專利名稱：檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法。
背景技術(shù)：
多糖是自然界含量最豐富的高分子化合物，其在自然界分布極其廣泛，高等植物、 藻類、菌類及動(dòng)物體內(nèi)均有存在，多糖類物質(zhì)所具有的多種生物學(xué)及藥理功能已經(jīng)引起人們的高度重視，多糖科學(xué)作為后基因組時(shí)代異軍突起的學(xué)科已納入國際前沿研究領(lǐng)域，多糖具有自身無光學(xué)功能團(tuán)，其分子量在一定范圍內(nèi)變化等特點(diǎn)，無法直接用高靈敏的紫外、 熒光或質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)多糖含量，目前，常用的多糖含量檢測(cè)方法主要有顯色法、同位素標(biāo)記法、免疫學(xué)法、生物檢定法等，顯色法檢測(cè)限約10微克，具有專屬性差等缺點(diǎn)；同位素標(biāo)記法、免疫學(xué)法及生物檢定法檢測(cè)限均可小于10納克，但均不能同時(shí)測(cè)定代謝產(chǎn)物，同位素標(biāo)記法不適用于人體的藥代研究，且標(biāo)記可能改變多糖結(jié)構(gòu)，具有抗原決定簇的代謝片斷可能增加免疫學(xué)法的誤差等缺點(diǎn)；生物檢定法需要找到靈敏的生化指標(biāo)，具有應(yīng)用范圍非常有限等缺點(diǎn)，現(xiàn)有的多糖含量檢測(cè)方法以及其它酶聯(lián)免疫法在檢測(cè)發(fā)酵液中莢膜多糖含量時(shí)具有不能直接檢測(cè)，特異性不強(qiáng)，線性和檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確度較差等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可直接測(cè)量，特異性強(qiáng)，線性和檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確度較好，可為發(fā)酵階段工藝改進(jìn)提高重要量化手段的檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟
(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內(nèi)，樣品液的濃度為10 IOOpg/
ml ；
(2)收集經(jīng)b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為0.5 1. 5ng/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度檢測(cè)，待純度為90%以上時(shí)，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體，洗滌除去雜質(zhì)；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標(biāo)微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體、雜質(zhì)；
(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標(biāo)記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，HRP的濃度為0. 5 1. 5ng/ml，洗滌除去未結(jié)合的抗原、雜質(zhì)；
(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物徹底洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體、雜質(zhì)，加入TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關(guān)；
(6)用酶標(biāo)儀在400 500nm波長下測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供一種檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法，采用經(jīng)高度純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標(biāo)板，并制成酶標(biāo)記復(fù)合物，在兔血清b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體分離純化上，得到單抗，解決了發(fā)酵液莢膜多糖酶聯(lián)免疫檢測(cè)法特異性問題，克服了現(xiàn)有檢測(cè)方法不能直接、正確檢測(cè)發(fā)酵液多糖含量的不足，可直觀、準(zhǔn)確、迅速的檢測(cè)發(fā)酵液中莢膜多糖的含量，可作為發(fā)酵工藝的重要監(jiān)控手段，為發(fā)酵收罐時(shí)間的確定提供了重要的依據(jù)，同時(shí)為發(fā)酵工藝的改進(jìn)提供了量化指標(biāo)，間接降低了生產(chǎn)成本，保證了收率的穩(wěn)定，具有可直接測(cè)量，特異性強(qiáng)，線性和檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確度均較好， 可為發(fā)酵階段工藝改進(jìn)提高重要的量化手段等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。實(shí)施例1
檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟
(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內(nèi)，樣品液的濃度為10pg/ml；
(2)收集經(jīng)b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為0.5ng/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度檢測(cè)，待純度為90%以上時(shí)，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體，洗滌除去雜質(zhì)；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標(biāo)微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體、雜質(zhì)；
(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標(biāo)記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，HRP的濃度為0. 5ng/ ml，洗滌除去未結(jié)合的抗原、雜質(zhì)；
(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物徹底洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體、雜質(zhì)，加入TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關(guān)；
(6)用酶標(biāo)儀在400nm波長下測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。實(shí)施例2
檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟
(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內(nèi)，樣品液的濃度為100pg/ml；
(2)收集經(jīng)b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為1.5ng/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度檢測(cè)，待純度為90%以上時(shí)，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體，洗滌除去雜質(zhì)；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標(biāo)微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體、雜質(zhì)；
(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標(biāo)記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，HRP的濃度為1. 5ng/ml，洗滌除去未結(jié)合的抗原、雜質(zhì)；
(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物徹底洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體、雜質(zhì)，加入TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關(guān)；
(6)用酶標(biāo)儀在500nm波長下測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。 實(shí)施例3
檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟
(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內(nèi)，樣品液的濃度為50pg/ml；
(2)收集經(jīng)b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為l.Ong/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度檢測(cè)，待純度為90%以上時(shí)，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體，洗滌除去雜質(zhì)；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標(biāo)微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體、雜質(zhì)；
(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標(biāo)記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，HRP的濃度為Ing/ ml，洗滌除去未結(jié)合的抗原、雜質(zhì)；
(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物徹底洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體、雜質(zhì)，加入TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關(guān)；
(6)用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內(nèi)，樣品液的濃度為10 IOOpg/ml ；(2)收集經(jīng)b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為0.5 1.5ng/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度檢測(cè)，待純度為90%以上時(shí)，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體；(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標(biāo)微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體；(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標(biāo)記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，HRP的濃度為0. 5 1. 5ng/ml ；(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物徹底洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體、雜質(zhì)，加入TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關(guān)；(6)用酶標(biāo)儀在400 500nm波長下測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品；(2)收集經(jīng)b型流感嗜血桿菌免疫的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，待純度為90%以上時(shí)即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體；(3)用(2)中所得抗體包被酶標(biāo)微孔板，制成固相抗體；(4)往微孔板中加入樣品，并與用HRP標(biāo)記的固相抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物；(5)徹底洗滌固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)；(6)用酶標(biāo)儀在400～500nm波長下測(cè)吸光度，計(jì)算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖濃度。本發(fā)明提供一種檢測(cè)發(fā)酵液多糖濃度的方法，具有直接測(cè)量，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102507924SQ201110365639
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者曾令學(xué), 朱琳, 朱聰, 李洪光, 楊襄誠, 羅芹, 趙丹, 趙濤, 陳克平, 韓煉 申請(qǐng)人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司