普魯蘭多糖-類人膠原蛋白水凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水凝膠，具體涉及一種普魯蘭多糖-類人膠原蛋白水凝膠及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水凝膠的設(shè)計和發(fā)展成為具有多功能的高分子聚合物用于組織修復(fù)研宄的熱點，一般水凝膠的研宄應(yīng)用于組織工程、藥物釋放、基因傳遞、創(chuàng)傷修復(fù)。天然多糖因具有可再生、無毒、可降解材料特性而作為新型材料制備中不可缺少的一種，大多數(shù)多糖的研宄都集中在甲殼素、殼聚糖、肝膦脂、藻酸鹽和普魯蘭多糖。普魯蘭多糖本身具有良好的生物相容性和可降解性，可應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用在基因治療、藥物釋放、骨組織工程和治療肝細胞癌方面。
[0003]類人膠原蛋白應(yīng)用于組織工程方面也比較多，比如，人工血管、人工骨、螯合物以及水凝膠，而且獲得了良好的評價，具有水溶性好、低排異反應(yīng)、無病毒隱患，結(jié)構(gòu)與人體自身膠原蛋白極其接近的顯著優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種普魯蘭多糖-類人膠原蛋白水凝膠及其制備方法，采用化學(xué)交聯(lián)方法制備更具生物相容性、安全性更高的皮膚填充材料和植入支架材料。
[0005]本發(fā)明的實現(xiàn)過程如下:
一種普魯蘭多糖-類人膠原蛋白水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
(1)將類人膠原蛋白溶于雙蒸水中，得到質(zhì)量體積分數(shù)為5?30mg/mL的類人膠原蛋白溶液，向類人膠原蛋白溶液中加入不同分子量的普魯蘭多糖，溫度控制為O?27°C，其中類人膠原蛋白與普魯蘭多糖的質(zhì)量比為(I?3):10 ;
(2)加入質(zhì)量分數(shù)為I?10%的交聯(lián)劑1，4丁二醇二縮水甘油醚溶液，攪拌均勻，溫度控制為20?30°C ;其中，類人膠原蛋白與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為50?300:1?40 ；
(3)將反應(yīng)液放于45?55°C反應(yīng)3h?6h，制得水凝膠；
(4)制得的水凝膠相繼用無熱原水和磷酸鹽緩沖溶液浸洗2?6天，用制粒機制成可注射的顆粒。
[0006]上述類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發(fā)酵生產(chǎn)的類人膠原蛋白。
[0007]上述普魯蘭多糖為由出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，分子量為10000g/mo I ?530000g/molo
[0008]上述磷酸鹽緩沖溶液pH為7.4。
[0009]上述普魯蘭多糖-類人膠原蛋白水凝膠的制備方法為:
(I)將類人膠原蛋白溶于雙蒸水中，得到1mL質(zhì)量體積分數(shù)為5?30mg/mL的類人膠原蛋白溶液，向類人膠原蛋白溶液中加入不同分子量的普魯蘭多糖粉末，令類人膠原蛋白與普魯蘭多糖的質(zhì)量比為(I?3): 10，反應(yīng)溫度控制為O?27°C，在攪拌條件下反應(yīng)0.5?Ih ；
(2)加入0.1?0.35mL、質(zhì)量分數(shù)為I?10%的交聯(lián)劑1，4 丁二醇二縮水甘油醚溶液，反應(yīng)溫度控制為20?30°C，在攪拌條件下反應(yīng)0.2?0.5h ;
(3)將反應(yīng)液放于50°C恒溫水浴鍋中3h?6h，制得水凝膠；
(4)制得的水凝膠相繼用無熱原水和磷酸鹽緩沖溶液浸洗2?6天，用制粒機制成可注射的顆粒。
[0010]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
本發(fā)明所涉及的一種用普魯蘭多糖和類人膠原蛋白合成的水凝膠，是將不同分子量的普魯蘭多糖和類人膠原蛋白結(jié)合起來制成的皮膚填充材料，以基因工程菌BL21高密度發(fā)酵生產(chǎn)的類人膠原蛋白、由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)分泌的不同分子量的水溶性胞外中性普魯蘭多糖為原料，采用化學(xué)交聯(lián)方法制成，類人膠原蛋白和普魯蘭多糖通過接枝共混形成接枝聚合物，由1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚交聯(lián)對接形成聚合物，可制成不同粒徑的可注射顆粒，具有穩(wěn)定性良好、生物學(xué)效價高、可避免外科手術(shù)的創(chuàng)傷和減少病人的疼痛的優(yōu)點，從而真正實現(xiàn)皮膚填充的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0011]圖1為水凝膠的紅外吸收圖譜；圖中，A中，I號為分子量為100，000g/moL的普魯蘭多糖的紅外圖，2號為分子量為530，000g/moL的普魯蘭多糖的紅外圖；B中，I號為類人膠原蛋白的紅外圖，2號為1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚的紅外圖；C中，I號為分子量為100，000g/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠的紅外圖，2號為分子量為530，000g/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠的紅外圖；
圖2為水凝膠中1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚的殘留量；圖中，A號為分子量為100，OOOg/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠中BDDE的殘留量，B為分子量為530，OOOg/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠中BDDE的殘留量；
圖3為水凝膠的樣品圖；圖中，A、B、C為水凝膠的照片圖；A為分子量為100，000g/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠的樣品圖；B，C為分子量為530，000g/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠的樣品圖；
圖4為水凝膠的掃描電鏡圖；圖中，I號為水凝膠的掃描電鏡圖(放大100倍)，2號為水凝膠的掃描電鏡圖(放大250倍)，3號為水凝膠的掃描電鏡圖(放大100倍)，4號為水凝膠的掃描電鏡圖(放大250倍)；1，2為分子量為100，000g/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖；3，4為分子量為530，000g/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖；
圖5為水凝膠注射于小鼠皮下圖；圖中，A為分子量為100，000g/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠注射于小鼠皮下2周后的圖，B為分子量為530，OOOg/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠注射于小鼠皮下2周后的圖，C為分子量為100，000g/moL和530，000g/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠注射于小鼠皮下2周后的圖，D為注射于小鼠皮下2周后取出的水凝膠的圖；
圖6為水凝膠注射于小鼠皮下后的H&E染色圖；圖中，1，2為分子量為100，OOOg/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠注射于小鼠皮下后的H&E組織染色圖；3，4為分子量為530，OOOg/moL的普魯蘭多糖與類人膠原蛋白制備的水凝膠注射于小鼠皮下后的H&E組織染色圖。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0013]本發(fā)明所涉及的普魯蘭多糖-類人膠原蛋白水凝膠的制備方法，選擇交聯(lián)劑1，
4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)與以基因工程菌BL21高密度發(fā)酵生產(chǎn)的類人膠原蛋白和由出芽短梗霉(Aureobasidium pulIulans)分泌的水溶性胞外中性普魯蘭多糖交聯(lián)制備水凝膠，采用交聯(lián)劑進行化學(xué)交聯(lián)，再在25°C攪拌下進行物理交聯(lián)。BDDE是一種雙功能團交聯(lián)劑，可以開環(huán)與普魯蘭多糖的羥基交聯(lián)生成醚鍵，也可以氧化羥基為醛基，也可以實現(xiàn)普魯蘭多糖與類人膠原蛋白的交聯(lián)。而且，BDDE已經(jīng)是FDA/EMEA法規(guī)認證的。因此選用BDDE交聯(lián)劑，不同分子量的普魯蘭多糖和類人膠原蛋白制備新型的水凝膠。同時闡釋水凝膠的空間構(gòu)象變化、機械性能和生物學(xué)功效之間的關(guān)系。
[0014]原料中的類人膠原蛋白采用的是由基因工程菌BL21高密度發(fā)酵生產(chǎn)的類人膠原蛋白，與來自動物源提取的膠原蛋白相比，其具有水溶性好、低排異反應(yīng)、無病毒隱患，結(jié)構(gòu)與人體自身膠原蛋白極其接近的顯著優(yōu)點。另外，動物源膠原蛋白也可作為原料制造水凝膠。普魯蘭多糖為由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)分泌的水溶性胞外中性多糖。普魯蘭多糖本身具有良好的生物相容性和可降解性，可應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。
[0015]本發(fā)明涉及的普魯蘭多糖-類人膠原蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于:
由以下步驟實現(xiàn):
步驟一:將類人膠原蛋白溶于雙蒸水中，得到1mL質(zhì)量體積分數(shù)為5?30mg/mL的類人膠原蛋白溶液，向類人膠原蛋白溶液中加入不同分子量的普魯蘭多糖粉末，令類人膠原蛋白與普魯蘭多糖的質(zhì)量比為(I?3):10，反應(yīng)溫度控制為O?27°C，在攪拌條件下反應(yīng)
0.5 ?Ih ;
步驟二:加入0.1?0.35mL、質(zhì)量分數(shù)為I?10%的交聯(lián)劑溶液，反應(yīng)溫度控制為20?300C，在攪拌條件下反應(yīng)0.2?0.5h ;
步驟三:將反應(yīng)液放于50°C恒溫水浴鍋中3h?6h，制得水凝膠；
步驟四:制得的水凝膠相繼用無熱原水和磷酸鹽緩沖溶液浸洗2?6天，用制粒機制成不同粒徑的可注射的顆粒。
[0016]步驟一中，類人膠原蛋白為基因工程菌BL21高密度發(fā)酵生產(chǎn)的類人膠原蛋白。
[0017]步驟一中，普魯蘭多糖為由出芽短梗霉分泌的水溶性胞外中性多糖，分子量為100000g/mol ?530000g/molo
[0018]步驟