CRISPR-Cas9特異性敲除豬CMAH基因的方法及用于特異性靶向CMAH基因的sgRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及基因敲除技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及 CRISPR-化s9特異性敲除豬CMAH基因的方法及用于特異性祀向CMAH基因的sgRNA。
【背景技術(shù)】
[0002] 器官移植是治療器官衰竭疾病最有效的治療手段。迄今為止，全球已有近百萬(wàn)的 患者通過器官移植而延續(xù)生命。隨著人口老齡化及醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，需要進(jìn)行器官移植手 術(shù)的病人越來越多，但供體器官的短缺嚴(yán)重制約了器官移植手術(shù)的開展。W腎臟移植為例， 我國(guó)每年需要進(jìn)行腎移植的患者多達(dá)30萬(wàn)，而可用于移植的捐獻(xiàn)腎臟不超過1萬(wàn)例，大部 分患者死于腎衰竭。依靠死后器官捐獻(xiàn)已不能滿足器官移植的需要。通過基因工程改造其 他物種，W提供合適于人體移植的器官，成為解決人類供體器官短缺問題的主要途徑。
[0003] 目前，根據(jù)生物安全性、生理功能指標(biāo)、經(jīng)濟(jì)性及稀有物種保護(hù)等多方面評(píng)價(jià)，豬 成為了最為理想的異種器官來源。但豬和人之間存在巨大的差異，直接將豬的器官移植到 人會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。因此，通過基因工程對(duì)豬進(jìn)行改造，W產(chǎn)生適合于人體移植 的器官，成為異種移植的終極目標(biāo)。
[0004] 免疫學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)豬的細(xì)胞表面表達(dá)一種糖類化合物：N-徑乙酷神經(jīng)氨酸 (N-Glycol}dneuraminic Acid,化u5Gc)。它的合成依賴于胞巧單憐酸-N-乙酷神經(jīng)氨酸徑 化酉每（cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase, CMAH) 〇 人類細(xì) 胞由于缺乏有功能的CMAH基因，不能合成化u5Gc。而豬細(xì)胞表面的化u5Gc進(jìn)入人體后可 被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別并引發(fā)免疫排斥反應(yīng)。因此，需要消除豬細(xì)胞表面的Neu5Gc分子W減 少異種供體器官的免疫原性。而準(zhǔn)確高效的敲除豬CMAH基因，是消除化u5Gc引起的免疫 排斥的關(guān)鍵步驟。
[0005] 目前，常見的基因敲除技術(shù)包括同源重組化omologus Recombination, HR)技術(shù)、 類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子核酸酶（Transcription Activator-Uke Effector Nuclease, TALEN) 技術(shù)、鋒指核酸酶狂inc-Finger Nuclease, ZFN)技術(shù)W及最近發(fā)展的規(guī)律成簇間隔短回 文重復(fù)（Clustered Regularly Interspaced 化ort Palin化omic R巧eat, CRISPR)技術(shù)。 皿技術(shù)由于重組效率低下（效率大約只有10 6)，對(duì)突變體的篩選工作非常耗時(shí)和低效，已 逐漸被取代。TALEN技術(shù)和ZFN技術(shù)的切割效率一般能達(dá)到20%，但都需要構(gòu)建可W識(shí)別 特定序列的蛋白質(zhì)模塊，前期工作繁瑣費(fèi)時(shí)。ZFN技術(shù)的模塊設(shè)計(jì)較為復(fù)雜且有較高的脫祀 率，其應(yīng)用有限。
[0006] CRISIS是一種源于原核生物的后天免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)執(zhí)行干擾功能的復(fù)合物由蛋 白質(zhì)Cas和CRISPR-RNA(crRNA)組成。目前該系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)有Ξ種類型，其中第二類化s9 系統(tǒng)組成簡(jiǎn)單，已被積極應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域?；痵9祀向切割DM是通過兩種小RNA-一 crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)與祀序列互補(bǔ)識(shí)別的原理實(shí)現(xiàn) 的?，F(xiàn)在已經(jīng)將兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡(jiǎn)稱sgRNA(single guide RNA)，能夠識(shí)別 特定的基因序列，引導(dǎo)化s9蛋白進(jìn)行切割。在真核生物中，DM被切斷后發(fā)生非同源重組 末端連接，造成移碼突變，最終導(dǎo)致基因功能性敲除。
[0007] 相比于上述3種技術(shù)，CRISPR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、篩選效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)精確的祀向切 害d。因此，通過CRISPR技術(shù)敲除CMAH基因能夠極大地提高化u5Gc缺失細(xì)胞及基因工程豬 的篩選效率。但是該路徑的關(guān)鍵技術(shù)難題是設(shè)計(jì)并制備精確祀向的sgRNA，因?yàn)榛虻撵胂?精確度高度依賴于sgRNA祀序列，能否成功設(shè)計(jì)出精確祀向的sgRNA成為敲除目的基因的 關(guān)鍵技術(shù)問題，本發(fā)明意在解決該技術(shù)問題從而為敲除CMH基因提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于提供CRISPR-化s9特異性敲除豬CMAH基因的方法及用于特異 性祀向CMAH基因的SgRNA。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供在CRISPR-化s9特異性敲除豬CMAH基因中用 于特異性祀向CMH基因的SgRNA,該SgRNA具有W下特點(diǎn)：
[0010] (1)該SgRNA在CMAH基因上的祀序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列規(guī)則，其 中N(20)表示20個(gè)連續(xù)的堿基，其中每個(gè)N表示A或T或C或G，符合上述規(guī)則的祀序列位 于正義鏈或反義鏈；
[0011] 似該SgRNA在CMAH基因上的祀序列位于CMAH基因的N端的5個(gè)外顯子編碼區(qū)， 或祀序列的一部分位于CMAH基因的N端的5個(gè)外顯子，其余部分跨越與相鄰內(nèi)含子的交 界，位于相鄰內(nèi)含子；
[0012] (3)該SgRNA在CMAH基因上的祀序列是唯一的。
[0013] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述祀序列為序列表中SEQ ID NO :1~61中任一條序列 所示的序列。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述祀序列為序列表中SEQ ID NO :2或4所示的序列。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供運(yùn)用CRISPR-化s9特異性敲除豬CMAH基因的 方法，該方法包括如下步驟：
[0016] (1)在第一方面所述的SgRNA的祀序列的5'-端加上用于形成粘性末端的序列， 合成得到正向寡核巧酸序列；在第一方面所述的SgRNA的祀序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列的兩端加 上合適的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核巧酸序列；將合成的正向寡核巧酸 序列與反向寡核巧酸序列退火、復(fù)性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核巧酸；
[0017] (2)將上述雙鏈寡聚核巧酸連入線性化的攜帶化s9基因的表達(dá)載體，得到攜帶含 相應(yīng)祀序列的SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選鑒定出正 確的陽(yáng)性克隆，并對(duì)陽(yáng)性克隆搖菌、提取質(zhì)粒；
[001引 （3)用上述攜帶有SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表達(dá)載體、包裝質(zhì)粒和包裝細(xì) 胞系包裝出同時(shí)攜帶祀向CMAH基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0019] (4)使用上述假型慢病毒感染目的細(xì)胞，并進(jìn)一步培養(yǎng)；然后收集被感染的目的 細(xì)胞，W其基因組DNA為模板擴(kuò)增包含上述祀序列的基因片段，經(jīng)過變性、復(fù)性及酶切，確 定CMAH基因的敲除情況。
[0020] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述表達(dá)載體為序列表中SEQ ID NO :62所示序列的載 體。
[0021] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述方法包括如下步驟：
[002引 （1)在第一方面所述的sgRNA的祀序列的5'-端加上CACCG序列，合成得到正向 寡核巧酸序列；在第一方面所述的sgRNA的祀序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列的5'-端加上AAAC序 列、3'-端加上C，合成得到反向寡核巧酸序列；將合成的正向寡核巧酸序列與反向寡核巧 酸序列退火、復(fù)性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核巧酸；
[0023] (2)將上述雙鏈寡聚核巧酸連入如序列表中SEQ ID NO :62所示序列的表達(dá)載體 lentiCRISPR v2經(jīng)BsmB I限制性內(nèi)切酶酶切得到的線性化載體，得到攜帶SgRNA寡聚核巧 酸的重組表達(dá)載體lentiCRISPR V2-CMAH，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選鑒定出正確的陽(yáng)性克隆， 并對(duì)陽(yáng)性克隆搖菌、提取質(zhì)粒；
[0024] (3)用上述表達(dá)載體lentiCRISPR V2-CMAH、包裝質(zhì)粒和包裝細(xì)胞系包裝出同時(shí)攜 帶祀向CMAH基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[002引（4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的細(xì)胞，并進(jìn)一步培養(yǎng)；然后收集被感染 的目的細(xì)胞，W其基因組DNA為模板擴(kuò)增包含上述祀序列的基因片段，經(jīng)過變性、復(fù)性及酶 化確定CMAH基因的敲除情況。
[0026] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述包裝質(zhì)粒為質(zhì)粒pLPl、質(zhì)粒pLP2和質(zhì)粒pLP/VSVG ; 上述包裝細(xì)胞系為肥K293T細(xì)胞。
[0027] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述目的細(xì)胞為豬PIEC細(xì)胞。
[002引作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述W其基因組DNA為模板擴(kuò)增包含上述祀序列的基因 片段，經(jīng)過變性、復(fù)性及酶切，確定CMAH基因的敲除情況，具體為：
[0029] (a) W感染病毒的目的細(xì)胞的基因組DNA為模板，用CMAH基因的上下游引物擴(kuò)增 包含上述SgRNA的祀序列的CMAH基因片段，同時(shí)用相同引物擴(kuò)增未感染病毒的野生型細(xì)胞 的基因組DNA ;
[0030] 化）純化上述擴(kuò)增到的CMAH基因片段，然后將來自感染病毒的目的細(xì)胞的CMAH基 因片段與來自野生型細(xì)胞的CMAH基因片段等量混合、加熱變性、復(fù)性，形成雜交DNA分子；
[0031] (C)用化uiser酶切割復(fù)性后的雜交DNA分子；
[003引 （d)電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，檢測(cè)祀序列介導(dǎo)的CMAH基因敲除效果。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的第Ξ方面，本發(fā)明提供在CRISPR-化s9特異性敲除豬CMAH基因的方 法中用到的重組表達(dá)載體lentiCRISPR V2-CMAH，該重組表達(dá)載體的骨架載體的序列如序 列表中SEQ ID NO :62所示；所攜帶的祀序列如第一方面的SgRNA的祀序列，優(yōu)選序列表中 SEQ ID NO :2或4所示的祀序列。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的SgRNA或第Ξ方面所述的 重組表達(dá)載體lentiCRISPR V2-CMAH在CRISPR-化s9特異性敲除豬CMAH基因的方法中的 用途。
[003引