水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記及其專(zhuān)用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子 標(biāo)記及其專(zhuān)用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約一半以上的人口以稻米作為主食。 稻痕病是由子囊菌(Magnaporthegrisea(Hebert)Barr)引起的廣泛發(fā)生在世界各稻區(qū)的重 要病害之一，嚴(yán)重威脅著世界的糧食安全。目前主要通過(guò)化學(xué)防治和種植抗病品種來(lái)控制 稻瘟病?；瘜W(xué)防治在一定程度上能減輕病害、減少產(chǎn)量損失，但是對(duì)環(huán)境造成污染，因而通 過(guò)選育抗病新品種來(lái)預(yù)防稻瘟病是最佳選擇，但由于其病菌小種遺傳的復(fù)雜性和致病性的 多樣性，抗病新品種在推廣3-5年后會(huì)喪失抗性。目前，抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種主要利 用與抗稻瘟病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，大大提高了育種效率，但往往也存 在分子標(biāo)記與抗病基因不連鎖導(dǎo)致輔助選擇失敗的情況。而利用抗病基因序列建立與稻瘟 病抗病基因完全共分離的基因標(biāo)簽，則能讓輔助選擇理論上達(dá)到100%的準(zhǔn)確性。
[0003] 抗稻瘟病基因Pi2是較為廣譜的抗性基因，但目前尚未有基因內(nèi)特異性標(biāo)記開(kāi)發(fā) 的應(yīng)用報(bào)道。目前，跟蹤稻瘟病基因Pi2的分子標(biāo)記一般用緊密連鎖的標(biāo)記AP22,顯性分子 標(biāo)記1卞1(12或共顯性分子標(biāo)記1-?12等，距離？12均有一定距離，選擇效率無(wú)法達(dá)到1()0%; 而且有些方法還需要進(jìn)行酶切，方法復(fù)雜，成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記 及其專(zhuān)用引物，使用方法簡(jiǎn)單有效，降低了育種成本，能快速地檢測(cè)抗稻瘟病基因Pi2的特 異性功能標(biāo)記，由于該標(biāo)記位于Pi2基因簇內(nèi)，選擇效率理論上達(dá)到100%的準(zhǔn)確性。
[0005]對(duì)此，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0006] -種水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物，所述水稻抗稻瘟病基 因P i 2的特異性分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物由P i 2DomR引物和P i 2DomF引物組成，所述P i 2DomR引物 為序列表SEQID N0:1核苷酸序列的引物;所述Pi2DomF引物為SEQID N0:2核苷酸序列的 引物;具體如下所示。
[0007] Pi2DomR：TCTCTCTTAgCTgATCCAAgTCA
[0008] Pi2DomF:gCAggAATCTCAgATggTgg。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記，包括以下步驟：
[0010 ] 步驟S1;提取水稻的基因組DNA;
[0011]步驟S2:以步驟S1的水稻的基因組DNA為模板，采用如上所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物對(duì)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝 膠電泳以區(qū)分是否為含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻，含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻DNA能擴(kuò) 增出322b的條帶，而不含Pi2抗病基因的水稻DNA模板擴(kuò)增不出目的條帶。
[0012]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20ul的體系，包括：10 X 811打612.0111，(1抑130.4111，濃度為4111〇1/1的？120〇1111?引物和？120〇11^引物各1.0111，丁&9酶 0·2u 1，模板DNA2·0u 1，ddH2012·8u 1。
[0013] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變 性30s，62°C退火30s，72°C延伸45s，其中，變性、退火和延伸三個(gè)步驟循環(huán)35次，72°C最后一 步延伸lOmin。
[0014] 本發(fā)明還提供了如上所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物 在水稻育種中的應(yīng)用。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 第一，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，能準(zhǔn)確判斷水稻育種材料中是否含有Pi2基因。以 往的標(biāo)記判斷都有假陽(yáng)性存在。
[0017]第二，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，PCR擴(kuò)增后，1.2%凝膠電泳即可檢測(cè)，使用方法簡(jiǎn) 單，降低了育種成本。
[0018]第三，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，縮短育種周期，選擇效率理論上達(dá)到100%的準(zhǔn)確 性，實(shí)際應(yīng)用中，檢測(cè)一個(gè)含有Pi2的F2分離群體248個(gè)單株，抗性與基因型完全一致，選擇 效率100%，可以在水稻的分子標(biāo)記輔助育種中發(fā)揮重要作用。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是本發(fā)明不同水稻材料的抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記的凝膠電泳圖。
[0020] 圖中，Μ代表DNA Marker DL2000,從上到下條帶大小依次為2000bp、1000bp、 750bp、500bp、250bp和100bp。
[0021]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2抗性調(diào)查樣品部分水稻DNA樣品的凝膠電泳圖。
[0022]圖3是本發(fā)明實(shí)施例3用M-Pi2擴(kuò)增96個(gè)水稻DNA樣品的凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0024]實(shí)施例1
[0025] 以下實(shí)施例中所用的96個(gè)水稻品種如下表1所示，所選水稻品種來(lái)源于廣西壯族 自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所和廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所所存樣品。
[0026] -種水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物，所述水稻抗稻瘟病基 因Pi2的特異性分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物由Pi2DomR引物和Pi2DomF引物組成，所述Pi2DomR引物 為序列表SEQIDN0:1核苷酸序列的引物;所述Pi2DomF引物為SEQIDN0:2核苷酸序列的 引物。
[0027] 水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記的具體方法和過(guò)程如下：
[0028] 步驟S1;分別提取96個(gè)水稻品種的基因組DNA;
[0029]步驟S2:分別以步驟S1的水稻的基因組DNA為模板，采用所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物對(duì)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝 膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察拍照，96個(gè)水稻品種的電泳圖如圖1所示。
[0030]所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特異性分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物由Pi2DomR引物和 Pi2DomF引物組成，所述Pi2DomR引物為序列表SEQIDN0:1核苷酸序列的引物；所述Pi2DomF引物為SEQIDN0:2核苷酸序列的引物;具體如下所示。
[0031] Pi2DomR：TCTCTCTTAgCTgATCCAAgTCA；
[0032] Pi2DomF：gCAggAATCTCAgATggTgg；
[0033]所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20ul的體系，包括：10XBuffer2 .Oul，dNTP0.4ul， ?120〇1^引物和？120〇11^引物濃度4111〇1丄-1各1.0111，丁&9酶0.2111，模板0財(cái)2.0111， ddH2012.8ul〇
[0034] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延 伸45s，其中，變性、退火和延伸三個(gè)步驟循環(huán)35次，72°C最后一步延伸lOmin。
[0035] 表1 96個(gè)水稻品種表

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