一種泰國庫蠓的特異基因及其分子鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及物種鑒定領域，具體設及泰國庫朦的特異基因序列及其分子鑒定方 法。
【背景技術】
[0002] 庫朦是我國Ξ大吸血朦之一，可傳播藍舌病、住球蟲病等多種人獸共患病，是一種 重要的病媒生物。因此，對吸血朦的鑒定和識別，是監(jiān)測與控制朦傳疾病發(fā)生的基礎，也是 疾病預防控制領域的核屯、步驟。目前，對吸血朦的鑒定主要依靠經(jīng)驗豐富的分類學專家識 別形態(tài)學特征來實現(xiàn)，一旦遇到近緣種和形態(tài)特征掌握不全的標本鑒定就很棘手;而且，對 吸血朦的形態(tài)鑒定需要通過制作玻片標本來完成，操作步驟繁瑣、周期長、難度大，因此，亟 需尋求一種新的方法，W彌補傳統(tǒng)分類方法的缺陷。
[0003] 分子鑒定技術是W遺傳物質(zhì)DNA序列分析為依據(jù)來闡明物種間的差別，從分子水 平上快速而準確地鑒別物種。它是分子生物學、計算機科學與傳統(tǒng)分類學相結(jié)合的產(chǎn)物，作 為一種嶄新的分類學技術，極大彌補了傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的缺陷，已引起越來越多生物學家 們的重視。近年來，隨著W PCR基礎的DNA序列測定方法的建立和廣泛使用，核糖體DNA (rDNA)和線粒體DNA(mtDNA)等基因逐漸受到重視，并在吸血朦的分子鑒定中得到廣泛應 用。該技術與傳統(tǒng)的分類方法互為佐證，不僅可解決鑒定中標本殘缺不全等問題，而且可實 現(xiàn)吸血朦的快速鑒定。本發(fā)明提供的泰國庫朦特異基因序列有利于實現(xiàn)泰國庫朦的快速鑒 定，縮短鑒定時間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種泰國庫朦的特異基因序列及其分子鑒定方法。通過分 子生物學方法獲取泰國庫朦(化licoides inthanonensis)特異基因一16S rDNA基因序列， 通過基因序列相似性的比對，可準確、快速地鑒定泰國庫朦。
[000引為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)： 采用小型昆蟲微量DNA模板制備方法，通過改進的PCR反應條件，由合成的引物擴增 泰國庫朦的16S rDNA基因，PCR產(chǎn)物序列送由專業(yè)生物公司測定。測序結(jié)果通過手工校對、 序列拼接，并在NCBI中進行Blast相似性捜索，確保所得序列為目標序列。本發(fā)明所述的 泰國庫朦特異基因，為16S rDNA基因，所述庫朦的16S rDNA基因序列如SEQ ID No. 1所示 (不含引物）：
[0006] 本發(fā)明所述的泰國庫朦16S rDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列為： 正向引物 5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' 反向引物 5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。
[0007] 本發(fā)明所述的泰國庫朦的分子鑒定方法，包括： 1) 從待測的昆蟲組織中分離提取DNA; 2) m亥DNA為模板，采用的引物為:正向引物5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3'，反向引物5' CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'，通過聚合酶鏈式反應擴增出該昆蟲的16S rDNA基因； 3) 然后取適量步驟2)的聚合酶鏈式反應擴增出的16S rDNA基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng) 漠乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。若能相應地特異性擴增出 大小約為511 bp的條帶，送生物公司測序； 4) 根據(jù)測序結(jié)果，若目標基因序列與SEQ ID No.1的相似性在98%W上，即可判斷所述 的待測組織為泰國庫朦。
[0008] 泰國庫朦的種類鑒定依靠形態(tài)學鑒定所實現(xiàn)，并經(jīng)權(quán)威專家復核，從而保證了結(jié) 果的可靠性。
[0009] 所述引物根據(jù)文獻合成，正向引物5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3'，反向引物5' CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。
[0010] 本發(fā)明可用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法檢測擴增結(jié)果。
[00·Μ]本發(fā)明的優(yōu)點為： 1)本發(fā)明采用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定與分子分類方法相結(jié)合，對所述庫朦進行鑒定，可確 保物種鑒定的準確性和可靠性。
[0012] 2)與傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法相比，本發(fā)明建立的泰國庫朦分子鑒定方法可有效縮 短泰國庫朦的鑒定時間。
【附圖說明】
[001引圖1為泰國庫朦16S rDNA基因 PCR擴增結(jié)果電泳鑒定圖。編號說明如下:泳道訪陰 性對照，泳道2-4為泰國庫朦雌蟲的16S rDNA基因，檢出大小約為511 bp的條帶。Μ為化 2000的DNA marker。
[0014]圖2為未知庫朦雌蟲16S rDNA基因 PCR擴增結(jié)果電泳鑒定圖。編號說明如下：泳道1 為陰性對照，泳道2-3為未知庫朦雌蟲的16S rDNA基因，檢出大小約為511 bp的條帶。Μ為化 2000的DNA marker。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1泰國庫朦(Qilicoides inthanonensis)16S rDNA基因序列的獲取 1、泰國庫朦標本的獲取 泰國庫朦為野外采集獲得的標本，經(jīng)冷凍處死后直接保存于95%酒精中。標本制成玻片 后經(jīng)權(quán)威專家鑒定，確保鑒定結(jié)果的準確性。標本制作前，挑取泰國庫朦胸部末端和腹部前 幾節(jié)置于95%酒精中，供DNA提取。
[0016] 2、DNA模板制備 采用小型昆蟲微量DNA模板制備方法提取泰國庫朦DNA(文禮章主編.昆蟲學研究方法 與技術導論[M].北京:科學出版社，2010. PP278-286)，提取的DNA樣品保存于-20°C備用。
[0017] 3、引物合成 本實施例所用引物如下： 正向引物 5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' 反向引物 5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。
[0018] 4、PCR 擴增 本實施例的PCR反應體系如表1所示。
[0019] 表1泰國庫朦16S rDNA基因 PCR反應體系巧OuL體系）
本實施例的反應程序如表2所示。
[0020] 表2泰國庫朦16S rDNA基因 PCR反應程序
PCR產(chǎn)物于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021 ] 5、PCR擴增產(chǎn)物檢測 取扣L PCR擴增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35 min)。漠乙錠染色，凝膠 成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見附圖1。
[0022] 6、基因序列測定 選取3-5個效果較好的PCR擴增產(chǎn)物送由生物公司純化后測序(測序所用引物與PCR所 用引物相同），所得基因序列經(jīng)校正拼接后即為泰國庫朦的16S rDNA基因序列一SEQ ID No.l。
[0023] 實施例2未知庫朦的鑒定 1、標本的采集與保存 采用揮網(wǎng)法或燈誘法進行采集，采獲的標本經(jīng)冷凍處死后直接保存于95%酒精中。
[0024] 2、DNA模板制備 在解剖鏡或體視顯微鏡下，從采集到的朦類標本中隨機挑出一只雌性庫朦，采用小型 昆蟲微量DNA模板制備方法提取庫朦DNA(文禮章主編.昆蟲學研究方法與技術導論[M].北 京:科學出版社，2010. PP278-286)，提取的DNA樣品于-20°C保存?zhèn)溆茫糠輼吮疽粋€編號。
[0025] 3、目的基因序列的獲取 3.1引物合成 W獲得的未知庫朦DNA為模板，合成引物，所用引物序列如下： 正向引物 5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' 反向引物 5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。
[0026] 3.2 PCR擴增 本實施例的PCR反應體系如表3所示。
[0027] 表3未知庫朦16S rDNA基因 PCR反應體系巧OuL體系)_
本實施例的反應程序如表4所示。
[002引 表4未知庫朦16S rDNA基因 PCR反應程序_
PCR產(chǎn)物于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 3.3 PCR擴增產(chǎn)物檢測與基因序列測定 取扣L PCR擴增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35 min)。漠化乙錠染色。凝 膠成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見附圖2。由附圖2看出實施例2的未知庫朦也能特異性擴增出 大小約為511 bp的產(chǎn)物，將大小約為511 bp的產(chǎn)物送生物公司測序，結(jié)果顯示與基因序 列SEQ ID NO. 1的相似性為99.9%，因而可判定該未知庫朦為泰國庫朦。
【主權(quán)項】
1. 一種泰國庫朦特異基因，其特征在于，所述基因為16S rDNA基因，為如下所述的基因 序列沈Q ID No. 1:2. 權(quán)利要求1所述的庫朦的16S rDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列分別為： 正向引物 5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' 反向引物 5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。3. -種泰國庫朦的分子鑒定方法，包括： 1) 從待測的昆蟲組織中分離提取DNA; 2. W該DNA為模板，對16S rDNA基因采用的引物為：正向引物5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' '，反向引物5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'，通過聚合酶鏈式反應擴增出泰國庫朦16S rDNA 基因； 3) 然后取適量步驟2)的聚合酶鏈式反應擴增出的16S rDNA基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng) 漠乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性擴增出大小 約為511 bp的條帶，送生物公司測序； 4) 根據(jù)測序結(jié)果，如果相應16S rDNA基因序列與SEQ ID No.l的相似性在98%W上，即 可判斷所述的待測組織為泰國庫朦。
【專利摘要】本發(fā)明公開<b>一種泰國庫蠓的特異基因及其分子鑒定方法，</b>其特征在于采用分子生物學方法獲取該庫蠓的16S？rDNA基因序列，通過基因序列相似性的比對，對該庫蠓進行種類鑒定。本發(fā)明提供的泰國庫蠓分子鑒定方法，有利于實現(xiàn)泰國庫蠓準確、快速的鑒定。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105543364
【申請?zhí)枴緾N201610012014
【發(fā)明人】黃恩炯, 陳敏, 楊美瓊, 張建明, 高博, 張建慶, 王飛鵬
【申請人】福建國際旅行衛(wèi)生保健中心
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月8日