葉酸（thf）作為一碳供體共同參與反應(yīng)，以實現(xiàn)甘氨酸到l-絲氨酸的轉(zhuǎn)化。這一過程的多組分依賴性使得酶促體系較為復(fù)雜，增加了底物和輔因子的消耗，從而提高了生產(chǎn)成本。此外，產(chǎn)物的分離純化也受到影響，進(jìn)一步限制了該方法在工業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。在其中一個替代嘗試案例中，山東大學(xué)馬翠卿團(tuán)隊設(shè)計并構(gòu)建了一種高效的體外酶級聯(lián)反應(yīng)體系，實現(xiàn)了從甘油高選擇性地合成l-絲氨酸，涉及到的酶包括醛糖醇氧化酶、d-乳酸脫氫酶、l-丙氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶以及過氧化氫酶等。在優(yōu)化各個酶的投量比例后，該體系以18.51?mm甘油為底物，成功合成了17.58?mml-絲氨酸，顯示出較高的底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物收率[guo?s,?et?al.?enhancedl-serine?production?from?glycerol?by?integration?with?thermodynamicallyfavorable?d-glycerate?oxidation.?acs?sustainable?chemistry&engineering,?2022,10(8):?2587-2592.]。因此，開發(fā)一種更加簡便、高效且經(jīng)濟(jì)可行的l-絲氨酸生產(chǎn)方法仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的首要目的在于提供一種基因工程菌株及其應(yīng)用，該菌株能夠利用一碳化合物作為原料高效轉(zhuǎn)化合成l-絲氨酸。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供構(gòu)建和獲得上述基因工程菌株的方法。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)思路實現(xiàn)，利用商業(yè)化重組表達(dá)載體，將源自不同微生物來源的醇氧化酶和醛縮酶進(jìn)行串聯(lián)組合，通過誘導(dǎo)表達(dá)和測試篩選后，獲得具有優(yōu)異催化合成能力的基因工程菌株。

3、本發(fā)明首先提供利用一碳化合物原料合成l-絲氨酸的工程菌，其在出發(fā)菌中同時導(dǎo)入醇氧化酶和醛縮酶，所述出發(fā)菌是本身能夠產(chǎn)生l-絲氨酸的大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌。

4、具體地，所述的醇氧化酶來源于 phanerodontia?chrysosporium，或者 aspergillus?japonicus,?或者 neurospora?tetrasperma，或者 gloeophyllum?trabeum,或者 collybiopsis?luxurians,或者 ogataea?thermomethanolica；

5、所述的醛縮酶來源于 geobacter?sulfurreducens，或者 caulobacter? vibrioides，或者 aeromonas?jandaei，或者 sphaerobacter?thermophilus，或者 thermus? thermophilus,或者 natranaerobius?thermophilus。

6、更具體地，所述的醇氧化酶是pcaox，其genbank登錄號為cdg66232.1，或者ajaox，其genbank登錄號為?rah81525.1,?或者ntaox，其genbank登錄號ego55033.1，或者gtaox，其genbank登錄號為abi14440.1,或者claox，其genbank登錄號為kik62555.1,或者otaox，其genbank登錄號為ahc95541.1；

7、?所述的醛縮酶是gsta，其genbank登錄號為aar36798.1，或者是cvta，其genbank登錄號為aak25055.1，或者是ajta，其genbank?登錄號為baa20404.1，或者是stta，genbank登錄號為acz39765.1，或者是ttta，其genbank登錄號為aas80745.1,或者是ntta，其genbank登錄號為acb84140.1。

8、優(yōu)選地，所述的醇氧化酶是gtaox，且所述的醛縮酶是ajta；

9、所述的醇氧化酶是claox，且所述的醛縮酶是gsta；

10、所述的醇氧化酶是otaox，且所述的醛縮酶是stta；

11、所述的醇氧化酶是ntaox，且所述的醛縮酶是stta；

12、所述的醇氧化酶是otaox，且所述的醛縮酶是cvta。

13、本發(fā)明也提供所述的工程菌的構(gòu)建方法，其采用同時表達(dá)所述醇氧化酶的編碼基因和所述醛縮酶的編碼基因的一個質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)菌；或者將分別表達(dá)所述醇氧化酶的編碼基因和所述醛縮酶的編碼基因的質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)菌。

14、具體地，所述醇氧化酶的編碼基因和所述醛縮酶的編碼基因根據(jù)導(dǎo)入的出發(fā)菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化；啟動基因表達(dá)的啟動子是誘導(dǎo)型t7強(qiáng)啟動子或者tac強(qiáng)啟動子。

15、更具體地，所述質(zhì)粒的骨架是pet21b表達(dá)載體或pxmj19表達(dá)載體，相應(yīng)的出發(fā)菌為大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。

16、在具體實施方式中，對于同時表達(dá)所述醇氧化酶的編碼基因和所述醛縮酶的編碼基因的一個質(zhì)粒，采用一個啟動子和所述醇氧化酶的編碼基因與醛縮酶的編碼基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，其中兩種基因之間包括保守性rbs序列。

17、本發(fā)明提供所述的工程菌的在制備l-絲氨酸中的應(yīng)用。具體地，所述應(yīng)用包括如下步驟：培養(yǎng)所述工程菌，以產(chǎn)生l-絲氨酸的步驟；分離或純化所產(chǎn)生的l-絲氨酸的步驟。

18、本發(fā)明尤其提供一種基于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化利用一碳化合物原料合成l-絲氨酸的方法，其特征在于，采用所述的工程菌的全細(xì)胞作為催化劑，以甘氨酸和甲醇為底物，催化反應(yīng)生成l-絲氨酸。

19、具體地，在100?ml計的磷酸鹽緩沖體系中，添加終濃度65-75?g/l的甘氨酸底物，終濃度0.10-0.15?g/l的磷酸吡哆醛，添加終濃度0.8-1.2?mol/l的甲醇底物,加入20-40g/l所述全細(xì)胞催化劑，控制轉(zhuǎn)速100-200r/min，設(shè)置溶氧不低于25%，催化反應(yīng)ph?6-8，催化反應(yīng)時間20-40h。

20、本發(fā)明有益效果在于提供了一種以一碳化合物作為原料合成l-絲氨酸的基因工程菌株，能夠在無需四氫葉酸輔酶參與的情況下，將甲醇和甘氨酸底物高效轉(zhuǎn)化為具有高附加值l-絲氨酸，為l-絲氨酸的高效生產(chǎn)開辟了新路徑，具有更好的工業(yè)化應(yīng)用前景。