一種青霉素g鈉表面分子印跡聚合物的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子印跡材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種青霉素G鈉表面分子印跡聚合物的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]青霉素G鈉是最早的內(nèi)酰胺類抗生素，對革蘭氏陽性菌及某些革蘭氏陰性菌有較強的抗菌作用。青霉素能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用，在體內(nèi)有良好的分散性、低毒性，并且治療感染的效率高，在臨床治療中具有重要作用。隨著青霉素類抗生素在畜牧業(yè)的普遍應(yīng)用，導(dǎo)致青霉素等抗生素在食品中的殘留，對人體造成一定的危害。例如食用殘留青霉素過多的牛奶會使部分人產(chǎn)生過敏作用，且會引起腸道的正常菌群失調(diào)，并引起其它有關(guān)疾病，使體內(nèi)病原菌產(chǎn)生抗藥性。另外，乳品加工的牛奶中含有的抗生素會抑制乳酸菌的生長，因此對酸奶和奶酪的加工不利。
[0003]目前，PEN_G(青霉素G)等β-內(nèi)酰胺類抗生素的測定主要有以下幾種方法:(1)微生物法，如氯化三苯基三氮唑法(TTC法)，紙片法(PD)，戴爾沃檢測法(SP法)，三磷酸腺苷法，酶比色法，杯碟法等；(2)免疫測定法，如酶聯(lián)免疫檢測法，免疫傳感器，熒光免疫測定法(FIA) ;(3)理化檢驗法，如液相色譜法，液相色譜-質(zhì)譜法，氣相色譜法，薄層色譜法，毛細(xì)管電泳法，生物傳感器法，凝膠電泳-生物自顯影法，熒光光度法等。生物樣品中PEN-G的含量較低，樣品富集純化的有效性直接關(guān)系到分析方法的有效性，傳統(tǒng)的液-液、固-液難以實現(xiàn)對生物樣品中微量PEN-G的富集和純化，難以對樣品中PEN-G進行定性和定量分析；色譜法和毛細(xì)管電泳法等需將生物檢材處理成易于分析的形式，而酶聯(lián)免疫吸附測定法準(zhǔn)確性不夠，常出現(xiàn)假陽性事件，抗干擾能力差。
[0004]分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting Technology, MIT)是指一種可以用來合成對特定目標(biāo)分子具有專一識別性的聚合物的新技術(shù)。MIT是在化學(xué)、材料科學(xué)、生物化學(xué)等多門學(xué)科交叉的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)。經(jīng)MIT制得的聚合物稱為分子印跡聚合物(Molecular Imprinted Polymer, MIP)。與天然分子識別系統(tǒng)相比，分子印跡聚合物不但具備可以與之相媲美的分子識別能力，還具有使用壽命長、穩(wěn)定性好、親和性和選擇性高等良好的物理和化學(xué)性質(zhì)，因而在抗體模擬、仿生催化、生物傳感器、藥物釋放等領(lǐng)域已展現(xiàn)了它的優(yōu)勢，特別是在分離領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用。
[0005]制備分子印跡材料的傳統(tǒng)方法是包埋法，該方法對模板分子包埋過深或過緊使洗脫模板分子比較困難，且大部分印跡位點被包埋在聚合物內(nèi)部，使其吸附量減少，利用率降低，研磨過程中還會造成分子識別位點的破壞，另外得到的聚合物顆粒不規(guī)則，用作色譜固定相時其載流量和柱效率都較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是為了解決上述不足，提供了一種青霉素G鈉表面分子印跡聚合物的制備方法及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的上述目的通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn):一種青霉素G鈉表面分子印跡聚合物的制備方法，即:將青霉素G鈉溶于一定的溶液，所述一定的溶劑為二甲基亞砜(DMS0)和甲醇體積比為4:1的混合物；然后，加入功能單體攪拌，再加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑，氮氣除氧，加熱反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后洗去模板分子青霉素G鈉，干燥，即得青霉素G鈉表面分子印跡聚合物。
[0008]作為優(yōu)選，所述功能單體為α -甲基丙烯酸(ΜΑΑ)。
[0009]作為優(yōu)選，所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)。
[0010]作為優(yōu)選，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(ΑΙΒΝ)。
[0011]本發(fā)明的青霉素G鈉表面分子印跡聚合物的性能研究實驗方法:包括以下步驟:
[0012]a、青霉素G鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:
[0013]將青霉素G鈉溶于一定的溶液，配制成不同濃度的青霉素G鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0014]作為優(yōu)選，所述溶劑采用甲醇溶劑。
[0015]b、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
[0016]將不同濃度的青霉素G鈉溶液，于264nm波長下，以不含青霉素G鈉溶液的甲醇溶液為空白對照，分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，青霉素溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017]c、結(jié)合動力學(xué)實驗:
[0018]分別稱取MIP和NIP，加入青霉素G鈉溶液，室溫下振蕩，24h內(nèi)取出混合液離心，取上清液用紫外分光光度計測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同吸附時間青霉素G鈉的濃度。計算聚合物對青霉素G鈉的結(jié)合量Q( μ g/mg)。
[0019]Q = (C-Q.V/m
[0020]其中C。、Q分別表不吸附前后溶液中模板分子的濃度(yg/mL) ;V表不溶液的體積(mL) ;m表不加入的分子印跡聚合物的質(zhì)量(mg)。繪制結(jié)合量與結(jié)合時間關(guān)系的動力學(xué)曲線。確定分子印跡聚合物的結(jié)合量Q、印跡因子α和最佳結(jié)合平衡時間。
[0021]a = Q (MIP)/Q (NIP)
[0022]其中Q(MIP)表示分子印跡聚合物的飽和結(jié)合量；Q(NIP)表示非分子印跡聚合物的飽和結(jié)合量。印跡因子α的大小代表了 MIP的特異吸附性質(zhì)，其數(shù)值越大，特異性越好，印跡效果就越強。
[0023]d、吸附等溫曲線:
[0024]稱取MIP，置于離心管中，不同濃度的青霉素G鈉溶液。室溫下振蕩20h達(dá)到吸附平衡后，將混合液離心，取上清液測定吸光度，計算分子印跡聚合物飽和結(jié)合量Q，繪制吸附等溫線。
[0025]e、特異性識別實驗:
[0026]選取青霉素V鉀、阿莫西林、頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢拉定、鹽酸左氧氟沙星作為目標(biāo)分子。分別稱取MIP和NIP，置于試管中，加入青霉素G鈉溶液。室溫下振蕩達(dá)到吸附平衡后，將各混合液離心，取上清液，測定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)合前后溶液濃度的變化。采用選擇因子(SelectinG Factor，β )來描述MIP的選擇識別能力，計算出模板印跡因子和模板類似物的印跡因子α 2，根據(jù)公式計算選擇因子β:
[0027]β = α / α 2
[0028]選擇因子β的大小代表了 ΜΙΡ對模板類似物的選擇分離能力，β數(shù)值越大，越容易使模板分子和模板類似物分離開。
[0029]本發(fā)明的青霉素G鈉表面分子印跡聚合物檢測牛奶中一定范圍內(nèi)的青霉素G鈉殘留的方法，包括以下步驟:
[0030](1)牛奶樣品的提取:
[0031]取牛奶樣品置于離心管中，加入提取溶劑混勻，離心，重復(fù)上述操作，合并提取液，加入另一種提取溶液，調(diào)節(jié)ΡΗ，加熱攪拌，得提取后的牛奶。
[0032]作為優(yōu)選，所述提取溶劑為乙腈。
[0033]作為優(yōu)選所述提取溶液為磷酸鹽緩沖溶液(pH)。
[0034](2)方法學(xué)驗證:
[0035]a、準(zhǔn)確度與批內(nèi)精密度:
[0036]將牛奶樣品均分到9支離心管中并標(biāo)記，分別向其中加入青霉素G鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，在溶液中分別加入準(zhǔn)確稱重的分子印跡聚合物，在室溫下震蕩達(dá)到吸附平衡后，將溶液離心。過濾，干燥，稱重。根據(jù)聚合物前后質(zhì)量差，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。
[0037]回收率(％ )=測得量/加入量X 100%
[0038]b、檢測限 L0D:
[0039]用空白樣品即不加牛奶樣品的青霉素G鈉，按方法學(xué)驗證中準(zhǔn)確度和批內(nèi)精密度的方法計算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，再將3倍空白的SD作為檢測限的估算值。
[0040]LOD = 3S (S為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差)
[0041](3)牛奶樣品的測定:
[0042]離心管中加入分子印跡聚合物MIP，加入提取后的牛奶樣品，室溫震蕩，離心，過濾，干燥，稱重，計算青霉素G鈉的含量。
[0043]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點是:本發(fā)明的青霉素G鈉表面分子印跡聚合物制備過程簡單，可操作性強，制備成本低廉，對青霉素鈉分子結(jié)合速度快、特異性強、結(jié)合容量高、吸附平衡時間短。所制備的青霉素G鈉分子印跡聚合物對目標(biāo)樣品選擇性高，專屬性強，模板分子可回收重復(fù)使用等優(yōu)點，可用于檢測牛奶中一定范圍內(nèi)的青霉素G鈉殘留。
【附圖說明】
[0044]圖1為本發(fā)明實施例所得的表面分子印跡聚合物的青霉素G鈉吸附動力學(xué)曲線圖。
[0045]圖2為本發(fā)明實施例所得的表面分子印跡聚合物的青霉素G鈉吸附等溫曲線圖。
[0046]圖3為本發(fā)明實施例所得的表面分子印跡聚合物對青霉素G鈉、青霉素V鉀、阿莫西林、頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢拉定、鹽酸左氧氟沙星特異性識別柱狀圖。
【具體實施方式】
[0047]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步詳述。
[0048]—種青霉素G鈉表面分子印跡聚合物的制備方法，即:將青霉素G鈉溶于一定的溶液，所述一定的溶劑為二甲基亞砜(DMS0)和甲醇體積比為4:1的混合物；然后，加入功能單體攪拌，再加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑，氮氣除氧，加熱反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后洗去模板分子青霉素G鈉，干燥，即得青霉素G鈉表面分子印跡聚合物。
[0049]作為優(yōu)選，所述功能單體為α -甲基丙烯酸(ΜΑΑ)。
[0050]作為優(yōu)選，所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)。
[0051]作為優(yōu)選，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(ΑΙΒΝ)。
[0052]本發(fā)明的青霉素G鈉表面分子印跡聚合物的性能研究實驗方法:包括以下步驟:
[0053]a、青霉素G鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:
[0054]將青霉素G鈉溶于一定的溶液，配制成不同濃度的青霉素G鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0055]作為優(yōu)選，所述溶劑采用甲醇溶劑。
[0056]b、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
[0057]將不同濃度的青霉素G鈉溶液，于264nm波長下，以不含青霉素G鈉溶液的甲醇溶液為空白對照，分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，青霉素溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0058]c、結(jié)合動力學(xué)實驗:
[0059]分別稱取MIP和NIP，加入青霉素G鈉溶液，室溫下振蕩，24h內(nèi)取出混合液離心，取上清液用紫外分光光度計測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同吸附時間青霉素G鈉的濃度。計算聚合物對青霉素G鈉的結(jié)合量Q( μ g/mg)。
[0060]Q = (Co-Q).V/m
[0061]其中C。、Q分別表不吸附前后溶液中模板分子的濃度(yg/mL) ;V表不溶液的體積(mL) ;m表不加入的分子印跡聚合物的質(zhì)量(mg)。繪制結(jié)合量與結(jié)合時間關(guān)系的動力學(xué)曲線。確定分子印跡聚合物的結(jié)合量Q、印跡因子α和最佳結(jié)合平衡時間。
[0062]a = Q (MIP)/Q (NIP)
[0063]其中Q(MIP)表示分子印跡聚合物的飽和結(jié)合量；Q(NIP)表示非分子印跡聚合物的飽和結(jié)合量。印跡因子α的大小代表了 MIP的特異吸附性質(zhì)，其數(shù)值越大，特異性越好，印跡效果就越強。
[0064]d、吸附等溫曲線:
[0065]稱取MIP，置于離心管中，不同濃度的青霉素G鈉溶液。