本發(fā)明屬于環(huán)境污染治理領(lǐng)域，涉及一種降低含人工合成抗菌藥水體中生物毒性的方法。

背景技術(shù)：

以磺胺甲惡唑(smx)、諾氟沙星(nor)為代表的磺胺類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物近年來(lái)被廣泛使用，它們不僅用于治療人類(lèi)和獸類(lèi)疾病，還作為飼料添加劑用于畜牧業(yè)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。磺胺甲惡唑(smx)和諾氟沙星(nor)不能被人類(lèi)和獸類(lèi)完全代謝，因此大部分以母體或代謝物的形式通過(guò)尿液或者糞便排出體外，繼而重新進(jìn)入水體環(huán)境中。水體環(huán)境中的磺胺甲惡唑(smx)和諾氟沙星(nor)會(huì)導(dǎo)致抗性基因的形成與傳播，從而威脅公眾健康，因此亟待尋求有效的方法從水體環(huán)境中去除這些藥物。物理方法例如光解、光催化雖能移除磺胺甲惡唑(smx)和諾氟沙星(nor)但會(huì)造成二次污染，同時(shí)物理方法費(fèi)用也較高。

近年來(lái)，白腐真菌在生物修復(fù)異生物質(zhì)污染方面引起了廣泛的關(guān)注。單一白腐真菌雖能達(dá)到移除異生物質(zhì)的能力，但自然環(huán)境中混菌體系普遍存在。污染物的移除可能不是一種微生物而是兩種乃至三種以上微生物共同作用的結(jié)果。水體環(huán)境中的磺胺甲惡唑(smx)和諾氟沙星(nor)會(huì)抑制水體中正常存在的微生物的生長(zhǎng)，即對(duì)微生物具有生物毒性?；前芳讗哼?smx)和諾氟沙星(nor)在去除過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些毒性更大的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，對(duì)水體中正常存在的微生物可能毒性更大，即使去除了水體中這些污染物但對(duì)環(huán)境造成了更大的污染，因此以水體中正常存在的微生物為指示菌來(lái)評(píng)估磺胺甲惡唑(smx)和諾氟沙星(nor)去除后水體中的生物毒性是必要的。既能有效的去除污染物又能更好的減少污染物的生物毒性才能實(shí)現(xiàn)環(huán)境污染治理領(lǐng)域的雙贏。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)可能會(huì)形成二次污染以及較大生物毒性的不足，提供一種降低含人工合成抗菌藥水體中生物毒性的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

降低含人工合成抗菌藥水體中生物毒性的方法，包括如下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將保藏編號(hào)為cgmcc5.776的黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在28-35℃培養(yǎng)4-6天；再轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在28-35℃，在攪拌下，培養(yǎng)45-50小時(shí)，得到黃孢原毛平革菌一級(jí)種子；

將保藏編號(hào)為cgmcc5.815的血紅密孔菌(pycnoporussanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在28-35℃培養(yǎng)5-7天；再轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在28-35℃，在攪拌下，培養(yǎng)45-50小時(shí)，得到血紅密孔菌一級(jí)種子；

(2)降解液配制：將含人工合成抗菌藥的水體與發(fā)酵培養(yǎng)基混合配成降解液，使降解液中人工合成抗菌藥的濃度在2-10mg/l；

(3)按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子15-25ml干重條件下的濃度為0.09-0.15g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子15-25ml干重條件下的濃度為0.09-0.15g/l，在6000-8000rpm離心10-15min，棄上清，放入降解液中，使總體積為500ml，在28-35℃，150-200rpm，混合發(fā)酵180-200h，6000-8000rpm離心，收集上清；

(4)將步驟(3)獲得的上清與luria-bertani培養(yǎng)基按4:1比例混合，接入大腸桿菌(e.colidh5α)和枯草芽孢桿菌(b.subtilisrh33)，使所述大腸桿菌的初始光密度od600＝0.2，使所述枯草芽孢桿菌初始光密度od600＝0.2，監(jiān)測(cè)所述大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在24h內(nèi)od600變化，od600與含人工合成抗菌藥水體中生物毒性成反比。

優(yōu)選地，人工合成抗菌藥為磺胺類(lèi)藥或氟喹諾酮類(lèi)藥。

磺胺類(lèi)藥物優(yōu)選磺胺甲惡唑或磺胺異惡唑，也可以是其它的磺胺類(lèi)藥物。

氟喹諾酮類(lèi)藥優(yōu)選諾氟沙星或環(huán)丙沙星，也可以是其它的氟喹諾酮類(lèi)藥物。

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選：葡萄糖,10g/l；酒石酸銨,0.2g/l；醋酸鈉緩沖液(ph4.5),20mm/l；kh2po4,2.0g/l；mgso4·7h2o,0.71g/l；維生素b1,1mg/l；cacl2·2h2o,0.1g/l；氨三乙酸,1.5g/l；cuso4,0.1g/l；znso4·7h2o,0.1g/l；mnso4,0.5g/l；nacl,1g/l；cocl2,0.1g/l；feso4·7h2o,0.1g/l；na2moo4·2h2o,0.01g/l；kal(so4)2·12h2o,0.01g/l；h3bo3,0.01g/l；其余為水。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的方法用黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)和血紅密孔菌(pycnoporussanguineus)混合培養(yǎng)降解含人工合成抗菌藥水體，降低該水體生物毒性的效果較單一的黃孢原毛平革菌或血紅密孔菌要好。環(huán)保。

附圖說(shuō)明

圖1為在發(fā)酵培養(yǎng)基條件下p.chrysosporium和p.sanguineus單菌和混菌系統(tǒng)中移除磺胺甲惡唑和諾氟沙星的情況。圖中，smx：磺胺甲惡唑；nor：諾氟沙星

圖2為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在p.sanguineus單菌以及p.chrysosporium和p.sanguineus混菌體系處理后的磺胺甲惡唑和諾氟沙星廢水中生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

ps+nor：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)p.sanguineus去除諾氟沙星192h后的上清2

ps+smx：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)p.sanguineus去除磺胺甲惡唑192h后的上清1

cs+nor：混菌培養(yǎng)去除諾氟沙星192h后的上清2

cs+smx：混菌培養(yǎng)去除磺胺甲惡唑192h后的上清1

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

各實(shí)施例中：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂18g/l，自然ph，余量是水。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g/l，葡萄糖20g/l，自然ph，余量是水。

發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖，10g/l；酒石酸銨，0.2g/l；ph＝4.5醋酸鈉緩沖液，20mm/l；kh2po4，2.0g/l；mgso4·7h2o，0.71g/l；維生素b1，1mg/l；cacl2·2h2o，0.1g/l；氨三乙酸，1.5g/l；cuso4，0.1g/l；znso4·7h2o，0.1g/l；mnso4，0.5g/l；nacl，1g/l；cocl2，0.1g/l；feso4·7h2o，0.1g/l；na2moo4·2h2o，0.01g/l；kal(so4)2·12h2o，0.01g/l；h3bo3，0.01g/l；其余為水。

luria-bertani培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，余量是水。

含磺胺類(lèi)藥物的水和含氟喹諾酮藥物的水為在純凈的蒸餾水中添加磺胺類(lèi)藥物或氟喹諾酮藥物。

實(shí)施例1

降低含人工合成抗菌藥水體中生物毒性的方法，包括如下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將保藏編號(hào)為cgmcc5.776的黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)5天；取150cm²面積的菌絲轉(zhuǎn)入100ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在30℃，在160rpm攪拌下，培養(yǎng)48小時(shí)，得到黃孢原毛平革菌一級(jí)種子；

將保藏編號(hào)為cgmcc5.815的血紅密孔菌(pycnoporussanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)6天；取150cm²面積的菌絲轉(zhuǎn)入100ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在30℃，在160rpm攪拌下，培養(yǎng)48小時(shí)，得到血紅密孔菌一級(jí)種子；

(2)降解液配制：將含磺胺甲惡唑的水和含諾氟沙星的水分別與發(fā)酵培養(yǎng)基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺甲惡唑的濃度為10mg/l，使降解液2中諾氟沙星的濃度為10mg/l；

(3)按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l，在8000rpm離心10min，棄上清，用部分降解液1將菌體重懸后，放入降解液1中，使總體積為500ml，在30℃，160rpm，混合發(fā)酵192h，8000rpm離心，收集上清，得上清1；

按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l，在8000rpm離心10min，棄上清，用部分降解液2將菌體重懸后，放入降解液2中，使總體積為500ml，在30℃，160rpm，混合發(fā)酵192h，8000rpm離心，收集上清，得上清2；

(4)將步驟(3)獲得的上清1和上清2，分別與luria-bertani培養(yǎng)基按4:1比例混合，接入大腸桿菌(e.colidh5α)和枯草芽孢桿菌(b.subtilisrh33)，使大腸桿菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢桿菌初始光密度od600＝0.2，監(jiān)測(cè)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在24h內(nèi)od600變化。

本實(shí)施例的混菌在192h內(nèi)完全去除水體中的人工合成抗菌藥磺胺甲惡唑和諾氟沙星。

在含諾氟沙星轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水體中大腸桿菌的od600隨時(shí)間的增加而增加，15h達(dá)到最大od600為2.5，15h以后隨時(shí)間增加而下降，24h時(shí)為2.3(圖2a)。

在含磺胺甲惡唑轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水體中大腸桿菌的od600隨時(shí)間的增加而增加，15h達(dá)到最大od600為3.0，15h以后隨時(shí)間增加而保持不變，24h時(shí)依然是3.0(圖2b)。

在含諾氟沙星轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水體中枯草芽孢桿菌的od600隨時(shí)間的增加而增加，12h達(dá)到最大od600為2.2，15h以后隨時(shí)間增加而下降，24h時(shí)為1.5(圖2c)。

在含磺胺甲惡唑轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水體中枯草芽孢桿菌的od600隨時(shí)間的增加而增加，9h達(dá)到最大od600為2.0，9h以后隨時(shí)間增加而逐漸減小，24h時(shí)為1.65(圖2d)。

實(shí)施例2

降低含人工合成抗菌藥水體中生物毒性的方法，包括如下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將保藏編號(hào)為cgmcc5.776的黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)6天；取150cm²面積的菌絲轉(zhuǎn)入100ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在28℃，在160rpm攪拌下，培養(yǎng)50小時(shí)，得到黃孢原毛平革菌一級(jí)種子；

將保藏編號(hào)為cgmcc5.815的血紅密孔菌(pycnoporussanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)7天；取150cm²面積的菌絲轉(zhuǎn)入100ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在28℃，在160rpm攪拌下，培養(yǎng)50小時(shí)，得到血紅密孔菌一級(jí)種子；

(2)降解液配制：將含磺胺異惡唑的水和含諾氟沙星的水分別與發(fā)酵培養(yǎng)基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺異惡唑的濃度為5mg/l，使降解液2中諾氟沙星的濃度為5mg/l；

(3)按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子15ml干重條件下的濃度為0.1g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子15ml干重條件下的濃度為0.1g/l，在6000rpm離心13min，棄上清，用部分降解液1將菌體重懸后，放入降解液1中，使總體積為500ml，在28℃，150rpm，混合發(fā)酵180h，6000rpm離心，收集上清，得上清1；

按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子15ml干重條件下的濃度為0.1g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子15ml干重條件下的濃度為0.1g/l，在6000rpm離心13min，棄上清，用部分降解液2將菌體重懸后，放入降解液2中，使總體積為500ml，在28℃，150rpm，混合發(fā)酵180h，6000rpm離心，收集上清，得上清2；

(4)將步驟(3)獲得的上清1和上清2，分別與luria-bertani培養(yǎng)基按4:1比例混合，接入大腸桿菌(e.colidh5α)和枯草芽孢桿菌(b.subtilisrh33)，使大腸桿菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢桿菌初始光密度od600＝0.2，監(jiān)測(cè)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在24h內(nèi)od600變化，od600與含人工合成抗菌藥水體中生物毒性成反比。

實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的效果與實(shí)施例1相似。

實(shí)施例3

降低含人工合成抗菌藥水體中生物毒性的方法，包括如下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將保藏編號(hào)為cgmcc5.776的黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在35℃培養(yǎng)4天；取150cm²面積的菌絲轉(zhuǎn)入100ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在35℃，在160rpm攪拌下，培養(yǎng)45小時(shí)，得到黃孢原毛平革菌一級(jí)種子；

將保藏編號(hào)為cgmcc5.815的血紅密孔菌(pycnoporussanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在35℃培養(yǎng)5天；取150cm²面積的菌絲轉(zhuǎn)入100ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在35℃，在160rpm攪拌下，培養(yǎng)45小時(shí)，得到血紅密孔菌一級(jí)種子；

(2)降解液配制：將含磺胺甲惡唑的水和含環(huán)丙沙星的水分別與發(fā)酵培養(yǎng)基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺甲惡唑的濃度為2mg/l，使降解液2中環(huán)丙沙星的濃度為2mg/l；

(3)按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子20ml干重條件下的濃度為0.09g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子20ml干重條件下的濃度為0.09g/l，在7000rpm離心15min，棄上清，用部分降解液1將菌體重懸后，放入降解液1中，使總體積為500ml，在35℃，200rpm，混合發(fā)酵200h，7000rpm離心，收集上清，得上清1；

按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子20ml干重條件下的濃度為0.09g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子20ml干重條件下的濃度為0.09g/l，在7000rpm離心15min，棄上清，用部分降解液2將菌體重懸后，放入降解液2中，使總體積為500ml，在35℃，200rpm，混合發(fā)酵200h，7000rpm離心，收集上清，得上清2；

(4)將步驟(3)獲得的上清1和上清2，分別與luria-bertani培養(yǎng)基按4:1比例混合，接入大腸桿菌(e.colidh5α)和枯草芽孢桿菌(b.subtilisrh33)，使大腸桿菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢桿菌初始光密度od600＝0.2，監(jiān)測(cè)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在24h內(nèi)od600變化，od600與含人工合成抗菌藥水體中生物毒性成反比。

實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的效果與實(shí)施例1相似。

對(duì)比例1

(1)將保藏編號(hào)為cgmcc5.776的黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)5天；取150cm²面積的菌絲轉(zhuǎn)入100ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在30℃，在160rpm攪拌下，培養(yǎng)48小時(shí)，得到黃孢原毛平革菌一級(jí)種子；

(2)降解液配制：將含磺胺甲惡唑的水和含諾氟沙星的水分別與發(fā)酵培養(yǎng)基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺甲惡唑的濃度為10mg/l，使降解液2中諾氟沙星的濃度為10mg/l；

(3)按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l，在8000rpm離心10min，棄上清，用部分降解液1將菌體重懸后，放入降解液1中，使總體積為500ml，在30℃，160rpm，混合發(fā)酵192h，8000rpm離心，收集上清，得上清1；

按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l，在8000rpm離心10min，棄上清，用部分降解液2將菌體重懸后，放入降解液2中，使總體積為500ml，在30℃，160rpm，混合發(fā)酵192h，8000rpm離心，收集上清，得上清2；

(4)將步驟(3)獲得的上清1和上清2，分別與luria-bertani培養(yǎng)基按4:1比例混合，接入大腸桿菌(e.colidh5α)和枯草芽孢桿菌(b.subtilisrh33)，使大腸桿菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢桿菌初始光密度od600＝0.2，監(jiān)測(cè)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在24h內(nèi)od600變化。

黃孢原毛平革菌在192h內(nèi)去除63.2％磺胺甲惡唑，73.1％的諾氟沙星。

對(duì)比例2：

(1)將保藏編號(hào)為cgmcc5.815的血紅密孔菌(pycnoporussanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)6天；取150cm²面積的菌絲轉(zhuǎn)入100ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中在30℃，在160rpm攪拌下，培養(yǎng)48小時(shí)，得到血紅密孔菌一級(jí)種子；

(2)降解液配制：將含磺胺甲惡唑的水和含諾氟沙星的水分別與發(fā)酵培養(yǎng)基混合配成降解液1和降解液2，使降解液1中磺胺甲惡唑的濃度為10mg/l，使降解液2中諾氟沙星的濃度為10mg/l；

(3)按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l，在8000rpm離心10min，棄上清，用部分降解液1將菌體重懸后，放入降解液1中，使總體積為500ml，在30℃，160rpm，混合發(fā)酵192h，8000rpm離心，收集上清，得上清1；

按比例，取步驟(1)獲得的黃孢原毛平革菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l和血紅密孔菌的一級(jí)種子25ml干重條件下的濃度為0.15g/l，在8000rpm離心10min，棄上清，用部分降解液2將菌體重懸后，放入降解液2中，使總體積為500ml，在30℃，160rpm，混合發(fā)酵192h，8000rpm離心，收集上清，得上清1；

(4)將步驟(3)獲得的上清1和上清2，分別與luria-bertani培養(yǎng)基按4:1比例混合，接入大腸桿菌(e.colidh5α)和枯草芽孢桿菌(b.subtilisrh33)，使大腸桿菌的初始光密度od600＝0.2，使枯草芽孢桿菌初始光密度od600＝0.2，監(jiān)測(cè)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在24h內(nèi)od600變化。

血紅密孔菌在192h內(nèi)完全去除水體中的人工合成抗菌藥磺胺甲惡唑和諾氟沙星。

在含諾氟沙星轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水體中大腸桿菌的od600隨時(shí)間的增加而增加，12h達(dá)到最大od600為2.0，12h以后隨時(shí)間增加而下降，24h時(shí)為1.72。

在含磺胺甲惡唑轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水體中大腸桿菌的od600隨時(shí)間的增加而增加，9h達(dá)到最大od600為2.38，9h以后隨時(shí)間增加od600逐漸減小，24h時(shí)依然是2.03。

在含諾氟沙星轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水體中枯草芽孢桿菌的od600隨時(shí)間的增加而增加，15h達(dá)到最大od600為1.86，15h以后隨時(shí)間增加而下降，24h時(shí)為1.03。

在含磺胺甲惡唑轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水體中枯草芽孢桿菌的od600隨時(shí)間的增加而增加，9hod600為1.29，24h時(shí)為1.38。

高效液相色譜所用色譜柱為c18色譜柱(250×4.6mm,5μm)，所用儀器為waterse2695alliancehplc和2489uv/vis檢測(cè)器，磺胺甲惡唑檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm，諾氟沙星檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm。檢測(cè)條件為：色譜柱溫度30℃，進(jìn)樣體積50μl，流速1ml·min^-1。流動(dòng)相組成：40％乙腈和60％水(含0.1％甲酸)。