一種基因定點(diǎn)多位點(diǎn)突變的方法
【專利說明】一種基因定點(diǎn)多位點(diǎn)突變的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基因定點(diǎn)多位點(diǎn)突變的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 基因突變是指個別dNMP(脫氧單磷酸核苷）殘基以至片段DNA在結(jié)構(gòu)、復(fù)制或表 型功能的異常變化，也稱為DNA損傷。體外定點(diǎn)突變技術(shù)是當(dāng)前生物，醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域中的一個 重要實(shí)驗(yàn)手段，多運(yùn)用于改造，優(yōu)化目的基因，探索啟動子的調(diào)節(jié)位點(diǎn)的有效手段，也是研 究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具。并且基因突變是生物變異的根本來源， 為生物的進(jìn)化提供了原材料?；蛑亟M可以產(chǎn)生多種多樣的基因組合的子代，其中一些子 代會含有適應(yīng)某種環(huán)境變化的基因組合，所以說基因重組是生物變異的來源之一，是形成 生物多樣性的重要原因。因此，我們對基因突變的研究具有重大意義。
[0003] 同源重組是目前進(jìn)行基因突變的重要手段。同源重組是指發(fā)生在同一染色體等染 色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。近年來PCR同源重組克隆法 被愈來愈受重視，該方法不受載體和目的片段的酶切位點(diǎn)限制，通過重組酶直接運(yùn)用同源 重組的方法完成目的片段與載體相連接的基因克隆技術(shù)。該技術(shù)操作簡單，PCR產(chǎn)物一步定 向克隆，目的片段與載體無縫連接，反應(yīng)時間短和傳統(tǒng)方法相比，具有快速，效率高的特點(diǎn)。
[0004] 目前的基因重組一般需要重組酶的作用。但是重組酶純化的過程比較復(fù)雜，不耐 高溫，在運(yùn)送和保存方法要求也比較高。我們的方法將用非特異性結(jié)合蛋白HU在基因重組 過程中取代重組酶。HU是與DNA非特異結(jié)合的類似組蛋白的耐熱的小分子蛋白質(zhì)。HU是 由兩個同源亞基HupA和HupB組成，是最保守的核酸結(jié)合蛋白，可非特異性結(jié)合雙鏈DNA。 HU蛋白不但能像結(jié)合單鏈DNA的SSB蛋白一樣與單鏈DNA結(jié)合，同時還能結(jié)合雙鏈的DNA。 而來源于大腸桿菌菌株U93的組蛋白樣蛋白（HU)，作為一種與DNA非特異性結(jié)合的蛋白， 在細(xì)菌染色體的壓縮和排列過程中扮演了重要角色。它除了維持DNA的超螺旋和壓縮狀態(tài) 外，還能對DNA的結(jié)構(gòu)起到一些特殊作用，如DNA的彎曲、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、起始于復(fù)制原點(diǎn)的 復(fù)制、核蛋白復(fù)合物在裝配時所需的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)，以及通過蛋白質(zhì)-RNA相互作用 控制的翻譯起始等。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，在于提供一種基因定點(diǎn)多位點(diǎn)突變的方法，其利用和 非特異性DNA結(jié)合的蛋白HU取代重組酶從而將幾個片段無縫拼接，以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)多位點(diǎn)的突 變。
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種基因定點(diǎn)多位點(diǎn)突變的方法，所述方法步驟如下：
[0008] 根據(jù)基因定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含突變位點(diǎn)的引物，即通過引物設(shè)計(jì)在重疊 區(qū)域引入突變位點(diǎn)；然后利用PCR擴(kuò)增，制備包含突變位點(diǎn)的PCR片段；最后利用和非特異 性DNA結(jié)合的蛋白HU連接DNA片段和克隆載體。
[0009] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0010] 本發(fā)明在大腸桿菌中連接DNA片段和克隆載體時，利用含有和DNA非特異性結(jié)合 的蛋白HU取代重組酶，從而將幾個片段無縫拼接，以實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的突變，該方法成本低，操 作過程較為簡單。 【【附圖說明】】
[0011] 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0012] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例的HU蛋白SDS-PAGE電泳檢測圖。
[0013] 圖2-1為本發(fā)明實(shí)施例環(huán)狀的雙鏈DNA作為底物的HU蛋白活性電泳檢測圖。
[0014] 圖2-2為本發(fā)明實(shí)施例雙鏈線性DNA作為底物的HU蛋白活性電泳檢測圖。
[0015] 圖2-3為本發(fā)明實(shí)施例單鏈線性DNA作為底物的HU蛋白活性電泳檢測圖。
[0016] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例的分段PCR電泳檢測結(jié)果圖。
[0017] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例的整段PCR電泳檢測結(jié)果圖。
[0018] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例的克隆轉(zhuǎn)化結(jié)果圖。
[0019] 圖6-1為本發(fā)明實(shí)施例的cpl-3基因序列比對結(jié)果圖。
[0020] 圖6-2為本發(fā)明實(shí)施例的cpl-9基因序列比對結(jié)果圖。
[0021] 圖6-3為本發(fā)明實(shí)施例的cpl-10基因序列比對結(jié)果圖。 【【具體實(shí)施方式】】
[0022] 請參閱圖1~6所示，對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0023] 本發(fā)明所涉及的一種基因定點(diǎn)多位點(diǎn)突變的方法，所述方法步驟如下：根據(jù)基因 定點(diǎn)突變的堿基位置設(shè)計(jì)包含突變位點(diǎn)的引物，即通過引物設(shè)計(jì)在重疊區(qū)域引入突變位 點(diǎn)；然后利用PCR擴(kuò)增，制備包含突變位點(diǎn)的PCR片段，即通過PCR的方法對該位點(diǎn)進(jìn)行修 正；最后利用和非特異性DNA結(jié)合的蛋白HU連接DNA片段和克隆載體，即利用和非特異性 DNA結(jié)合的蛋白HU取代重組酶，進(jìn)行基因重組，將片段連接起來，從而實(shí)現(xiàn)片段內(nèi)基因的定 點(diǎn)多位點(diǎn)突變。
[0024] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0025] 實(shí)施例一：
[0026] UHU蛋白的制備
[0027] I. 1)將來源于大腸桿菌的HU-α或HU-β亞基或者是HU-α和HU-β的二聚體分 別插入ΡΕΤ22表達(dá)載體中，通過連接轉(zhuǎn)化并用菌落PCR、酶切鑒定及測序驗(yàn)證，即可得到重 組表達(dá)載體pET22-Hu_a或者 ΡΕΤ22-Ηιι_β或者是Hu-α和Hu-β的二聚體；
[0028] 1.2)使用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21對構(gòu)建好的重組載體pET22-HU_a或者 ρΕΤ22-Ηυ-β或者是HU-a和HU-β的二聚體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，取含重組質(zhì)粒的陽性菌株加入LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，之后菌液按1 %比例接種到50ml的LB培養(yǎng)液中，放入37°C搖床培 養(yǎng)至其OD值為0. 6~0. 8 ;加入IPTG，將菌液放入37°C搖床中誘導(dǎo)表達(dá)3. 5h ;
[0029] 1. 3)取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心得到菌體，裂解，釋放蛋白質(zhì)，并通過SDS-PAGE電 泳檢測蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖1(圖1中：M是蛋白分子量Marker ;M左側(cè)為待檢測蛋白的 電泳條帶）所示的蛋白為水溶性的、且大小正確即10. 5kDa，從而篩選到所釋放的蛋白為水 溶性且大小正確的陽性菌株即所需陽性菌株；
[0030] 1.4)對該蛋白進(jìn)行純化。利用上述操作（1.2)與（1.3)的操作培養(yǎng)獲得大量 所需陽性菌株，菌液經(jīng)3000Xg離心15min，收集大腸桿菌菌體，于-70°C冷凍放置過夜， 備用；將收集到的大腸桿菌菌體懸浮在裂解緩沖液（組分為：〇. 05M Tris、0. 2M氯化鈉、 0.0 lM EDTAUO% V/v甘油、pH 7. 5)，冰上超聲裂解菌體，裂解液經(jīng)27000 Xg離心15min， 于上清液中加入10%終濃度0. 35%的PEI和終濃度0. 75M的NaCl，4°C放置至核酸沉淀， 之后17000Xg離心20min，于上清液中添加飽和硫酸銨至其體積分?jǐn)?shù)為50%，在4°C放置 lh，接著17000Xg離心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸銨至完全飽和，然后17000Xg離 心30min，取硫酸銨沉淀溶解在緩沖液（組分：0. 02M Tris、0.0 OlM EDTA、0.1 M NaCl、10% V/v甘油、pH 7. 5)，透析36h，換液三次；透析后的溶液上樣至強(qiáng)陽離子交換柱，用透析緩沖 液NaCl梯度洗脫，收集0. 2M和0. 25M的NaCl洗脫峰，并以弱陽離子交換柱及NaCl梯度洗 脫該洗脫峰，以〇. 25M NaCl洗脫得到HU蛋白原液，將原液進(jìn)行85°C加熱20min后以轉(zhuǎn)速 14000Xg，4°C下離心20min取上清液即得非特異性DNA結(jié)合蛋白HU蛋白。加入甘油至其 體積分?jǐn)?shù)為50 %，-70 °C保存待用。
[0031] 其中，強(qiáng)陽離子交換柱采用SP瓊脂糖凝膠柱，弱陽離子交換柱采用ICM-瓊脂糖 柱。
[0032] 將制備所得的HU蛋白原液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果與圖1 一致，大小為10. 5kDa， 純度為95%左右，即HU蛋白原液濃度為：130ng/yl。
[0033] 2、HU的活性檢測
[0034] 2. I) HU的活性檢測（環(huán)狀的雙鏈DNA作為底物）
[0035] 按照下表1配置10 μ 1的反應(yīng)體系：
[0036] 表 1
[0038] (注明：所用的稀釋蛋白是將HU蛋白原液稀釋5倍，即1 μ I HU蛋白原液加入4 μ 1 bufferA混合均勾。）
[0039] 在反應(yīng)液中，加入不同濃度的上述步驟1得到的HU蛋白，室溫下靜置lOmin，之后 分別取5 μ 1反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖2-1?？梢娫诩尤際U蛋白后，HU與 雙鏈DNA結(jié)合，隨著加入量的增加，DNA條帶逐漸上移。表明純化出的蛋白HU有活性并且 與環(huán)狀的雙鏈DNA相互作用。
[0040] 圖2-1中各泳道表示如下：M :DNA分子量Marker ;1 :質(zhì)粒⑵與shift buffer (SB)混合液；2 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入稀釋5倍的0. 2 μ I HU ;3 :Z與SB混合液 體系內(nèi)加入稀釋5倍的2 μ I HU ;4 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入1 μ I HU ;5 :Z與SB混合液 體系內(nèi)加入1. 8 μ I HU ;6 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入2 μ I HU ;7 :Z與SB混合液體系內(nèi)加 入2. 5 μ I HU ;8 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入3 μ I HU ;9 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入3. 5 μ 1 HU ; 10 :Ζ與SB混合液體系內(nèi)加入4 μ I HU ; 11 :Ζ與SB混合液體系內(nèi)加入4. 5 μ I HU ; 12 : Z與SB混合液體系內(nèi)加入5 μ I HU。
[0041] 2. 2) HU的活性檢測（線性狀的雙鏈DNA作為底物）
[0042] 按照下表2配置10 μ 1的反應(yīng)體系：
[0043] 表 2