一對(duì)靶向豬RelA基因的sgRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一對(duì)祀向識(shí)別豬RelA基因的 sgRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引 ZFN和TALEN打祀技術(shù)是目前研究較為成熟的兩種定點(diǎn)突變技術(shù)，但是運(yùn)兩種技 術(shù)構(gòu)建程序較為繁瑣，每一個(gè)位點(diǎn)需要構(gòu)建一對(duì)相應(yīng)的核酸酶。而CRISPR/tas9系統(tǒng)對(duì)特 異位點(diǎn)的識(shí)別靠小的crRNA的引導(dǎo)，CRISPR區(qū)可W有一系列的crRNA組成，每個(gè)針對(duì)特異 位點(diǎn)的crRNA只有幾十個(gè)堿基，整個(gè)載體較小，相對(duì)于ZFN和TALEN載體，更加容易構(gòu)建 (CRISPR/tas9新型基因打祀系統(tǒng)的研究進(jìn)展.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).李輝等，2013)。
[0003] (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是細(xì)菌和古細(xì)菌一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免 疫防御機(jī)制。CRISPR/化s9利用一段小RNA來(lái)識(shí)別并剪切DNAW降解外來(lái)核酸分子。 Cong等(MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems.Science. 2013) 及Mali等（RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science.2013)證 明化s9系統(tǒng)能在293T、K562、iPS等多種細(xì)胞中，進(jìn)行有效的祀向酶切，非同源重組 (NHEJ)、同源重組（HR)效率在3-25 %之間，與TALEN酶切效果相當(dāng)。他們還證明，多 個(gè)祀點(diǎn)可W同時(shí)進(jìn)行祀向酶切。但是，隨后的研究表明，Cas9存在較為明顯的脫祀效 應(yīng)化igh-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbyCRISPR-Casnucleasesin humancells.NatureBiotechnology.Fuetal，2013 ;High-throughputprofilingof off-t曰rgetDNAcle曰V曰gereve曰IsRNA-programmedC曰s9nucleasespecificity.Nature Biotechnology.化ttanayaketal，2013)。麻省理工學(xué)院化叫Zhang團(tuán)隊(duì)使用雙切刻技 術(shù)將化s9 的特異性提高了 50 倍^上值oublenickingbyRNA-guidedCRISPRCas9for enhancedgenomeeditingspecificity.Cell.Ranetal，2013)，維護(hù)了化39在基因打革己
技術(shù)領(lǐng)域的地位。借助于運(yùn)一技術(shù)，動(dòng)植物基因功能研究及育種等等都將得到迅猛的發(fā)展。
[0004] RelA是NFKB轉(zhuǎn)錄因子最重要的一個(gè)亞基。豬RelA與仔豬藍(lán)耳病毒、豬攝病毒及 偽狂犬病毒抗體水平有顯著關(guān)聯(lián)化ietal. ,2011)，其單個(gè)氨基酸的改變可引起家豬對(duì)非 洲豬攝病毒（ASFV)感染能力的顯著變化（Palgraveetal. ,2011)。由此可見(jiàn)，豬RelA基 因可作為豬抗病育種的一個(gè)重要候選基因。在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)豬RelA基因進(jìn)行敲除 或修飾，可解析豬RelA基因的功能，為豬的抗病育種服務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明的目的在于提供一對(duì)祀向豬RelA基因的SgRNA。本發(fā)明利用編碼運(yùn)對(duì)SgRNA部分序列的短片段DNA構(gòu)建表達(dá)載體，該表達(dá)載體能夠表達(dá)出運(yùn)對(duì)SgRNA,運(yùn)對(duì)SgRNA 能夠特異性地識(shí)別豬RelA基因。本發(fā)明還利用運(yùn)對(duì)SgRNA引導(dǎo)化礎(chǔ)η核酸酶（即化s9切 割酶）對(duì)豬RelA基因進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地祀向修飾。
[0006] 具體地，本發(fā)明的目的是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一對(duì)祀向豬RelA基因的sgRNA，由sgRNA-F和sgRNA-R組成；sgRNA-F和sgRNA-R 分別由102個(gè)核巧酸組成，其中5'末端第2-21位的RNA片段（2化t，分別命名為sgRNA-F20 和sgRNA-R20)可W識(shí)別豬染色體上RELA基因的特定序列，其余82nt稱為骨架RNA序列。 第22-102位的RNA片段可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與Cas化核酸酶結(jié)合，從而引導(dǎo)化礎(chǔ)η核酸酶切 割祀標(biāo)DNA單鏈，兩個(gè)單鏈切口導(dǎo)致雙鏈斷裂值SB)，細(xì)胞利用自身修復(fù)功能，使得祀標(biāo)位 點(diǎn)附近的序列發(fā)生變化；另外，運(yùn)對(duì)sgRNA識(shí)別的DNA祀序列呈"頭對(duì)頭"的排布方式（即 二者的5'末端相互靠近），二者相距化P，即有化P的間隔。
[0008] 所述SgRNA-F具體可如序列表的序列2所示。
[0009] 所述SgRNA-R具體可如序列表的序列4所示。
[0010] 本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供一對(duì)DNA分子（命名為特異DNA分子對(duì)），由編碼所述 SgRNA-F的DNA分子甲和編碼所述SgRNA-R的DNA分子乙組成。 W11]所述DNA分子甲具體如序列表的序列1所示。 陽(yáng)01引所述DNA分子乙具體如序列表的序列3所示。
[0013] 本發(fā)明第Ξ個(gè)目的是提供上述SgRNA對(duì)在特異識(shí)別和祀向修飾豬RelA基因中的 應(yīng)用。所述豬RelA基因，其NCBI登錄號(hào)為ΝΜ_001114281. 1。
[0014] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供上述SgRNA對(duì)在構(gòu)建豬RelA基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。所 述豬RelA基因，其NCBI登錄號(hào)為ΝΜ_001114281. 1。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一對(duì)特異識(shí)別豬RelA基因的SgRNA,并提供了一 對(duì)該SgRNA的編碼DNA片段，從而通過(guò)化s9系統(tǒng)在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)豬RelA基因進(jìn)行 敲除或修飾，W解析豬RelA基因的功能、構(gòu)建豬RelA基因突變庫(kù)，為豬育種服務(wù)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為SgRNA祀點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果示意圖，其中箭頭處代表單鏈切刻位點(diǎn)（兩個(gè)單鏈切 口產(chǎn)生一個(gè)雙鏈斷裂）。
[0017] 圖2為質(zhì)粒對(duì)pX335-sgRNA-F與pX335-sgRNA-R共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞72小 時(shí)后提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物克隆后的部分測(cè)序結(jié)果（突變序列）。
【具體實(shí)施方式】
[0018]W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。W下實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均采用低糖DMEM培養(yǎng)基培 養(yǎng)細(xì)胞。
[0019]pX335載體購(gòu)自Addgene，貨號(hào)42335。抓SI內(nèi)切酶購(gòu)自肥B公司，貨號(hào)R0539S。 DNA寡核巧酸均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。
[0020]實(shí)施例1、SgRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)的構(gòu)建
[0021] 1、SgRNA祀點(diǎn)設(shè)計(jì)
[0022] 在NCBI登錄號(hào)為ΝΜ_001114281. 1的序列中提取豬RelA基因第十外顯子的編碼 區(qū)巧59-1033,如下所示），使用麻省理工學(xué)院在線軟件化ttpV/crispr.mit.edu/)設(shè)計(jì)革己 標(biāo)位點(diǎn)。
[0023] GACCCACCGACCCCC GGCCTGCAAC CCGGCGCATT GCTGTGCCTT CCCGCAGCTC AGCTTCCGTC CCCAAGCCAG
[0024] 正向祀序列是TCAGCTTCCGTCCCCAAGCC巧4-73)、反向祀序列是 GGAAGGCACAGCAATGCGCC(28-47)。兩個(gè)祀序列呈"頭對(duì)頭"的排布方式，二者相距化p，即有 6bp的間隔。分別命名為正向祀標(biāo)T1、反向祀標(biāo)T2。祀標(biāo)設(shè)計(jì)如圖1所示。 陽(yáng)0巧]2、sgRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)