一對用于敲除豬nfkb1基因的向?qū)na的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一對靶向識別豬NFKB1基因的向 導RNA及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] ZFN和TALEN打靶技術(shù)是目前研究較為成熟的兩種定點突變技術(shù)，但是這兩種技 術(shù)構(gòu)建程序較為繁瑣，每一個位點需要構(gòu)建一對相應的核酸酶。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對特 異位點的識別靠小的crRNA的引導，CRISPR區(qū)可以有一系列的crRNA組成，每個針對特異 位點的crRNA只有幾十個堿基，整個載體較小，相對于ZFN和TALEN載體，更加容易構(gòu)建 (CRISPR/Cas9新型基因打靶系統(tǒng)的研究進展.江蘇農(nóng)業(yè)學報.李輝等，2013)。
[0003] (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是細菌和古細菌一種不斷進化適應的免 疫防御機制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA來識別并剪切DNA以降解外來核酸分子。 Cong等(MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems.Science. 2013) 及Mali等(RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science.2013)證 明Cas9系統(tǒng)能在293T、K562、iPS等多種細胞中，進行有效的靶向酶切，非同源重組 (NHEJ)、同源重組（HR)效率在3-25 %之間，與TALEN酶切效果相當。他們還證明，多 個靶點可以同時進行靶向酶切。但是，隨后的研究表明，Cas9存在較為明顯的脫靶效 應（High-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbyCRISPR-Casnucleasesin humancells.NatureBiotechnology.Fuetal，2013 ;High-throughputprofilingof off-targetDNAcleavagerevealsRNA-programmedCas9nucleasespecificity.Nature Biotechnology.Pattanayaketal，2013)。麻省理工學院FengZhang團隊使用雙切刻技 術(shù)將Cas9 的特異性提高了 50 倍以上（DoublenickingbyRNA-guidedCRISPRCas9for enhancedgenomeeditingspecificity.Cell.Ranetal，2013)，維護了Cas9 在基因打革巴
技術(shù)領(lǐng)域的地位。借助于這一技術(shù)，動植物基因功能研究及育種研究等都得到了迅猛的發(fā) 展。
[0004] NFKB1是NFKB轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員。豬NFKB1基因的多態(tài)與豬對沙門氏菌的抵 抗能力相關(guān)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ834921. 1)。由此可見，豬NFKB1 基因可作為豬抗病育種的一個重要候選基因。在細胞或個體水平上對豬NFKB1基因進行敲 除或修飾，可解析豬NFKB1基因的功能，為豬的抗病育種服務。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一對靶向豬NFKB1基因的前導RNA(sgRNA)。本發(fā)明利用 編碼這對sgRNA部分序列的短片段DNA構(gòu)建表達載體，該表達載體能夠表達出這對sgRNA， 這對sgRNA能夠特異性地識別豬NFKB1基因。本發(fā)明還利用這對sgRNA引導Cas9n核酸酶 (即Cas9切刻酶）對豬NFKB1基因進行準確、高效地靶向修飾。
[0006] 具體地，本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：
[0007] 一對靶向豬NFKB1 基因的sgRNA，由sgRNA-F和sgRNA-R組成；sgRNA-F和sgRNA-R 分別由102個核苷酸組成，其中5'末端第2-21位的RNA片段（20nt，分別命名為sgRNA-F20 和sgRNA-R20)可以識別豬染色體上NFKB1基因的特定序列，其余82nt稱為骨架RNA序列。 第22-102位的RNA片段可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與Cas9n核酸酶結(jié)合，從而引導Cas9n核酸酶切 割靶標DNA單鏈，兩個單鏈切口導致雙鏈斷裂（DSB)，細胞利用自身修復功能，使得靶標位 點附近的序列發(fā)生變化；另外，這對sgRNA識別的DNA靶序列呈"頭對頭"的排布方式（即 二者的5'末端相互靠近），二者相距6bp，即有6bp的間隔。
[0008] 所述sgRNA-F具體可如序列表的序列2所示。
[0009] 所述sgRNA-R具體可如序列表的序列4所示。
[0010] 本發(fā)明另一個目的在于提供一對DNA分了（命名為特異DNA分子對），由編碼所述 sgRNA-F的DNA分子甲和編碼所述sgRNA-R的DNA分子乙組成。
[0011] 所述DNA分子甲具體如序列表的序列1所示。
[0012] 所述DNA分子乙具體如序列表的序列3所示。
[0013] 本發(fā)明第三個目的是提供上述sgRNA對在特異識別和靶向修飾豬NFKB1基因中的 應用。所述豬NFKB1基因，其GenBank號為DQ834921. 1。
[0014] 本發(fā)明第四個目的是提供上述SgRNA對在構(gòu)建豬NFKB1基因突變庫中的應用。所 述豬NFKB1 基因，其GenBank號為DQ834921. 1。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一對特異識別豬NFKB1基因的SgRNA，并提供了一 對該sgRNA的編碼DNA片段，從而通過Cas9系統(tǒng)在細胞或個體水平上對豬NFKB1基因進行 敲除或修飾，以解析豬NFKB1基因的功能、構(gòu)建豬NFKB1基因突變庫，為豬育種服務。
【附圖說明】
[0016] 圖1為sgRNA靶點設(shè)計結(jié)果示意圖，其中箭頭處代表單鏈切刻位點（兩個單鏈切 口產(chǎn)生一個雙鏈斷裂）。
[0017] 圖2為質(zhì)粒對pX335-sgRNA-F與pX335-sgRNA-R共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞72小 時后提取DNA進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物克隆后的部分測序結(jié)果（突變序列）。
【具體實施方式】
[0018] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中，如無特殊說明，均采用低糖DMEM培養(yǎng)基培 養(yǎng)細胞。
[0019] pX335載體購自Addgene，貨號42335。BbsI內(nèi)切酶購自NEB公司，貨號R0539S。 DNA寡核苷酸均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。
[0020] 實施例1、sgRNA表達質(zhì)粒對的構(gòu)建
[0021] 1、sgRNA靶點設(shè)計
[0022] 在NCBI登錄號為DQ834921. 1的序列中提取豬NFKB1基因第3外顯子序列 (115-216bp區(qū)域，如下所示），使用麻省理工學院在線軟件（http://crispr.mit.edu/)設(shè) 計祀標位點。
[0023] 1cagagaggatttcgtttccgttatgtgtgtgaaggcccctcccatggtggactccctggc
[0024] 61gcatctagtgaaaagaacaagaagtcctaccct