專利名稱:產(chǎn)l－半胱氨酸細菌及生產(chǎn)l－半胱氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法，更進一步說涉及一種新的適合于生產(chǎn)L-半胱氨酸的棒狀桿菌及利用該細菌生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法。L-半胱氨酸和L-半胱氨酸的衍生物可以用于藥品領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域及食品領(lǐng)域。
關(guān)于細菌的L-半胱氨酸的生物合成已被詳細的研究，所述細菌例如埃希氏大腸桿菌(Kredich，N.M.等，生化雜志(J.Biol.Chem.)241，4955-4965(1966)；Kredich，N.M.等，1987，半胱氨酸的生物合成，在Neidhardt，F(xiàn).C.等編著的細胞及分子生物學(xué)中，第1卷，埃希氏大腸桿菌及鼠傷寒沙門氏菌，美國微生物學(xué)會，華盛頓特區(qū)，419-428(Neidhardt，F(xiàn).C.，et al.(eds)，Escherichia coli and SalmonellatyphimuriumCellular and Molecular Biology，Vol.1，American Society forMicrobiology，Washington D.C.))，已經(jīng)闡明L-半胱氨酸是由L-絲氨酸經(jīng)過兩步反應(yīng)而產(chǎn)生的。在埃希氏大腸桿菌中，第一步反應(yīng)是乙酰輔酶A對L-絲氨酸的活化反應(yīng)，該反應(yīng)是用絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.30，下文簡稱”SAT”)催化的，第二步反應(yīng)是由上述反應(yīng)生產(chǎn)的O-乙?；z氨酸生產(chǎn)L-半胱氨酸的反應(yīng)，該反應(yīng)是用O-乙酰基絲氨酸(硫羥基)裂解酶催化的。
而且，已經(jīng)弄清楚，在埃希氏大腸桿菌中，L-半胱氨酸的降解會因為半胱氨酸脫巰基酶(下文簡稱“CD”)活性的降低而受到抑制(日本專利特開平No.11-155571)。
在埃希氏大腸桿菌中，編碼SAT的基因(cysE)已經(jīng)從野生菌和分泌L-半胱氨酸的突變菌中克隆出來(Denk，D.和Boeck，A.，普通微生物學(xué)(J.GeneralMicrobiol.)，133，515-525(1987))。而且這些cysE的核苷酸序列已經(jīng)被測定，有報道表明在SAT中其第256位的甲硫氨酸殘基被異亮氨酸殘基所取代，L-半胱氨酸對其的反饋抑制作用是減弱的。此外，也有文章披露了用編碼SAT的DNA來生產(chǎn)L-半胱氨酸及其類似物的方法，其中所用的SAT基因通過引入與上文不同的突變來減弱L-半胱氨酸的反饋抑制作用(國際公開號為WO97/15673)。這種SAT在第97位到第273位氨基酸區(qū)域內(nèi)有一個突變，或者在第227位點的氨基酸之后有一C-末端區(qū)域的缺失。
盡管已知如上所述通過利用L-半胱氨酸對其反饋抑制作用被減弱的SAT的編碼基因來生產(chǎn)L-半胱氨酸的技術(shù)，該申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，屬于含有L-半胱氨酸對其的反饋抑制作用被減弱的SAT的這類埃希氏桿菌屬的細菌L-半胱氨酸的產(chǎn)量并不穩(wěn)定。但是他們還發(fā)現(xiàn)這種不穩(wěn)定是能夠被克服的，比如，通過降低細胞內(nèi)CD的活性，能夠使其產(chǎn)量變得穩(wěn)定。他們還成功地獲得了一種能夠穩(wěn)定地生產(chǎn)L-半胱氨酸的埃希氏大腸桿菌菌株(日本專利特開平NO.11-155571)。
進一步地，還披露了一種通過使用微生物，特別是埃希氏大腸桿菌，來生產(chǎn)L-半胱氨酸等物質(zhì)的方法，其過量表達一種適合于從細胞中排出抗生素或其他有毒物質(zhì)的某種蛋白的編碼基因(排泄基因)(日本專利NO.29920110)。
另一方面，和對于谷氨酸棒狀桿菌一樣，aecD基因已經(jīng)被證明為是使S-(β-氨基乙基)-半胱氨酸(AEC)具有抗性的基因(Rossol，I等，細菌雜志(J.Bacteriol.)，174(9)，2968-2977(1992))。已經(jīng)明，aecD基因不是生長所必需的，只有在其擴增時在AEC抗性中涉及，這種基因所編碼的蛋白質(zhì)，在底物為AEC、半胱氨酸或其類似物時，具有C-S裂解酶活性。Rossol等人注意到這一事實，裂解酶能夠催化消除反應(yīng)，還能像合成酶一樣催化反向合成反應(yīng)，從而提出一種含硫氨基酸的新的酶促合成途徑。但是，由于利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)含硫氨基酸的成功例子非常少見，因此他們只給出了一種，可能利用C-S裂解酶的反向反應(yīng)的酶促合成方法。
如上所述，培養(yǎng)埃希氏桿菌屬的L-半胱氨酸生產(chǎn)菌已有了很多報道，與谷氨酸棒狀桿菌的L-半胱氨酸降解有關(guān)的酶也有了相當深度的報道，但是，尚無一例是關(guān)于利用棒狀桿菌發(fā)酵到一定程度可以從培養(yǎng)基中收集L-半胱氨酸來生產(chǎn)L-半胱氨酸的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在上文提到的現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上完成的。目的是提供一種具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌及利用該細菌生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法。
本發(fā)明的發(fā)明者為了達到上文提到的目的作了艱苦的研究工作。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)，通過增加細胞內(nèi)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能夠給予棒狀桿菌生產(chǎn)L-半胱氨酸的能力。他們還發(fā)現(xiàn)，通過抑制L-半胱氨酸降解系統(tǒng)，L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力還可以被增強，進而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供如下(1)一種具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌。
(2)根據(jù)(1)的棒狀桿菌，其被修飾使得增強細胞內(nèi)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
(3)根據(jù)(2)的棒狀桿菌，其中通過攜帶L-半胱氨酸對其反饋抑制作用被減弱的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶來提高細胞內(nèi)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
(4)根據(jù)(3)的棒狀桿菌，其中L-半胱氨酸對其反饋抑制作用被減弱的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶包含一個突變相應(yīng)于野生型絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶第256位的甲硫氨酸殘基被賴氨酸和亮氨酸之外的氨基酸殘基所取代，或者一個突變?nèi)笔鄳?yīng)于野生型絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶第256位甲硫氨酸殘基處氨基酸殘基開始的C-末端區(qū)。
(5)根據(jù)(2)至(4)之一的棒狀桿菌，其中通過增加絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的表達量，來提高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
(6)根據(jù)(5)的棒狀桿菌，其中通過用編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因轉(zhuǎn)化，或者通過細菌細胞內(nèi)編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因的表達調(diào)控中涉及的表達調(diào)控序列或基因的修飾使得該基因的表達增強來增強細胞內(nèi)的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
(7)根據(jù)(5)的棒狀桿菌，其中絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因是屬于埃希氏桿菌屬細菌的cysE基因。
(8)根據(jù)(1)至(6)之一的棒狀桿菌，其中L-半胱氨酸降解系統(tǒng)被進一步抑制。
(9)根據(jù)(8)的棒狀桿菌，其中通過細胞內(nèi)半胱氨酸脫巰基酶活性降低，而使L-半胱氨酸降解系統(tǒng)受到抑制。
(10)根據(jù)(9)的棒狀桿菌，其中通過破壞aedD基因，而使細胞內(nèi)半胱氨酸脫巰基酶活性降低。
(11)一種生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(1)到(10)中的任一種棒狀桿菌來生產(chǎn)并且在培養(yǎng)物中積累L-半胱氨酸，及從培養(yǎng)物中收集L-半胱氨酸。
本發(fā)明中，L-半胱氨酸生產(chǎn)能力指細菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中積累的L-半胱氨酸的量能達到可以從培養(yǎng)基中收集L-半胱氨酸的水平的本發(fā)明細菌的能力。在本發(fā)明所提到的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的范圍內(nèi)，在細胞的生長不降低的前提下，L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力達到一定水平。
“L-半胱氨酸降解系統(tǒng)的抑制”是指至少一種與半胱氨酸降解有關(guān)的酶被減少或被去除。“反饋抑制的減弱”是指反饋抑制被完全消除或只保留較弱的反饋抑制。在本發(fā)明中，若沒有特殊說明，L-半胱氨酸是指還原L-半胱氨酸、L-胱氨酸或其混合物。
由于本發(fā)明的棒狀桿菌有L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力，因此可以用作發(fā)酵生產(chǎn)L-半胱氨酸的材料，進而培育出產(chǎn)L-半胱氨酸的細菌。
具體實施方式
下文，將詳細解釋本發(fā)明。<1>本發(fā)明的棒狀桿菌本發(fā)明細菌是一種具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌。在本發(fā)明中，“棒狀桿菌”包括那些曾經(jīng)被分類到短桿菌屬，現(xiàn)在又合并到棒狀桿菌屬的那些細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，也包括那些屬于短桿菌屬但和棒狀桿菌親緣關(guān)系較近的細菌，比如以下棒狀桿菌嗜乙酰乙酸棒狀桿菌(corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒狀桿菌(corynebacterium acetoglutamicum)corynebacterium alkanolyticum頸棒狀桿菌(corynebacterium callunae)谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium glutamicum)百合棒狀桿菌(corynebacterium lillium)corynebacterium melassecolacorynebacterium thermoaminogenes
力士棒狀桿菌(corynebacterium herculis)谷氨酸棒桿菌(Brevibacterium divaricatum)黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)Brevibacterium immariophilum乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)Brevibacterium albumBrevibacterium cerium嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)特別的，還比如下列菌株嗜乙酰乙酸棒狀桿菌(corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870醋谷棒狀桿菌(corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511頸棒狀桿菌(corynebacterium callunae)ATCC 15911谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium glutamicum)ATCC 13020，13032百合棒狀桿菌(corynebacterium lillium)ATCC 15990Corynebacterium melassecola ATCC 17965Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)力士棒狀桿菌(corynebacterium herculis)ATCC 13868谷氨酸棒桿菌(Brvibacterium divaricatum)ATCC 14020黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 13826，ATCC 14067，AJ12418(FERM BP-2205)Brevibacterium immariophilum ATCC 14068乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)ATCC 13825解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC 14066生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)ATCC 19240
產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)ATCC 6871，ATCC6872Brevibacterium album ATCC 15111蠟狀短桿菌(Brevibacterium cerinum)ATCC 15112嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilus)ATCC 15354有些地方可以提供以上菌株，比如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，美國)。在那里，每一種菌株都有它的登記號，根據(jù)登記號能獲得所要的菌株。菌株的登記號都列在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中。AJ12340菌株于1987年10月27日保藏在，通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(NIBH)(現(xiàn)在是，獨立行政公司，國家高級科技學(xué)院，國際專利生物保藏中心，Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，郵編305-8566)，為布達佩斯條約規(guī)定的一個國際保藏組織，獲得的登記號為FERMBP-1539。AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在，布達佩斯條約微生物國際保藏單位，通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(NIBH)，獲得保藏登記號為FERM BP-2205。
本發(fā)明細菌的第一個實施方案是一種具有提高細胞內(nèi)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的棒狀桿菌。
“修飾以使細胞內(nèi)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(以下簡稱為“SAT”)活性提高”的意思是指每個細胞中的SAT的活性比沒有修飾過的細菌，比如野生棒狀桿菌，中的SAT的活性更高。例如每個細胞中的SAT分子數(shù)增加、每一個SAT分子的SAT活性增強等。把谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032和野生型棒狀桿菌比較，由于提高了細胞內(nèi)SAT的活性，棒狀桿菌中L-半胱氨酸的產(chǎn)量也隨著提高。
為了提高棒狀桿菌細胞中SAT活性，可以增加細胞內(nèi)SAT編碼基因的拷貝數(shù)。例如，把SAT編碼基因片段與細菌中的功能性載體優(yōu)選多拷貝型載體相連，構(gòu)建成一個重組DNA，再把該重組體導(dǎo)入到宿主棒狀桿菌中轉(zhuǎn)化。
作為SAT基因，任何來自棒狀桿菌和其他生物體，比如埃希氏桿菌屬細菌的基因都可以被使用。除野生型的SAT基因以外，在不喪失對L-絲氨酸和乙酰輔酶A催化活性的情況下，SAT基因可以是編碼具有一個氨基酸位點被替換、缺失、插入的蛋白質(zhì)的DNA序列，也可以是編碼具有一個或幾個氨基酸位點發(fā)生倒位、異位的蛋白質(zhì)的DNA序列。
在埃希氏大腸桿菌中，編碼SAT的cycE基因已經(jīng)從野生菌和分泌L-半胱氨酸的突變菌中被克隆出來(Denk，D.和Boeck，A.，J.GeneralMicrobiol.，133，515-525(1987))。于是，基于其核苷酸序列設(shè)計的引物，以棒狀桿菌基因組DNA為模板(參考日本專利特開平NO.11-155571)，利用PCR方法(聚合酶鏈反應(yīng)，參考White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989))而獲得SAT基因。其他微生物的編碼SAT的基因也可以通過同樣的方法獲得。
染色體DNA可以從DNA供體細菌中制備，例如運用Saito和Miura所提供的方法(參考H.Saito和K.Miura，生物化學(xué).生物物理年鑒(Biochem.Biophys.Acta)，72，619(1963)，生物工程實驗教科書(Text for BioengineeringExperiments)，日本生物科學(xué)及生物工程學(xué)會編pp，97-98，Baifukan，1992)。
如果把通過PCR方法擴增得到的SAT基因與一種能在埃希氏大腸桿菌或/和棒狀桿菌中自主復(fù)制的載體連接，構(gòu)建出重組DNA，然后把該重組DNA導(dǎo)入埃希氏大腸桿菌，后面的工作變得容易了。例如能在埃希氏大腸桿菌中自主復(fù)制的載體包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184、pMW219等等。
在棒狀桿菌中產(chǎn)生作用的載體可以是在棒狀桿菌中能自主復(fù)制的質(zhì)粒，特別的包括如下質(zhì)粒pAM330(參考日本專利No.58-67699)pHM1519(參考日本專利No.58-77859)pSFK6(參考日本專利No.2000-26288)而且，假如把一個使質(zhì)粒具有在棒狀桿菌中自主復(fù)制能力的DNA片段從載體中分離出來，再插入到前文提到的轉(zhuǎn)化埃希氏大腸桿菌的載體中，這種載體就可以被用來作為穿梭載體，在埃希氏大腸桿菌和棒狀桿菌中都能夠自主復(fù)制。
下文列出了這樣的一些穿梭載體及其宿主微生物，在圓括號中分別給出了這些這些載體在國際保藏單位中的登記號。
pAJ655 埃希氏大腸桿菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒狀桿菌SR8201(ATCC39135)pAJ1844 埃希氏大腸桿菌AJ11883(FERM BP-137)
谷氨酸棒狀桿菌SR8202(ATCC39136)pAJ611 埃希氏大腸桿菌AJ11884(FERMBP-138)pAJ3148 谷氨酸棒狀桿菌SR8203(ATCC39137)pAJ440 枯草芽孢桿菌AJ11901(FERMBP-140)pHC4 埃希氏大腸桿菌AJ12617(FERM BP-3532)另外，在實施例中描述的質(zhì)粒pVK7(參考日本專利特開平No.11-266881)也適合于作為埃希氏大腸桿菌和棒狀桿菌的穿梭載體。
這些載體也可以從如下被保藏的微生物中獲得。即，通過使用溶菌酶和SDS溶胞收集處于指數(shù)生長期的微生物細胞，以30000xg離心，往獲得的上清液中加入聚乙二醇，然后用氯化銫-溴化乙啶等密度梯度離心分離和純化。
為了通過SAT基因與在棒狀桿菌細胞中能起作用的載體連接，構(gòu)建一個重組DNA，載體借助于一個與SAT基因末端相對應(yīng)的限制酶消化。連接酶一般使用T4DNA連接酶。
把上述重組DNA導(dǎo)入微生物細胞中可以用目前已公開的所有的轉(zhuǎn)化方法。例如，用氯化鈣處理感受態(tài)細胞以增強細胞對DNA的通透性，運用這種方法轉(zhuǎn)化埃希氏大腸桿菌K-12取得成功(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物學(xué)(J.Mol.Biol).，53，159(1970))。也可以把處于生長期的待轉(zhuǎn)化的細胞與重組DNA一起培養(yǎng)，有報道證明用這種方法已成功轉(zhuǎn)化了枯草芽孢桿菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.，基因(Gene)，1，153(1977))。除上述方法以外，也可以把感受態(tài)細胞處理成容易吸收重組DNA的去壁細胞或原生質(zhì)體，然后把重組DNA導(dǎo)入受體細胞，這種方法已被用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌、放線菌及酵母菌(Chang，S.和Choen，S.N.，分子遺傳學(xué)(Molec.Gen，Genet.)，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，自然(Nature)，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Sci.USA)，75.1929(1978))。利用電穿孔法也成功轉(zhuǎn)化了棒狀桿菌(Sugimoto等，日本專利特開No.2-207791)。
增加SAT基因的拷貝數(shù)可以通過向棒狀桿菌染色體DNA中導(dǎo)入多個SAT基因拷貝來實現(xiàn)。為了將SAT基因的多個拷貝導(dǎo)入棒狀桿菌染色體DNA，對作為靶物存在于染色體DNA中的多拷貝序列進行同源重組?？梢允褂米鳛榇嬖谟谌旧wDNA中的多拷貝，重復(fù)DNA序列，存在于轉(zhuǎn)座因子末端的反向重復(fù)序列。也可以像日本專利特開No.2-109985所公開的一樣，把SAT基因插入轉(zhuǎn)座子中，使它們一起被轉(zhuǎn)移，從而將基因的多拷貝導(dǎo)入染色體DNA。
除了上文描述的基因擴增技術(shù)外，提高SAT的活性還可以通過更換質(zhì)?；蛉旧wDNA中的比較強的SAT基因的表達調(diào)控序列來實現(xiàn)(參考日本專利特開No.1-215280))。強啟動子如lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子等。表達調(diào)控序列的置換還可用例如熱敏感性質(zhì)?；蛉〈?，例如以棒狀桿菌為宿主熱敏感性質(zhì)粒包括p48K、pSFKT2、pSFKT3、pSFKT4、pSFKT5和pSFKT6(參考日本專利特開No.2000-262288)，pHSC4(參考法國專利公開號為No.2667875,1992和日本專利特開No.5-7491)等等。另外，正如國際公開號為WO00/18935的專利文件公開了通過替換SAT基因啟動子區(qū)的幾個核苷酸而使該啟動子變?yōu)閺妴幼印Ｍㄟ^這樣的替換或修飾啟動子，SAT基因的表達能得到提高，SAT的活性也就得到提高。修飾表達調(diào)控序列可以和增加SAT基因的拷貝數(shù)聯(lián)合使用。
此外當SAT基因的表達過程中存在抑制機制時，也可以通過修飾表達調(diào)控序列或與抑制有關(guān)的基因增強表達基因以消除或減弱抑制。
通過產(chǎn)生包含L-半胱氨酸對其反饋抑制作用被減弱的SAT的棒狀桿菌(后文也稱為“突變SAT”)，也可以提高棒狀桿菌細胞內(nèi)SAT活性。突變SAT包含一個突變，即在野生型SAT點位相對應(yīng)的甲硫氨酸的氨基酸殘基被賴氨酸殘基和亮氨酸殘基之外的氨基酸殘基所代替的突變，或缺失以下氨基酸殘基處開始的C-末端區(qū)域的突變，該氨基酸殘基是與野生型SAT點位相應(yīng)的甲硫氨酸。除賴氨酸殘基和亮氨酸殘基外的氨基酸殘基的例子包括構(gòu)成常規(guī)蛋白質(zhì)的氨基酸中除甲硫氨酸殘基，賴氨酸殘基和亮氨酸殘基之外的17種氨基酸，更特別地，可以提到異亮氨酸殘基。
除了前文提到的L-半胱氨酸減弱反饋抑制的突變外，本發(fā)明使用的突變SAT可以是具有包括一個或幾個氨基酸殘基被替換、缺失、插入，增加，或倒位的基本上不降低乙酰輔酶催化L-絲氨酸激活活性的氨基酸序列的突變SAT。在具有這樣的突變的SAT中，256位點處的甲硫氨酸殘基位點是可以改變的。即使在這樣一種情況下，L-半胱氨酸對其反饋抑制被減弱的突變SAT，可以通過用除賴氨酸殘基和亮氨酸殘基之外的氨基酸殘基置換相應(yīng)于在256位點的甲硫氨酸殘基的氨基酸殘基來得到。
可以通過向細胞內(nèi)SAT基因?qū)脒@樣一個突變來構(gòu)建一個含有突變SAT的棒狀桿菌，該突變使得L-半胱氨酸對編碼的SAT的反饋抑制消除。導(dǎo)入突變的方法可以通過用紫外光照射處理、或者使用用于常規(guī)誘變處理的誘變劑象N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸處理。
通過將突變SAT基因?qū)氚魻顥U菌也可以構(gòu)建一個含有突變SAT基因的棒狀桿菌。突變SAT可以通過向野生型SAT基因中導(dǎo)入這樣的突變而獲得，這樣的突變使得L-半胱氨酸對編碼的SAT的反饋抑制消除，比如在野生型SAT第256位點處的甲硫氨酸殘基相對應(yīng)的氨基酸殘基用賴氨酸殘基和亮氨酸殘基之外的氨基酸殘基替代的突變，或把野生型SAT第256位甲硫氨酸殘基相對應(yīng)的氨基酸殘基開始的C-末端區(qū)缺失的突變。象把希望的變異導(dǎo)入野生型SAT基因的方法一樣，定點誘變也是一種方法。作為突變SAT基因，編碼埃希氏大腸桿菌的突變SAT的突變cysE已被公開(參考國際專利公開號為WO97/15673和日本專利特開No.11-155571)。
本發(fā)明的細菌的第二實施方案是棒狀桿菌，其中細胞內(nèi)SAT活性增強的同時，L-半胱氨酸降解系統(tǒng)受到抑制。在埃希氏大腸桿菌中，CD和胱硫醚β-裂解酶被認為是L-半胱氨酸降解有關(guān)的酶，在下文中，減弱或消除棒狀桿菌中CD活性將被詳細說明。
為了減弱或消除棒狀桿菌的細胞內(nèi)CD活性，可以用紫外光照射或用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸等誘變劑處理棒狀桿菌，從中篩選出CD活性減弱的突變株。除了誘變外，還可以利用基因裂解技術(shù)獲得CD活性減弱的棒狀桿菌。就是，能用缺失編碼CD的基因的內(nèi)部序列修飾使不產(chǎn)生正常發(fā)揮功能的CD的包括aecD基因的DNA(缺失型CD基因)轉(zhuǎn)化棒狀桿菌，結(jié)果是在缺失型CD基因和染色體上CD基因之間發(fā)生重組，使染色體上的CD基因斷裂。像這樣的利用同源重組的基因替換的基因破壞已經(jīng)被建立。有一些利用含有溫度敏感性復(fù)制起點等的質(zhì)粒、線性DNA的方法。
缺失型CD基因可以通過以下方法替換宿主染色體上的CD基因插入有溫度敏感性復(fù)制起點、突變CD基因和一個抗藥性(如抗氯霉素)標志基因的重組DNA。并用重組DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌，并使其在復(fù)制起點不能起作用的溫度下培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)化菌可以在含有藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以獲得重組DNA被整合到染色體DNA中的轉(zhuǎn)化菌株。
在上文描述的重組DNA與染色體DNA發(fā)生重組交換的轉(zhuǎn)化菌中，突變CD基因與染色體自身CD基因發(fā)生了重組，染色體CD基因和突變CD基因都被插入到染色體上，重組DNA的其他部分(載體片段、溫度敏感性復(fù)制起點、抗藥性標志)也被插入到這兩個這基因當中。在這個階段，由于正常CD基因在這種狀態(tài)下是優(yōu)勢的，轉(zhuǎn)化菌株表達正常CD蛋白。
為了使染色體DNA上僅留下缺失型CD基因，通過兩個CD基因的重組，從染色體DNA上消除該CD基因的一個拷貝和載體片段(包括溫度敏感復(fù)制起點和抗藥性標標記)。一種情況是正常的CD基因留在染色體DNA上而缺失型DNA被刪除，另一種情況相反，缺失型DNA留下而正常的CD基因從染色體DNA上被刪除。但是無論那一種情況，當細胞在溫度敏感性復(fù)制起點能起作用的溫度下培養(yǎng)時，被消除的DNA仍然可以作為質(zhì)粒駐留在細胞中，其后如果當細胞在溫度敏感性復(fù)制起點不起作用的溫度下培養(yǎng)時，質(zhì)粒中的CD基因?qū)⒑唾|(zhì)粒一起在細胞中被消除。然后用PCR、Southern雜交或其他方法篩選染色體上留有缺失型CD基因的菌株，于是就得到了含有損失型CD基因的菌株。
如下面提到的實施例中所述，通過純化具有CD活性的蛋白質(zhì)并且對該蛋白質(zhì)進行氨基酸序列測定，及克隆編碼該蛋白的基因并測序，證明了在黃色短桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中CD蛋白主要是由aecD基因編碼的。
用Kredich等發(fā)明的方法(生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，248，6187-6196(1973))測定篩選出來的菌株的細胞抽提物的CD活性，與原始菌株中的CD活性作比較，可以證實含被破壞基因的菌株或突變菌株中的CD活性被減弱或消除。
用同樣的方法，其他與L-半胱氨酸降解有關(guān)的酶活性能被減弱或消除。
已經(jīng)有文章報道，谷氨酸棒狀桿菌IR33的一種aecD破壞型菌株被成功構(gòu)建(I.Rossol & A.Puhler，細菌雜志(J.Bacteriol.)，174，2968-2977(1992))。<2>生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法如上所述，通過培養(yǎng)具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)SAT活性被提高的棒狀桿菌，或者其中培養(yǎng)基中L-半胱氨酸降解系統(tǒng)被進一步抑制以在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累L-半胱氨酸的棒狀桿菌，并且收集來自培養(yǎng)基的L-半胱氨酸，來生產(chǎn)L-半胱氨酸。
雖然用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的L-半胱氨酸除了含有還原型半胱氨酸外還含有胱氨酸，但是本發(fā)明生產(chǎn)的目的是生產(chǎn)半胱氨酸，及還原型半胱氨酸和胱氨酸的混合物。
用本發(fā)明的棒狀桿菌生產(chǎn)L-半胱氨酸，用常規(guī)的方法，使用含有碳源、氮源和礦物質(zhì)及微生物生長必須微量營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸和維生素的一般培養(yǎng)基培養(yǎng)棒狀桿菌。培養(yǎng)基可以是合成培養(yǎng)基，也可以是天然培養(yǎng)基，只要是用于培養(yǎng)菌株的，可以使用任何碳源和氮源。
作為碳源，使用糖類如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解產(chǎn)物和糖蜜，有機酸如乙酸、檸檬酸，醇類如乙醇，它們可以單獨使用，也可以與其他碳源混合使用。
作為氮源，使用氨，銨鹽如硫化銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和醋酸銨，硝酸鹽等。
作為有機微量營養(yǎng)物、氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸，使用包含這些物質(zhì)的那些，如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母抽提物、大豆蛋白降解產(chǎn)物等等。如果菌株是營養(yǎng)缺陷型，其生長需要一種氨基酸或其類似物質(zhì)，優(yōu)選提供所需要的營養(yǎng)。
作為礦物鹽，使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳等。
培養(yǎng)采用通氣培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在20-45℃，PH 5-9。在培養(yǎng)過程中，當培養(yǎng)基的PH值下降，加入碳酸鈣或堿如氨氣中和，用所描述的上述辦法在培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-120小時后，培養(yǎng)基中L-半胱氨酸的量積累。
用常規(guī)方法的組合收集培養(yǎng)基中的L-半胱氨酸，比如利用離子交換樹脂、沉降法等。
實行本發(fā)明的最佳方案下文將用實施例更詳細解釋本發(fā)明<1>棒狀桿菌中L-半胱氨酸合成酶的確定為了達到鑒定棒狀桿菌中L-半胱氨酸分解酶的目的，可以用各種色譜法從黃色短桿菌(ATCC 14067)破碎細胞的懸浮液中純化出一種表現(xiàn)出CD活性的酶，用Kredich等介紹的方法測定酶的活性(生物化學(xué)雜志(J.Biol，Chem.)，248，6187-6196(1973))。ATCC 14067菌株培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中(5g/L葡萄糖，1.5g/L尿素，1.5g/L硫化銨，1g/LKH2PO4，3g/LK2HPO4，0.1g/LMgSO4.7H2O，1mg/LCaCL2，30ug/L維生素H，100ug/L維生素B110mg/LfFeSO4.7H2O，和10mg/LMnSO4.4H2O，PH 7.0)，然后制備破碎細胞的懸浮液，用DEAE-瓊脂糖FF(Amercham Pharmacia Biotech)、BUTYL-Toyopearl650M(Tohso)、MonoQ(Amercham Pharmacia Biotech)、RESOURCEIOS(Amercham Pharmacia Biotech)和Superdex-200(Amercham Pharmacia Biotech)從細胞懸浮液中成功純化出表現(xiàn)出CD活性的蛋白質(zhì)片段，以獲得在SDS-PAGE中表現(xiàn)出基本上單一泳帶的蛋白質(zhì)溶液。獲得的酶蛋白質(zhì)在還原條件下在SDS-PAGE中顯示出分子量大約為43KDa。
通過用埃德曼降解方法測定如上所述提純的具有CD活性的蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸序列，通過用賴氨酸內(nèi)肽酶消化蛋白質(zhì)獲得一個肽的氨基酸序列。結(jié)果如下(N-末端氨基酸序列)MRFPELEELKNRRTLKWTRFPEDVL(SEQ ID NO1)(內(nèi)部氨基酸序列)ILREEGK(SEQ ID NO2)當用FASTA法檢測到一種蛋白具有以上內(nèi)部序列的氨基酸序列，則證明這種蛋白與來自谷氨酸棒狀桿菌的aecD基因編碼的產(chǎn)物的一部分具有100％的同源性(I.Rossol & A.Puhler，細菌雜志(J.Bacteriol.)，174，2968-2977(1992))。
制備具有下列核苷酸序列的引物1和2，基于由上文提到的N-末端氨基酸序列和內(nèi)部氨基酸序列推導(dǎo)出的DNA序列，并且以ATCC 14067菌株的染色體DNA為模板進行PCR。
(引物1)AARTGGACNMGNTTYCCNGA(SEQ ID NO3)(引物2)CTTACCCTCCTCACGAAGAA(SEQ ID NO4)因此發(fā)現(xiàn)得到的片段的核苷酸序列與報道的谷氨酸棒狀桿菌aecD基因高度一致。但是如上所述測定的蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸序列位于以前報道的aecD基因的起始密碼子上游129bp處。基于這個結(jié)果說明在ATCC 14067菌株中，提純的具有CD活性的蛋白質(zhì)是aecD基因產(chǎn)物，而且aecD基因的起始密碼子ATG正確的位于以前報道的aecD基因起始密碼子上游至少129bp處。
通過以上方法獲得的谷氨酸棒狀桿菌的aecD基因的核苷酸序列，由核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列在SEQ ID NOS5和6中也被列出。<2>測定谷氨酸棒狀桿菌aecD破壞型菌株的CD活性已經(jīng)有文章報道，谷氨酸棒狀桿菌IR33的一種aecD破壞型菌株被成功構(gòu)建(I.Rossol & A.Puhler，細菌雜志(J.Bacteriol.)，174，2968-2977(1992))，在IR33菌株中，染色體上的aecD基因使用質(zhì)粒pIR33發(fā)生同源重組而裂解，該pIR33質(zhì)粒含有插入了氯霉素抗性基因的失活型aecD基因。測定以上參考描述的IR33和它的母系菌株ATCC 13032的CD活性。首先破碎細胞制備細胞懸浮液，然后用Kredich等的方法測量CD的活性，結(jié)果見表1。從表中可以看出，IR33的CD活性比野生型ATCC13032的CD活性降低了約1/3。
表1


如上所述，aecD基因的破壞使CD活性顯著降低，則證明了在谷氨酸棒狀桿菌中由aecD基因編碼主要的CD活性。<3>把來自埃希氏大腸桿菌的含有脫敏型SAT基因的質(zhì)粒導(dǎo)入aecD破壞型菌株中把一個來自埃希氏大腸桿菌的野生型SAT基因(cysE)或者編碼脫敏型SAT蛋白的基因?qū)牍劝彼岚魻顥U菌的aecD破壞型菌株IR33和野生型菌株ATCC13032中，其中通過野生型的SAT基因的256位點處的甲硫氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼釟埢鴮AT基因脫敏(日本專利特開No.11-155571)。
分別用EcoRI消化含有野生型SAT基因的質(zhì)粒pCE和含有脫敏型SAT基因的質(zhì)粒pCEM256I，切下包含SAT基因的片段(日本專利特開No.11-155571)，再插入到質(zhì)粒pVK7的EcoRI位點中，該質(zhì)粒是在棒狀桿菌和埃希氏大腸桿菌之間的穿梭載體(參考日本專利特開No.11-266881)。pVK7是由谷氨酸棒狀桿菌中的隱蔽性質(zhì)粒pAM330和埃希氏大腸桿菌中的載體pHSG299連接而構(gòu)成的(Kmr，參考Takeshita，S等，基因(Gene)，61，63-74，(1987)，日本專利特開No.10-215883)，包含由一個多克隆位點和一個來自pHSG299的lacZ’位點。
根據(jù)上文描述的方法，在pKV7的lacZ’前方插入野生型SAT基因或脫敏型SAT基因而獲得質(zhì)粒，包含野生型SAT基因的質(zhì)粒和包含脫敏型SAT基因的質(zhì)粒的分別標記為pKV7-CE、pKV7-256。
把pKV7、pKV7-CE和pKV7-256分別用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入ATCC13032和IR33，以卡那霉素抗性作為標記物篩選轉(zhuǎn)化菌株。<4>生產(chǎn)L-半胱氨酸和L-胱氨酸每一個得到的轉(zhuǎn)化體包被在M-CM2G板上(10g/L的聚胨，10g/L酵母抽提物，5g/LNaCl，5g/L葡萄糖，0.2g/L DL-甲硫氨酸，PH7.2)，平板中還含有25mg/L的卡那霉素，在31.5℃中培養(yǎng)48小時，然后轉(zhuǎn)到盛有20ml的產(chǎn)半胱氨酸培養(yǎng)基的錐形瓶中，31.5℃搖晃培養(yǎng)72小時。產(chǎn)半胱氨酸培養(yǎng)基含有下面所列物質(zhì)(產(chǎn)半胱氨酸培養(yǎng)基)葡萄糖 100g/L(NH4)SO445g/LKH2PO41g/LMgSO4.7H2O 1g/LFeSO4.7H2O 10mg/LMnSO4.5H2O 10mg/L鹽酸硫氨素 300ug/L生物素 100ug/L大豆蛋白鹽酸水解產(chǎn)物“Ajieki”(注冊商標號，Ajinomoto Co.，Inc) 480mg/LL-異亮氨酸 100mg/LL-亮氨酸 100mg/LL-甘氨酸 100mg/LDL-甲硫氨酸 100mg/LCaCO350g/L為溶解沉淀的L-胱氨酸，加入0.5N HCl稀釋液體培養(yǎng)基，以還原型半胱氨酸(L-Cys)和胱氨酸(L-CysH)的總量，用Leuconostoc mesenteroides生物測定法(Tsunoda T等，氨基酸(Amino acids)，3，7-13(1961))測定L-半胱氨酸聚集的量。
表2


以上描述，證明了通過在谷氨酸棒狀桿菌中擴增來自埃希氏大腸桿菌的SAT基因引起了L-半胱氨酸的積累，而且，脫敏型SAT基因的積累效應(yīng)比野生型SAT基因更具優(yōu)勢，另外aecD基因的損失也提高了L-半胱氨酸的積累。
序列表<110>味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>產(chǎn)L-半胱氨酸細菌及生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法<130>OP1289<140><141>2002-02-09<150>JP 2001-34486<151>2001-02-09<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>25<212>PRT<213>黃色棒桿菌(Corynebacterium flavum)<400>1Met Arg Phe Pro Glu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Arg Arg Thr Leu Lys1 5 10 15Trp Thr Arg Phe Pro Glu Asp Val Leu20 25<210>2<211>7<212>PRT<213>黃色棒桿菌(Corynebacterium flavum)<400>2Ile Leu Arg Glu Glu Gly Lys1 5<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<220><221>misc_特征<222>(9，11，18)<223>n＝a or g to c or t<400>3aartggacnm gnttyccnga 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>4cttaccctcc tcacgaagaa 20<210>5<211>1620<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(232)..(1338)<400>5gatatcgccg cttgggactg tgattgggct tacctctttg gcttcgaaca ccggggttga 60ggtagtggtt acttccatgg tttcctcagc ggaaacggct tggctatcag cactttcacc 120cgaacagcct gcaagaagtg cgacggctaa cagggctggg attgtcctca acttcacttc 180gggctccttc ttagtaatag gttcgtagaa aagtttacta agcctgagag t 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權(quán)利要求
1.具有生產(chǎn)L-半胱氨酸能力的棒狀桿菌。
2.權(quán)利要求
1的棒狀桿菌，其被修飾使得其細胞內(nèi)的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性被提高。
3.權(quán)利要求
2的棒狀桿菌，其中通過攜帶L-半胱氨酸對其反饋抑制作用被減弱的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶來提高細胞內(nèi)絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
4.權(quán)利要求
3的棒狀桿菌，其中L-半胱氨酸對其反饋抑制被減弱的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶包含野生型的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶256位的甲硫氨酸殘基相應(yīng)的氨基酸殘基被賴氨酸殘基和亮氨酸殘基之外的氨基酸殘基所取代的突變，或者包含缺失野生型的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的第256位的甲硫氨酸殘基相應(yīng)的氨基酸殘基開始的C-末端區(qū)的突變。
5.權(quán)利要求
2至4任一項的棒狀桿菌，其中通過增加絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的表達量提高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
6.權(quán)利要求
5的棒狀桿菌，其中通過用編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因轉(zhuǎn)化，或者通過細菌細胞內(nèi)編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因的表達調(diào)控中涉及的表達調(diào)控序列或基因的修飾使得該基因的表達增強來提高細胞內(nèi)的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
7.權(quán)利要求
5的棒狀桿菌，其中絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因是屬于埃希氏桿菌屬細菌的cysE。
8.權(quán)利要求
1至6中任何一項中的棒狀桿菌，其中L-半胱氨酸降解系統(tǒng)被進一步抑制。
9.權(quán)利要求
8中的棒狀桿菌，其中通過如此修飾使得細胞內(nèi)的半胱氨酸脫巰基酶活性應(yīng)該被降低來抑制L-半胱氨酸降解系統(tǒng)。
10.權(quán)利要求
9中的棒狀桿菌，其中通過破壞aecD基因降低細胞內(nèi)半胱氨酸脫巰基酶活性。
11.一種生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求
1到10中的任一項的棒狀桿菌來生產(chǎn)并且在培養(yǎng)物中積累L-半胱氨酸，并且從培養(yǎng)物中收集L-半胱氨酸。
專利摘要
L－半胱氨酸是通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌來生產(chǎn)并且在培養(yǎng)物中積累L－半胱氨酸并且從培養(yǎng)物中收集L－半胱氨酸來生產(chǎn)的,其中通過用編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因轉(zhuǎn)化或者修飾編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因的表達調(diào)控序列等來提高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性,所述修飾使得該基因在細胞中的表達應(yīng)該被增強,優(yōu)選地,其中L－半胱氨酸降解系統(tǒng)被進一步抑制。
文檔編號C12N15/09GKCN1374400SQ02105407
公開日2002年10月16日 申請日期2002年2月9日
發(fā)明者高木博史, 和田大, 中森茂 申請人:味之素株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan