一種廣譜稻瘟病抗病基因Pi40的SCAR標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種廣譜稻瘟病抗病基因 Pi40的SCAR標記 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻痕?。╮ice blast)由子囊菌（Magnaporthe grisea)的無性世代（Pyricularia grisea)引起，是水稻生產(chǎn)中危害最嚴重的世界性的水稻病害。我國每年因稻瘟病而損失的 稻谷約10億千克，稻瘟病已成為制約我國糧食安全及水稻穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的瓶頸。有效防控稻瘟 病對保障我國糧食安全意義重大。我國對水稻稻瘟病抗性育種也十分重視，在水稻品種區(qū) 試中，高感的水稻品種不能通過區(qū)試，具有一票否決的作用。水稻育種實踐證明：選育利用 抗病新品種（組合）是防止該病最行之有效的措施，同時，也是減少農(nóng)業(yè)污染、降低農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)投入、增加農(nóng)民收入的可持續(xù)發(fā)展的最為經(jīng)濟有效的方法；而水稻抗稻瘟病育種的核心 是稻瘟病抗性基因，尤其是廣譜持久抗稻瘟基因，的發(fā)掘與利用。
[0003] 水稻上，對多個稻瘟菌生理小種表現(xiàn)抗性的基因，稱為廣譜抗瘟基因。一般認為， 廣譜抗瘟基因與水稻的水平抗性有關(guān)，由多基因控制。但是有報道表明，在水稻生產(chǎn)中某些 攜帶一個主效抗瘟基因的栽培品種對病原菌有較廣的抗譜，同時在長時間栽種過程中抗性 也不會喪失，具有較好的廣譜持久抗性。水稻廣譜持久抗瘟基因 Pi40來源于澳洲野生稻， Pi40位于水稻第6號染色體著絲粒附近的抗瘟基因簇內(nèi)，位于標記S2539和RM3330之間， 遺傳距離分別為3. 8cM和2. 4cM，對來自韓國和菲律賓毒性最強的稻瘟病菌株表現(xiàn)較強的 抗性。通過電子著陸（e-Landing)技術(shù)分析，在70Kb的染色體區(qū)域內(nèi)，DNA標記9871. T7E2b 與 Pi40 (t)緊密連鎖（Khush and Jena, 2007) 〇
[0004] SCAR(sequence characterized amplified regions 特定序列擴增）標記通常是 從RAPD、SRAP、SSR標記轉(zhuǎn)化而來。SCAR標記是將特異標記片斷從凝膠上回收并進行克隆和 測序，根據(jù)其堿基序列設(shè)計一對特異引物（18-24堿基）；也可對RAH)標記末端進行測序， 在原RAH)所用10堿基引物的末端增加14個左右的堿基，成為與原RAPD片斷末端互補的 特異引物。SCAR標記一般表現(xiàn)為擴增片斷的有無，是一種顯性標記?？沟疚敛』?Pi40的 特異SCAR分子標記的開發(fā)為pi40分子輔助選擇育種提供技術(shù)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種廣譜稻瘟病抗病基因 Pi40的SCAR標記及其應(yīng)用。利用PCR分子標記技術(shù)從3份Pi40粳稻材料中擴增，篩選獲 得特異性片段，然后經(jīng)回收、測序、引物設(shè)計，最終轉(zhuǎn)化為一個Pi40特異性SCAR標記；該標 記在單基因系、及186份水稻育成品種（系）中進一步檢測，發(fā)現(xiàn)其對Pi40基因具有很高 的特異性；在分子標記輔助育種中，利用該標記通過PCR可快速準確篩選出后代群體的抗 性單株。
[0006] 其技術(shù)方案如下：
[0007] -種廣譜稻瘟病抗病基因 Pi40的SCAR標記，引物的序列為： SLtgcacctgaagaagatctact-SiNsi-Cccccaggtcgtgataccttc-S i0
[0008] 本發(fā)明所述廣譜稻瘟病抗病基因 Pi40的SCAR標記在分子標記鑒定過程中的應(yīng) 用。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用PCR分子標記技術(shù)從3份Pi40粳稻材料中擴增，篩 選獲得特異性片段，然后經(jīng)回收、測序、引物設(shè)計，最終轉(zhuǎn)化為一個Pi40特異性SCAR標記； 該標記在單基因系、及186份水稻育成品種（系）中進一步檢測，發(fā)現(xiàn)其對Pi40基因具有 很高的特異性；在分子標記輔助育種中，利用該標記通過PCR可快速準確篩選出后代群體 的抗性單株。
【附圖說明】
[0010] 圖1是3F引物對pi單基因系的擴增結(jié)果；
[0011] 圖2是Pi40特異SCAR標記對部分群體材料的擴增結(jié)果。
【具體實施方式】
[0012] 下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0013] 利用pi40特異性SCAR標記進行分子標記鑒定的具體方法如下：
[0014] 1、以中國普感稻痕病水稻品種一剛江新團黑谷、攜帶Pi40的水稻品系、Pii、pi9、 pita、Piz等單基因系為對照，分析SCAR標記的特異性；
[0015] (1)材料：麗江新團黑谷、3份Pi40高代粳稻回交系（4145、4150和4163)和pita、 piz、pikm、pii和pib等單基因系材料；
[0016] (2)DNA提?。荷鲜霾牧先∮酌缛~片，液氮研磨，利用2XCTAB法提取每個樣品的基 因組總DNA ;
[0017] (3)開發(fā)的 Pi40 特異 SCARf 引物的序列為：5' -tgcacctgaagaagatctact-3'、 5? -cccccaggtcgtgataccttc-3,；
[0018] (4)PCR 反應(yīng)程序為：PCR 反應(yīng)體系共 15 μ 1，其中 IOXPCRbuffer I. 5ul，dNTP I. 125ul，Taq 0· 15ul，F(xiàn)orward Reverse Primer 各 0· lul,模板 DNA Iul，加 ddH20 補足 15ul。PCR 循環(huán)程序：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，25 個 循環(huán)。末次循環(huán)結(jié)束后，將反應(yīng)管置于72°C溫育lOmin，以確保充分延伸；
[0019] (5)上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物放置于1. 5 %瓊脂糖凝膠上電泳，花青素染色，0. 5 X TBE電 泳緩沖液，電壓6V/cm，電泳時間40min，電泳完成后，在凝膠呈像系統(tǒng)拍照并分析結(jié)果；
[0020] (6)Pi40特異性SCAR引物僅在3份Pi40高代粳稻回交系中均能夠擴增出一條約 550bp的特征帶型，而在轟早生（云南地方老品種，攜帶pii)、合系24號（云南粳稻課題組 育成品種，攜帶Pii和pikm)、IR24 (國際水稻所育成品種，攜帶pib)、地谷B和K22 (外省 引進品種，攜帶Pi9)、三鎊七十籮（云南地方老品種，抗病，基因未知）以及其它單基因系材 料中均沒有擴增出特異帶型，如圖1所示：
[0021] 2、以186份水稻品種為模板，分析Pi40特異SCAR標記的應(yīng)用前景；
[0022] ⑴材料：水稻材料186份，具體如表1所示：
[0023] (2)基因組總DNA提取、PCR反應(yīng)和電泳檢測方法同1所述相同；
[0024] (3)結(jié)果：如表1，在186份云南育成水稻品種中的9份（楚粳22號、楚粳27號、 岫粳11號、岫粳14號、岫糯3號、臨秈21號、臨秈26號、紅優(yōu)8號）中擴增出了特異性的 目標帶型，而在其它176份材料中均沒有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，3F對云南育成水稻品種的檢測準 確性達到94. 6%，表明3F可以作為今后在云南水稻育種生產(chǎn)中的pi40抗性育種的MAS標 記加以應(yīng)用。
[0025] 表1 :186份云南水稻材料對Pi40特異SCAR引物的擴增反應(yīng)一覽表


[0029] 3、在抗稻瘟病遺傳改良群體中利用Pi40特異SCAR標記快速篩選抗性單株。
[0030] ⑴材料：合系30號/4163雜交F2群體，214個單株；
[0031] (2)分單株提取DNA，提取方法、PCR反應(yīng)和電泳檢測方法同1所述相同；
[0032] (3)結(jié)果：在214份單株中，應(yīng)用開發(fā)的Pi40特異SCAR標記從中檢測出帶有Pi40 基因的單株120份，如圖2所示。
[0033] 以上所述，僅為本發(fā)明最佳實施方式，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明 披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的 保護范圍內(nèi)。
[0034] SEQUENCE :LISTIHG (序列表） 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所 <α20> -種廣譜稻瘟病抗病基因 Pi40的SCAR標記及其應(yīng)用 <160> 2 PatentIn 'Vefsion :3>:3 <2?0> 1 <2!!> 21 <2i2> ?ΝΑ <213>人工序列 <400> 1 tgcacetgaa gaagatctac t ^ I <210> 2 <211> 21 <2i2> DMA <213〉A(chǔ)工序到 <400> 2 cccccaggic gigaiaccii c 21
【主權(quán)項】
1. 一種廣譜稻瘟病抗病基因Pi40的SCAR標記，其特征在于，引物的序列為： _tgcacctgaagaagatctact_3,、5,-cccccaggtcgtgataccttc_3,〇2. 權(quán)利要求1所述廣譜稻瘟病抗病基因Pi40的SCAR標記在分子標記鑒定過程中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種廣譜稻瘟病抗病基因Pi40的SCAR標記及其應(yīng)用，利用PCR分子標記技術(shù)從3份Pi40粳稻材料中擴增，篩選獲得特異性片段，然后經(jīng)回收、測序、引物設(shè)計，最終轉(zhuǎn)化為一個pi40特異性SCAR標記；該標記在單基因系、及186份水稻育成品種中進一步檢測，發(fā)現(xiàn)其對Pi40基因具有很高的特異性；在分子標記輔助育種中，利用該標記通過PCR可快速準確篩選出后代群體的抗性單株。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105400866
【申請?zhí)枴緾N201510560617
【發(fā)明人】寇姝燕, 袁平榮, 鄒茜
【申請人】云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年9月7日