專利名稱：一種水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到對于環(huán)境中腐蝕微生物的檢測，具體的說是一種水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法。
背景技術：
硫酸鹽還原菌是一種具有嚴重腐蝕性危害的厭氧型微生物，它能夠通過新陳代謝將硫酸根離子或亞硫酸根離子轉化為硫離子并獲得能量。傳統(tǒng)的硫酸鹽還原菌檢測是通過最大可能數(shù)法。該種方法需要經(jīng)歷產(chǎn)物的富集階段故所需要的培養(yǎng)周期較長。其它檢測方法都存在不同程度的缺陷，比如，通過抗體-抗原結合的免疫反應進行的檢測容易受到檢測條件的約束，并且生物試劑容易失活，同時非特異性結合嚴重。這些不足限制了檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。通過生物技術進行檢測具有很高的選擇性，然而其測試過程十分復雜，需要由專業(yè)人員操作，且成本很高。本發(fā)明通過將硫酸鹽還原菌代謝產(chǎn)生的硫離子分離，并進一步反應生成硫化鋅沉淀，并通過這種硫化物沉淀的光催化性質進行檢測的方法具有所需的培養(yǎng)周期短，操作比較簡單，成本低，準確度高等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法，將待測樣品離心后，沉淀于選擇性培養(yǎng)基中厭氧條件下培養(yǎng)3-4天，離心取上清液，并加入上清液1/9體積的硝酸鋅溶液混合均勻后離心取沉淀，沉淀中加入亞甲基藍溶液混合均勻后在紫外燈下照射1. 5-2. 0小時，即可通過吸光度待測樣品中檢測硫酸鹽還原菌。所述待測樣品以8000-10000轉/分鐘速度，離心8_10分鐘，收集沉淀于選擇性培養(yǎng)基中在30-35°C中厭氧條件下培養(yǎng)3-4天。所述選擇性培養(yǎng)基為，1升陳海水中加 Λ 0. 4-0. 6 克 NaSO4,0. 4-0. 6 克 K2HPO3,1. 0-1. 5 克 NH4CIjO. 1-0. 2 克 CaCl2,1. 5-2. 0 克 MgSO4,1. 0-1. 5克酵母浸出膏，3-5毫升乳酸鈉。厭氧條件下培養(yǎng)后培養(yǎng)液以12000-14000 轉/分鐘，離心15-20分鐘，取上清液并加入上清液1/9體積的硝酸鋅溶液混合均勻后以 12000-14000轉/分鐘，離心15-20分鐘取硫化鋅沉淀。所述硝酸鋅的濃度為2_3mM。將染色劑亞甲基藍溶液加入到硫化鋅沉淀中，在紫外燈下照射1. 5-2. 0小時產(chǎn)生顏色變化，即在665nm波長下進行吸光度檢測。所述亞甲基藍濃度為10_15mg/L。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明使用的檢測方法是通過硫酸還原菌產(chǎn)生的特征代謝產(chǎn)物進行硫酸鹽還原菌的檢測，使用該方法具有很高的選擇性，且克服了使用生物試劑如抗體，生物素等易失活的問題，所需設備簡單。相對于目前仍廣泛使用的最大可能數(shù)法具有檢測周期短，成本低的優(yōu)點。


圖1.為本發(fā)明實施例提供的檢測流程圖。圖2為本發(fā)明實施例提供的合成的aiS的投射電鏡圖。圖3為本發(fā)明實施例提供的檢測方法的特異性結果圖。圖4.為本發(fā)明實施例提供的檢測方法在紫外燈照射(a)和無紫外燈照射(b)下的檢測信號圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1取含有硫酸鹽還原菌的待測水溶液離心分離(離心速度為8000-10000轉/分鐘，離心時間8-10分鐘)，將上層液吸出倒掉，取下層沉淀置于硫酸鹽還原菌的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度穩(wěn)定在30-35°C。培養(yǎng)3-4天后取出，取細菌液離心分離(離心速度為 12000-14000轉/分鐘，離心時間10-15分鐘)，取上清液。向上清液中加入硝酸鋅溶液，其中上清液與硝酸鋅的體積比為9 1，硝酸鋅的濃度為2-3mM，反應20-30分鐘后，再次離心分離(離心速度為12000-14000轉/分鐘，離心時間10-15分鐘)，棄掉上清液，保留沉淀物質。用超純水洗滌沉淀物質，并再次離心(離心速度為12000-14000轉/分鐘，離心時間 10-15分鐘)，吸出上清液。洗滌兩至三次后，將得到純凈硫化鋅沉淀。將上述得到的硫化鋅沉淀分散在染色劑亞甲基藍溶液中，置于紫外燈下照射(每次測量應保證樣品距離紫外燈的距離相同)1. 5-2. 0小時，將溶液搖勻后使用分光光度計測量樣品在665nm處的吸光度(檢測流程參見圖1)。根據(jù)光照前后亞甲基藍前后吸光度的變化，根據(jù)下方公式即可計算出脫色率，其中Atl與A分別代表亞甲基藍光照前后的吸光度。脫色率(DC)= (1-A/A0) X100%實施例2根據(jù)實施例1中的方法，檢測相同濃度的三種細菌(硫酸鹽還原菌，金黃色葡萄球菌，溶藻弧菌)在相同的培養(yǎng)時間和相同的紫外光照時間條件下的信號響應(參見圖3)。 通過測量紫外光照射前后樣品在665nm處的吸光度，計算出相同濃度不同種類的細菌的脫色率。結果表明在扣除背景后，通過該方法檢測硫酸鹽還原菌的信號遠遠超出其它兩種細菌，表明該檢測方法具有很好的選擇性。相比生物元件進行選擇性檢測，通過該種方法無需考慮生物分子的活性問題，非特異性識別問題。實施例3根據(jù)實施例1中的方法，檢測一系列不同濃度硫酸鹽還原菌(從IO1到IO8CfVmL) 產(chǎn)生的信號變化，并在無紫外燈照射下做了對照。通過測量紫外光照前后樣品在665nm處的吸光度，計算出不同濃度的硫酸鹽還原菌在有無紫外照射下的脫色率(參見圖4)。結果表明在IO3到IO8CfuAiL的濃度區(qū)間內(nèi)脫色率隨硫酸鹽還原菌濃度的升高而增大，并呈現(xiàn)良好的線性相關性。在無光照實驗條件下脫色率則沒有顯著變化。本發(fā)明提供了一種基于硫酸鹽還原菌代謝產(chǎn)物實現(xiàn)選擇性檢測的方法，使用該方法能有效的檢測水環(huán)境中的硫酸鹽還原菌數(shù)量和變化。相對于目前仍采用的檢測方法，該方法該培養(yǎng)的天數(shù)縮短到3-4天，很大程度的縮短了檢測所需時間。并且本發(fā)明提供的方法操作簡單，易操作，無需復雜的檢測儀器，具有很好的實用化前景。
權利要求
1.一種水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法，其特征在于將待測樣品離心后，沉淀于選擇性培養(yǎng)基中厭氧條件下培養(yǎng)3-4天，離心取上清液，并加入上清液1/9體積的硝酸鋅溶液混合均勻后離心取沉淀，沉淀中加入亞甲基藍溶液混合均勻后在紫外燈下照射1. 5-2. 0 小時，即可通過吸光度待測樣品中檢測硫酸鹽還原菌。
2.按權利要求1所述的水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法，其特征在于所述待測樣品以8000-10000轉/分鐘速度，離心8-10分鐘，收集沉淀于選擇性培養(yǎng)基中在30_35°C中厭氧條件下培養(yǎng)3-4天。
3.按權利要求1或2所述的水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法，其特征在于所述選擇性培養(yǎng)基為，1升陳海水中加入0. 4-0. 6克NaSO4,0. 4-0. 6克K2HPO3,1. 0-1. 5克NH4Cl, 0. 1-0. 2克CaCl2,1. 5-2. 0克MgSO4,1. 0-1. 5克酵母浸出膏，3_5毫升乳酸鈉。
4.按權利要求1所述的水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法，其特征在于厭氧條件下培養(yǎng)后培養(yǎng)液以12000-14000轉/分鐘，離心15-20分鐘，取上清液并加入上清液1/9體積的硝酸鋅溶液混合均勻后以12000-14000轉/分鐘，離心15-20分鐘取硫化鋅沉淀。
5.按權利要求1或4所述的水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法，其特征在于所述硝酸鋅的濃度為2-3mM。
6.按權利要求4所述的水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法，其特征在于將亞甲基藍溶液加入到硫化鋅沉淀中，在紫外燈下照射1. 5-2. 0小時產(chǎn)生顏色變化，即在665nm波長下進行吸光度檢測。
7.按權利要求6所述的水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法，其特征在于所述亞甲基藍濃度為10-15mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及到對于環(huán)境中腐蝕微生物的檢測，具體的說是一種水環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測方法。將待測樣品離心后，沉淀于選擇性培養(yǎng)基中厭氧條件下培養(yǎng)3-4天，離心取上清液，并加入上清液1/9體積的硝酸鋅溶液混合均勻后離心取沉淀，再沉淀中加入亞甲基藍溶液混合均勻后在紫外燈下照射1.5-2.0小時，即可通過吸光度待測樣品中檢測硫酸鹽還原菌。本發(fā)明將硫酸鹽還原菌的特征代謝產(chǎn)物與檢測手段結合起來具有很高的選擇性，同時克服了傳統(tǒng)方法培養(yǎng)周期長的缺點，大量縮短了檢測所需時間。本發(fā)明使用光學方法檢測，所需設備簡單，操作難度小，材料低廉，同時具有很高的準確性。
文檔編號G01N21/31GK102507481SQ20111041625
公開日2012年6月20日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權日2011年12月13日
發(fā)明者萬逸, 張盾, 戚鵬 申請人:中國科學院海洋研究所