一種檢測(cè)海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋環(huán)境和海洋腐蝕領(lǐng)域，具體的說是一種檢測(cè)海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]硫酸鹽還原菌是一大類具有嚴(yán)重腐蝕性危害的微生物，它們能夠通過新陳代謝將硫酸根離子或亞硫酸根離子還原為硫離子并獲得能量。目前仍在廣泛使用的硫酸鹽還原菌檢測(cè)是通過最大可能數(shù)法。雖然這種方法具有很好的檢測(cè)性能，然而該種方法需要的培養(yǎng)周期較長，至少需要15天的時(shí)間。其它檢測(cè)方法也存在著不同類型的缺陷，比如，通過抗體-抗原免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)受到檢測(cè)條件的約束，且生物試劑易失活，非特異性結(jié)合較為嚴(yán)重。通過生物分子技術(shù)進(jìn)行硫酸鹽還原菌檢測(cè)具有很高的選擇性，然而其測(cè)試過程十分的復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作，且成本很高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的快速檢測(cè)方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種檢測(cè)海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的方法，將氧化態(tài)谷胱甘肽加入至經(jīng)培養(yǎng)的待檢測(cè)樣品中，再加入進(jìn)行激活使待測(cè)樣品中硫酸鹽得以激化使其還原菌的腐蝕性代謝產(chǎn)物硫化物與巰基蛋白酶作用，進(jìn)而通過測(cè)量巰基蛋白酶的活性檢測(cè)樣品中硫酸鹽還原菌的濃度。
[0006]進(jìn)一步的說，將待測(cè)樣品于選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天，經(jīng)過離心分離收集上清液，上清液中加入上清液體積1/9-1/10的氧化態(tài)谷胱甘肽，經(jīng)過15-30分鐘的反應(yīng)時(shí)間，再加入體積為加入氧化態(tài)谷胱甘肽的上清液1-1.2倍的巰基蛋白酶，混合均勻后于37°C下孵育30-40分鐘，測(cè)量是通過測(cè)量巰基蛋白酶催化水解酪蛋白的能力，測(cè)定水解產(chǎn)物在275nm波長下的吸光度，進(jìn)而檢測(cè)原試樣中硫酸鹽還原菌的濃度。
[0007]所述巰基蛋白酶為木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶或無花果蛋白酶。
[0008]所述選擇性培養(yǎng)基為，I升陳海水中加入0.4-0.6克NaSO4,0.4-0.6克K2HPO3,1.0-1.5 克 NH4Cl, 0.1-0.2 克 CaCl2,1.5-2.0 克 MgSO4,1.0-1.5 克酵母提取物，3-5 毫升乳酸鈉。
[0009]所述氧化態(tài)谷胱甘肽的濃度為20mM。
[0010]將孵育后的上清液中加入酪蛋白溶液，反應(yīng)10-15分鐘后加入三氯乙酸終止反應(yīng)，而后在275nm波長下的吸光度，進(jìn)而檢測(cè)原試樣中硫酸鹽還原菌的濃度。
[0011]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0012]本發(fā)明檢測(cè)方法是通過將硫酸鹽還原菌代謝產(chǎn)生特征硫化物分離，經(jīng)過氧化態(tài)谷胱甘肽激活后，會(huì)攻擊巰基蛋白酶的活性催化中心，進(jìn)而抑制其活性。進(jìn)一步是通過硫酸還原菌產(chǎn)生的特征代謝產(chǎn)物硫化物對(duì)巰基蛋白酶的抑制作用進(jìn)行硫酸鹽還原菌的檢測(cè)，使用該方法具有很高的選擇性，準(zhǔn)確度高，且避免了生物識(shí)別元件的使用，所需設(shè)備較為簡單。同時(shí)相較于目前仍廣泛使用的MPN法，該方法具有檢測(cè)周期短，成本低的優(yōu)點(diǎn)。
[0013]本發(fā)明基于硫酸鹽還原菌代謝產(chǎn)物對(duì)巰基蛋白酶活性抑制作用對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的方法，使用該方法能有效的檢測(cè)水環(huán)境中的硫酸鹽還原菌數(shù)量和變化。相對(duì)于目前仍采用的檢測(cè)方法，該方法該培養(yǎng)的天數(shù)縮短到2-4天，很大程度的縮短了檢測(cè)所需時(shí)間。并且本發(fā)明提供的方法操作簡單，易操作，無需復(fù)雜的檢測(cè)儀器，具有很好的實(shí)用化前景。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的硫酸鹽還原菌代謝產(chǎn)生的硫化物在經(jīng)過氧化態(tài)谷胱甘肽激活前后對(duì)巰基蛋白酶的抑制作用比較圖。
[0015]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)方法的特異性結(jié)果圖。
[0016]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)方法的線性檢測(cè)范圍圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0018]實(shí)施例1
[0019]將硫酸鹽還原菌的待測(cè)液離心分離，其離心速度為6000-80000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間15-20分鐘,取下層液置于選擇性培養(yǎng)基(Postgete培養(yǎng)基)中連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度穩(wěn)定在30-35°C。培養(yǎng)2-4天后取出，取2毫升細(xì)菌液離心分離，其，離心速度為12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間15-20分鐘，取上清液。向上清液中加入氧化態(tài)谷胱甘肽溶液，其中上清液與氧化態(tài)谷胱甘肽的體積比為9:1，氧化態(tài)谷胱甘肽的濃度為20mM，在37°C反應(yīng)15-30分鐘后，再加入體積為加入氧化態(tài)谷胱甘肽的上清液1-1.2倍的l-5mg mL-1木瓜蛋白酶溶液，混勻后于37°C下孵育30-40分鐘。之后在溶液(即再加入木瓜蛋白酶的上清液)中加入溶液體積2倍的1%酪蛋白溶液，反應(yīng)10-15分鐘后加入三氯乙酸終止反應(yīng)，離心后取上清液置于275nm處進(jìn)行吸光度測(cè)量。
[0020]根據(jù)下方公式計(jì)算得到巰基蛋白酶活性抑制率，其中Atl代表的是未經(jīng)過硫酸鹽還原菌代謝產(chǎn)物處理的巰基蛋白酶的水解產(chǎn)物的吸光度，而A代表的是經(jīng)過硫酸鹽還原菌代謝產(chǎn)物處理后的巰基蛋白酶的水解產(chǎn)物的吸光度。
[0021 ]抑制率(IR%) = (1-A/A。)X 100%
[0022]實(shí)施例2
[0023]根據(jù)實(shí)施例1中的方法，相同濃度的四種細(xì)菌(硫酸鹽還原菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和溶藻弧菌)經(jīng)過在Postgete培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，按實(shí)施例1進(jìn)行處理，通過測(cè)量經(jīng)過各種細(xì)菌代謝產(chǎn)物處理過的巰基蛋白酶的水解產(chǎn)物在275nm處的吸光度，計(jì)算出相同濃度不同種類的細(xì)菌的對(duì)巰基蛋白酶活性的抑制率(參見圖2)。結(jié)果表明在扣除背景后，通過本發(fā)明提供的方法檢測(cè)硫酸鹽還原菌的信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其它三種細(xì)菌，表明該檢測(cè)方法具有很好的選擇性。
[0024]實(shí)施例3
[0025]根據(jù)實(shí)施例1中的方法，檢測(cè)一系列不同濃度硫酸鹽還原菌(從11到108CfU/mL)經(jīng)過2-4天的培養(yǎng)后，對(duì)巰基蛋白酶的活性抑制作用(參見圖3)。結(jié)果表明當(dāng)硫酸鹽還原菌在經(jīng)過2天培養(yǎng)后，在14到108cfu/mL的濃度區(qū)間內(nèi)對(duì)巰基蛋白酶的抑制作用隨硫酸鹽還原菌濃度的升高而增大，并呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長到3天后，在13到107cfu/mL的濃度區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性。硫酸鹽還原菌在經(jīng)過4天的培養(yǎng)后，其檢測(cè)范圍可以降低到102cfu/mL并保持良好的線性相關(guān)性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于: 將氧化態(tài)谷胱甘肽加入至經(jīng)培養(yǎng)的待檢測(cè)樣品中，再加入進(jìn)行激活使待測(cè)樣品中硫酸鹽得以激化使其還原菌的腐蝕性代謝產(chǎn)物硫化物與巰基蛋白酶作用，進(jìn)而通過測(cè)量巰基蛋白酶的活性檢測(cè)樣品中硫酸鹽還原菌的濃度。
2.按權(quán)利要求1所述的檢測(cè)海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于: 將待測(cè)樣品于選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天，經(jīng)過離心分離收集上清液，上清液中加入上清液體積1/9-1/10的氧化態(tài)谷胱甘肽，經(jīng)過15-30分鐘的反應(yīng)時(shí)間，再加入體積為加入氧化態(tài)谷胱甘肽的上清液1-1.2倍的巰基蛋白酶，混合均勻后于37°C下孵育30-40分鐘，測(cè)量是通過測(cè)量巰基蛋白酶催化水解酪蛋白的能力，測(cè)定水解產(chǎn)物在275nm波長下的吸光度，進(jìn)而檢測(cè)原試樣中硫酸鹽還原菌的濃度。
3.按權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于: 所述巰基蛋白酶為木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶或無花果蛋白酶。
4.按權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于: 所述選擇性培養(yǎng)基為，I升陳海水中加入0.4-0.6克NaSO4,0.4-0.6克K2HPO3,1.0-1.5克 NH4Cl, 0.1-0.2 克 CaCl2,1.5-2.0 克 MgSO4,1.0-1.5 克酵母提取物，3-5 毫升乳酸鈉。
5.按權(quán)利要求1或2所述的海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測(cè)方法，其特征在于:所述氧化態(tài)谷胱甘肽的濃度為20mM。
6.按權(quán)利要求2所述的海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的檢測(cè)方法，其特征在于:將孵育后的上清液中加入酪蛋白溶液，反應(yīng)10-15分鐘后加入三氯乙酸終止反應(yīng),而后在275nm波長下的吸光度，進(jìn)而檢測(cè)原試樣中硫酸鹽還原菌的濃度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及海洋環(huán)境和海洋腐蝕領(lǐng)域，具體的說是一種檢測(cè)海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的方法。將氧化態(tài)谷胱甘肽加入至經(jīng)培養(yǎng)的待檢測(cè)樣品中，再加入進(jìn)行激活使待測(cè)樣品中硫酸鹽得以激化使其還原菌的腐蝕性代謝產(chǎn)物硫化物與巰基蛋白酶作用，進(jìn)而通過測(cè)量巰基蛋白酶的活性檢測(cè)樣品中硫酸鹽還原菌的濃度。本發(fā)明通過利用其代謝產(chǎn)物檢測(cè)硫酸鹽還原菌，具有很好的普遍性和選擇性，可以避免生物識(shí)別材料的使用，同時(shí)相比于目前仍在廣泛使用的MPN法，檢測(cè)所需的時(shí)間大大縮短。另外本發(fā)明所需設(shè)備簡單，操作難度小，材料低廉，同時(shí)具有很高的準(zhǔn)確性。
【IPC分類】G01N21-33
【公開號(hào)】CN104730018
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310721689
【發(fā)明人】戚鵬, 張盾
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院海洋研究所
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2013年12月24日