專利名稱：基于多重放大系統(tǒng)的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種快速檢測(cè)谷物類、谷物類相關(guān)產(chǎn)品、飼料中玉米赤霉烯酮的方法。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone, ZEN)是鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。玉米赤霉烯酮毒素可存在于玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥等谷物， 也可存在于食用含ZEN飼料的動(dòng)物組織中，包括牛奶、雞蛋等。玉米赤霉烯酮毒素與自發(fā)性乳腺癌，輸卵管和子宮水腫、增生，精細(xì)胞畸變、凋亡等疾病有關(guān)。玉米赤霉烯酮毒素具有分布廣泛、殘留時(shí)間長(zhǎng)、難處理、和其他毒素一起有增強(qiáng)毒性的現(xiàn)象。加入WTO之后，農(nóng)產(chǎn)品及相關(guān)食品的國(guó)際貿(mào)易量日益增加，隨之對(duì)進(jìn)出口產(chǎn)品的生物安全性的要求也越來(lái)越高，為了保證這類產(chǎn)品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關(guān)、生產(chǎn)企業(yè)、監(jiān)督部門等部門迫切需要一種快速簡(jiǎn)便的玉米赤霉烯酮毒素檢測(cè)方法。化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence, CL)早在19世紀(jì)80年代就得到證實(shí)，即在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中瞬間以釋放光子的形式放出能量。后發(fā)展出放射免疫分析技(Radioimmunoassay, RIA)，因其高靈敏度和高特異性而受到普遍應(yīng)用。CLIA是在RIA基本理論的基礎(chǔ)上，以標(biāo)記發(fā)光劑為示蹤物信號(hào)建立起來(lái)的一種非放射標(biāo)記免疫分析法。近年來(lái)發(fā)展迅猛，是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法，也是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，顯著優(yōu)于放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析(ChemiluminescentEnzyme Immunoassay, CLEIA)屬酶免疫分析，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免疫分析完全相同以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體)進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。在酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析中可供標(biāo)記的酶有很多，目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。免疫磁酶技術(shù)是將IgG標(biāo)記在標(biāo)記有Protein A的磁珠上，進(jìn)行酶聯(lián)免疫方法的技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)是利用磁珠的富集作用，檢測(cè)較大體積溶液中的微量抗原。鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)在方法中使用，是由于鏈霉親和素可以和4個(gè)生物素穩(wěn)固結(jié)合，因此在信號(hào)放大方面被廣泛使用。關(guān)于玉米赤霉烯酮毒素檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外已建立了多種方法。目前檢測(cè)ZEN的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)，液譜和質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS) 和ELISA方法。然而，這些方法需要對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行嚴(yán)格的預(yù)處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時(shí)要求有專業(yè)的操作人員，不利于現(xiàn)場(chǎng)常規(guī)檢測(cè)使用。已有的檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的ELISA試劑盒，在檢測(cè)靈敏度上不及本發(fā)明的超靈敏化學(xué)發(fā)光ELISA方法，因此本方法對(duì)保障谷物類食品的安全具有更重要的作用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于多重放大系統(tǒng)的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，本發(fā)明檢測(cè)對(duì)象針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高，靈敏度較市售ELISA檢測(cè)試劑盒高。并且由于本發(fā)明采用抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，較市售的以多克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA試劑盒有更強(qiáng)的特異性，減少了假陽(yáng)性率。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種基于多重放大系統(tǒng)的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，該方法包括以下步驟步驟一，將ZEN半抗原與OVA偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物ZEN-0VA，再與biotin偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物 OVA-ZEN-biotin ；步驟二，將抗ZEN單克隆抗體與免疫磁珠結(jié)合，得到抗體-磁珠結(jié)合物；步驟三，將所述抗體-磁珠結(jié)合物加入EP管中，用洗滌液洗滌，對(duì)待側(cè)樣品進(jìn)行萃取，將待側(cè)樣品的萃取液稀釋后加入上述管中，震蕩；步驟四，去除上清液，用洗滌液洗滌，再加入所述OVA-ZEN-biotin，震蕩；步驟五，去除上清液，用洗滌液洗滌，再加入SA-HRP，震蕩；步驟六，去除上清液，用洗滌液洗滌，加入發(fā)光底物，震蕩，測(cè)定發(fā)光值；步驟七，根據(jù)已知不同濃度ZEN與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體加入后得到的發(fā)光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的發(fā)光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中的ZEN濃度。優(yōu)選地，在所述步驟一中，所述ZEN半抗原與所述OVA的偶聯(lián)通過(guò)活潑酯法完成。優(yōu)選地，在所述步驟一中，所述偶聯(lián)物ZEN-OVA與所述biotin的偶聯(lián)通過(guò)活潑酯法完成。優(yōu)選地，在所述步驟三中，所述洗滌液為pH為7. 4的0. OlM磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，在所述步驟三中，所述萃取液的稀釋倍數(shù)為5倍。優(yōu)選地，在所述步驟三中，所述萃取的方法為取樣品，按照重量體積比I : 10的比例加入70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩15min，靜置30min，將上清液通過(guò)快速定性濾紙過(guò)濾，即得萃取液。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述稀釋液為pH 8. 2的0. IM磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液含有體積比為 0. 01% ^ Tween-20 O優(yōu)選地，在所述步驟三中，所述震蕩步驟為室溫震蕩30分鐘。優(yōu)選地，在所述步驟六中，所述震蕩步驟為室溫震蕩I分鐘。優(yōu)選地，在所述步驟七中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的做法為以加入ZEN濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以加入不同濃度ZEN所得到的不同發(fā)光值除以不加入ZEN所得到的發(fā)光值為縱坐標(biāo)， 通過(guò)Microsoft Excel軟件,做出散點(diǎn)圖并添加趨勢(shì)線公式和R2 ；本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明是鑒于待測(cè)樣品若有ZEN毒素，由于ZEN和免疫磁珠上的抗ZEN單克隆抗體特異性結(jié)合，而卵清蛋白(OVA)與ZEN和生物素(biotin)的偶聯(lián)物OVA-ZEN-biotin加入反應(yīng)體系中后，可以和未被ZEN結(jié)合的單克隆抗體結(jié)合。而且在加入鏈霉親和素(SA)偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)后，HRP再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。由于待測(cè)樣品中含有的ZEN的量與發(fā)光檢測(cè)結(jié)果有線性關(guān)系，因此可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品中含有的ZEN的量。本發(fā)明檢測(cè)對(duì)象針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高，靈敏度較市售ELISA檢測(cè)試劑盒高。并且由于本發(fā)明采用抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，較市售的以多克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA試劑盒有更強(qiáng)的特異性，減少了假陽(yáng)性率。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例原理的示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例檢測(cè)的示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下面實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例步驟一，玉米赤霉烯酮包被抗原(OVA-ZEN)的制備取O. 33ml (3mg/ml) ZEN,混合于I. 2ml卩比唳中，加入2mg O-羧甲基輕胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h。真空干燥后，加入4ml蒸餾水，并使其溶解，調(diào)整pH至8. O。未反應(yīng)的ZEN用苯抽提除去(3ml苯，共抽提3次)，除去苯相，保留水相。水相調(diào)pH至3.0，用乙酸乙酯抽提 (IOml乙酸乙酯，共抽提4次)，抽出酯相，棄水相。酯相用無(wú)水硫酸鈉濾過(guò)后吹干。吹干后的結(jié)晶物溶于O. 5ml堿性氧化鋁處理過(guò)的二氧六環(huán)中。稱取IOmg OVA溶于O. 7ml O. 05mol/ L(pH7. 2)的PBS中，將兩溶液于4°C緩慢混合。Img N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)和2mg N、 N’-二環(huán)己碳二亞胺(DCC)溶于O. 2ml 二氧六環(huán)中，并緩慢滴加此溶液。將混合后的溶液放置室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16h。調(diào)pH至6. 0，通風(fēng)櫥中吹干，緩慢滴加DCC溶液(2mg DCC溶于O. 2ml 二氧六環(huán)中)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48h。最后用PBS透析2 3d, _20°C保存。步驟二，OVA-ZEN-biotin的制備O. Img NHS-biotin 加入至含有 lmg/ml 0VA-ZEN 的 O. 01mol/L碳酸氫鈉緩沖液中， 攪拌混勻后，緩慢加入0. 2mg DCC溶液(溶于0. 2ml 二氧六環(huán)中)，將混合后的溶液放置室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48h。最后用PBS透析2 3d，-20°C保存。步驟三，抗ZEN單克隆抗體與免疫磁珠結(jié)合取免疫磁珠50μ 1，使用洗滌液(0. OlM磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4)洗滌3次后， 加入含5yg抗ZEN單克隆抗體的結(jié)合緩沖液(0. IM磷酸緩沖液，pH 8. 2，含0. 01 % Tween-20) 200 μ I,室溫震蕩反應(yīng)30分鐘。再使用洗滌液洗滌3次，最后加入結(jié)合緩沖液，_4°C保存。步驟四，化學(xué)發(fā)光ELISA檢測(cè)待測(cè)樣品萃取液(I)將抗體-磁珠結(jié)合物稀釋至一定濃度后取50 μ I加入EP管中，使用洗滌液洗滌3次。取0. 3g樣品，加入3ml 70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩15min，靜置30min。上清液通過(guò)快速定性濾紙過(guò)濾，使用結(jié)合緩沖液(0. IM磷酸緩沖液，pH 8. 2，含0. 01% Tween-20) 稀釋5倍后，取Iml加入含有抗體-磁珠的管中，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘，其中在標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中依次加入1、0. 5,0. 1,0. 05,0. 01,0. 00U0ng/ml的ZEN純品1ml，并做3次重復(fù)；在待測(cè)孔中加制備的待測(cè)樣品萃取液lml，并做3次重復(fù)，空白孔中不加入抗體-磁珠結(jié)合物，如圖 2所示。
(2)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌3次后，將OVA-ZEN-biotin使用結(jié)合緩沖液稀釋至一定濃度后，取200 μ I加入EP管中，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘。(3)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌3次后，將SA-HRP使用結(jié)合緩沖液稀釋至一定濃度后，取200 μ I加入EP管中，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘。(4)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌后加入發(fā)光底物(魯米諾+對(duì)碘酚)200 μ 1，室溫震蕩反應(yīng)I分鐘后吸出，加入96孔板中，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定，得到結(jié)果。如圖I所示,磁珠I與Protein A 2結(jié)合,抗ZEN單克隆抗體3分別與Protein A 2 和 SA-HRP 5 結(jié)合，OVA-ZEN-biotin 4 與 SA-HRP 5 結(jié)合。步驟五，檢測(cè)ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與結(jié)果判定(I)根據(jù)已知不同濃度ZEN與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體加入后，得到的發(fā)光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體做法為以加入ZEN濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以加入不同濃度ZEN 所得到的不同發(fā)光值的平均數(shù)，除以不加入ZEN(空白)所得到的發(fā)光值為縱坐標(biāo)，通過(guò) Microsoft Excel軟件,繪制散點(diǎn)圖并添加趨勢(shì)線公式和R2。(2)根據(jù)待測(cè)樣品的發(fā)光值的平均值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得到的趨勢(shì)線公式計(jì)算，得到對(duì)應(yīng)的ZEN濃度。
權(quán)利要求
1.一種基于多重放大系統(tǒng)的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，將ZEN半抗原與OVA偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物ZEN-0VA，再與biotin偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物OVA-ZEN-biotin ；步驟二，將抗ZEN單克隆抗體與免疫磁珠結(jié)合，得到抗體-磁珠結(jié)合物；步驟三，將所述抗體-磁珠結(jié)合物加入EP管中，用洗滌液洗滌，對(duì)待側(cè)樣品進(jìn)行萃取， 將待側(cè)樣品的萃取液稀釋后加入上述管中，震蕩；步驟四，去除上清液，用洗滌液洗滌，再加入所述OVA-ZEN-biotin，震蕩；步驟五，去除上清液，用洗滌液洗滌，再加入SA-HRP，震蕩；步驟六，去除上清液，用洗滌液洗滌，加入發(fā)光底物，震蕩，測(cè)定發(fā)光值；步驟七，根據(jù)已知不同濃度ZEN與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體加入后得到的發(fā)光值， 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的發(fā)光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中的ZEN濃度。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟一中，所述 ZEN半抗原與所述OVA的偶聯(lián)通過(guò)活潑酯法完成。
3.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟一中，所述偶聯(lián)物ZEN-OVA與所述biotin的偶聯(lián)通過(guò)活潑酯法完成。
4.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述洗滌液為pH為7. 4的0. OlM磷酸鹽緩沖液。
5.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述萃取液的稀釋倍數(shù)為5倍。
6.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述萃取的方法為取樣品，按照重量體積比I : 10的比例加入70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩 15min，靜置30min，將上清液通過(guò)快速定性濾紙過(guò)濾，即得萃取液。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，所述稀釋液為pH8.2 的0. IM磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液含有體積比為0. 01%的Tween-20。
8.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述震蕩步驟為室溫震蕩30分鐘。
9.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟六中，所述震蕩步驟為室溫震蕩I分鐘。
10.如權(quán)利要求I至9任一項(xiàng)所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，在所述步驟七中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的做法為以加入ZEN濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以加入不同濃度ZEN 所得到的不同發(fā)光值除以不加入ZEN所得到的發(fā)光值為縱坐標(biāo)，通過(guò)MicrosoftExcel軟件，做出散點(diǎn)圖并添加趨勢(shì)線公式和R2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于多重放大系統(tǒng)的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，包括以下步驟將ZEN半抗原與OVA偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物ZEN-OVA，再與biotin偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物OVA-ZEN-biotin；將抗ZEN單克隆抗體與免疫磁珠結(jié)合；將抗體-磁珠結(jié)合物加入EP管中，洗滌，將待側(cè)樣品的萃取液加入上述EP管中，震蕩，去除上清液，洗滌，再加入OVA-ZEN-biotin，震蕩，去除上清液，洗滌，再加入SA-HRP，震蕩，去除上清液，洗滌，最后加入發(fā)光底物，震蕩，測(cè)定發(fā)光值；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的發(fā)光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到對(duì)應(yīng)的ZEN濃度。本發(fā)明采用抗ZEN單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，減少了假陽(yáng)性率。
文檔編號(hào)G01N33/64GK102608324SQ20121000234
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者嚴(yán)亞賢, 孫建和, 王元?jiǎng)P 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)