本發(fā)明涉及一種測量液體樣品中細(xì)菌含量的裝置。

背景技術(shù)：

由細(xì)菌等微生物的生命活動(dòng)引起的材料的腐蝕破壞被稱為微生物腐蝕(mic)。mic是一種普遍存在的現(xiàn)象。油氣田、油罐、加油站、油路甚至汽車油箱中都存在著大量的細(xì)菌。每年因腐蝕而造成的經(jīng)濟(jì)損失在一百億美元以上。其中最主要的腐蝕微生物為硫酸鹽還原菌(srb)，造成了美國生產(chǎn)油井77％以上的腐蝕損失。srb能夠在無氧環(huán)境下，以環(huán)境中的有機(jī)物為碳源，利用細(xì)菌生物膜內(nèi)產(chǎn)生的氫，將硫酸鹽還原為硫化氫，從氧化還原反應(yīng)中獲得能量，而金屬也在此過程中被氧化腐蝕。

目前srb的檢測方法主要有三種，分別為：培養(yǎng)檢測技術(shù)、顯微鏡檢測技術(shù)和生化直接檢測技術(shù)。培養(yǎng)檢測技術(shù)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種方法，其原理是將樣品做梯度稀釋，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，最終根據(jù)稀釋倍數(shù)和細(xì)菌的陽性反應(yīng)進(jìn)行定量。該法的主要依據(jù)是美國石油協(xié)會(huì)api推薦的絕跡稀釋法，我國石油行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)sy/t0532-2012《油田注入水細(xì)菌分析方法絕跡稀釋法》中也有詳細(xì)規(guī)定。相關(guān)專利已有報(bào)道(如cn102329851a、cn103983636a、cn1769472a、cn200510010459等)，目前市場上也存在srb專用測試瓶可供購買。培養(yǎng)檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單、成本低廉，結(jié)果準(zhǔn)確性較高。其主要缺點(diǎn)在于耗時(shí)長(2-14天)，培養(yǎng)菌種不完全導(dǎo)致定量結(jié)果偏低。一旦陰性對(duì)照組出現(xiàn)菌類生長，需要重做實(shí)驗(yàn)，很難保證重新采樣結(jié)果與原樣本一致。

顯微鏡檢測技術(shù)結(jié)合了特異性染色方法與熒光計(jì)數(shù)方法，將熒光基團(tuán)選擇性地標(biāo)記到srb的表面，然后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)以定量。但此種方法仍然需要短期培養(yǎng)以提高菌類濃度，培養(yǎng)周期在兩天左右。雖然其操作相對(duì)簡單、定量成本低，但需要染料分子的高特異性，且不能提供細(xì)菌活性的相關(guān)信息。

生化直接檢測技術(shù)包含了多種具體方式【關(guān)淑霞葉海春范瑩瑩油田污水中硫酸鹽還原菌檢測技術(shù)的研究進(jìn)展化學(xué)與生物工程20122917】，可以檢測srb內(nèi)部或表面的某種蛋白(如用酶聯(lián)免疫吸附劑測定elisa方法測定腺苷-5’-磷酸硫酸鹽還原酶aps【如 gb2354072b、cn103983636a、ep272916a1】)，可以檢測srb特異性的核酸分子序列(如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pcr方法【cn105112543a、cn1769472a、cn200510010459】、熒光原位雜交fish方法【王明義梁小兵鄭婭萍趙由之魏中青硫酸鹽還原菌鑒定和檢測方法的研究進(jìn)展微生物學(xué)雜志20052581】)，也可以檢測srb的代謝產(chǎn)物(如電位法或指示劑法測定h2s)【李婉義趙自光硫酸鹽還原菌菌量檢測方法的研究—硫離子選擇電極法化學(xué)傳感器19911164】。這些檢測方法準(zhǔn)確性高、特異性高、檢測周期短(幾小時(shí)左右)，但操作復(fù)雜，一般只能在專門的生化實(shí)驗(yàn)室內(nèi)由受過訓(xùn)練的專業(yè)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。市場上雖然已經(jīng)出現(xiàn)了利用elisa方法快速測量細(xì)菌濃度的試劑盒，但該方法仍需要高速離心等操作，不適用于現(xiàn)場檢測。

綜上所述，目前缺乏一種快速、便捷、準(zhǔn)確的srb的現(xiàn)場測定方法和裝備。本專利描述的是一種基于elisa方法的樣品中細(xì)菌的特異性、簡單化、可攜帶式定量檢測裝置，無需外接電源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中測量速度較慢、不便捷、結(jié)果不準(zhǔn)確的問題，提供一種新的測量液體樣品中細(xì)菌含量的裝置。該裝置具有快速、便捷、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

為解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種測量液體樣品中細(xì)菌含量的裝置，包括箱體、試劑管放置位置、試劑管、觀察孔以及細(xì)菌富集和蛋白質(zhì)分子捕捉設(shè)備，所述細(xì)菌富集和蛋白質(zhì)分子捕捉設(shè)備包括試劑管放置位置、濾膜、吸附層、至少兩個(gè)廢液池、至少兩個(gè)閥門，所述試劑管放置位置位于箱體頂部，底部與濾膜上方空間連通，濾膜下方空間分為兩路，一路與閥門5a入口端相連，另一路與閥門5b入口端相連，閥門5a出口端與吸附層入口側(cè)通過管道相連，吸附層出口側(cè)的管道伸入廢液池4a中，閥門5b出口端的管道伸入廢液池4b中，濾膜上方空間的頂部設(shè)有金屬尖刺，當(dāng)試劑管放置在試劑管放置位置上時(shí)可以刺破試劑管底部的鋁箔；設(shè)置至少a-h八個(gè)試劑管，其中：試劑管a為空管，用以待裝樣品，試劑管b和試劑管c內(nèi)盛裝濾膜沖洗液，試劑管d內(nèi)盛裝細(xì)菌裂解液，試劑管e和試劑管f內(nèi)盛裝吸附層沖洗液，試劑管g內(nèi)盛裝帶有染料分子的特異性抗體溶液，試劑管h內(nèi)盛裝吸附層沖洗液；所述觀察孔位于吸附層正上方，開孔在箱體頂部。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，當(dāng)試劑管放置在試劑管放置位置上時(shí)，在試劑管上部放置活塞，將試劑管中的試劑向下壓入濾膜上方的空間中。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述觀察孔用于觀察吸附層的顏色，并與預(yù)置的參照比色卡相比較，以讀出樣品中細(xì)菌的濃度。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述試劑管頂部由濾膜封裝，使用前撕掉鋁箔。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，通過選擇不同的試劑管，實(shí)現(xiàn)所述設(shè)備的樣品富集、提取、沖洗操作。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，細(xì)菌富集和蛋白質(zhì)分子捕捉設(shè)備集成在所述箱體內(nèi)。

本發(fā)明中，細(xì)菌富集是通過樣品流經(jīng)濾膜實(shí)現(xiàn)的。撕開試劑管上方鋁箔，取空的試劑管a，放入1ml待測樣品，將試劑管a放入指定位置試劑管放置位置1后，樣品管底部鋁箔包裝被下部金屬尖刺破，液體流入濾膜2上方，此時(shí)在上方施加壓力，推動(dòng)液體經(jīng)過濾膜，大于濾膜孔徑的固體物質(zhì)被留在濾膜上，液體流出。此時(shí)閥門5b開啟，閥門5a關(guān)閉，廢液流出至右側(cè)廢液池4b。當(dāng)樣品為油田廢水等水相物質(zhì)時(shí)，采用親水性濾膜，濾膜尺寸應(yīng)在0.5微米以下以確保目標(biāo)微生物能夠保留在濾膜上。當(dāng)樣品為成品油等油相物質(zhì)時(shí)，采用親油性濾膜。當(dāng)樣品全部流經(jīng)濾膜后，拔除樣品管，取出上部活塞，將預(yù)置于前排的試劑管b放入位置1，樣品管底部鋁箔包裝被下部金屬尖刺破，放入活塞，重復(fù)上述加壓流程以沖洗濾膜。繼續(xù)更替為試劑管c進(jìn)行沖洗。當(dāng)沖洗結(jié)束后，加入試劑管d，內(nèi)含細(xì)菌裂解液，等待一定時(shí)間后開始加壓，此時(shí)閥門5b關(guān)閉，閥門5a開啟，細(xì)菌裂解液流經(jīng)吸附層3后進(jìn)入左側(cè)廢液池4a。吸附層3的材質(zhì)可以選擇為特異性吸附蛋白質(zhì)的材料、不同截留分子量的超濾膜、表面功能化了aps抗體的吸附材料等。繼續(xù)更換試劑管e、試劑管f進(jìn)行沖洗，此步驟目的為移除細(xì)菌裂解液中除(目標(biāo))蛋白質(zhì)外的雜質(zhì)。g為帶有染料分子的特異性抗體溶液，染料分子通過抗體與aps特異性結(jié)合，染料分子的數(shù)量與aps成正比。染料分子可以為金納米顆粒、其它顆粒、其它帶有顏色的分子等。最后由試劑管h中的溶液沖洗走多余未與aps結(jié)合的抗體。吸附層3的位置與上方觀察孔i對(duì)應(yīng)，在吸附層3位置邊預(yù)置不同濃度對(duì)應(yīng)的比色卡作為定量參照。

本裝置包含了細(xì)菌富集、蛋白質(zhì)分子捕捉和讀出三個(gè)單元，是一種整合型可攜帶式設(shè)備，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場測量。細(xì)菌富集單元采用樣品流經(jīng)過濾膜的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的分離和富集，所需時(shí)間與培養(yǎng)法相比大大縮短。蛋白質(zhì)分子的捕捉是通過裂解液打破細(xì)胞壁釋放出aps后，將aps富集在吸附層上，然后通過抗體-抗原特異性作用進(jìn)一步富集染料顆粒，染料的濃度與aps的濃度成正比，最終由吸附層的顏色指示srb的濃度，取得了較好的技術(shù)效果。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述裝置的外觀示意圖；

圖2為本發(fā)明所述裝置內(nèi)部各模塊結(jié)構(gòu)示意圖；

圖1、圖2中，1為試劑管放置位置；2為濾膜；3為吸附層；4a、4b為廢液池；5a、5b為閥門；a為試劑管，空管，待裝樣品；b、c為試劑管，盛裝濾膜沖洗液；d為試劑管，盛裝細(xì)菌裂解液；e、f為試劑管，盛裝吸附層沖洗液；g為試劑管，盛裝帶有染料分子的特異性抗體溶液；h為試劑管，盛裝吸附層沖洗液；i為觀察孔。

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不僅限于本實(shí)施例。

具體實(shí)施方式

【實(shí)施例1】

一種測量液體樣品中細(xì)菌含量的裝置，如圖1、圖2所示。包括箱體、試劑管放置位置、試劑管、觀察孔以及細(xì)菌富集和蛋白質(zhì)分子捕捉設(shè)備，所述細(xì)菌富集和蛋白質(zhì)分子捕捉設(shè)備包括試劑管放置位置、濾膜、吸附層、至少兩個(gè)廢液池、至少兩個(gè)閥門，所述試劑管放置位置位于箱體頂部，底部與濾膜上方空間連通，濾膜下方空間分為兩路，一路與閥門5a入口端相連，另一路與閥門5b入口端相連，閥門5a出口端與吸附層入口側(cè)通過管道相連，吸附層出口側(cè)的管道伸入廢液池4a中，閥門5b出口端的管道伸入廢液池4b中，濾膜上方空間的頂部設(shè)有金屬尖刺，當(dāng)試劑管放置在試劑管放置位置上時(shí)可以刺破試劑管底部的鋁箔；設(shè)置a-h八個(gè)試劑管，其中：試劑管a為空管，用以待裝樣品，試劑管b和試劑管c內(nèi)盛裝濾膜沖洗液，試劑管d內(nèi)盛裝細(xì)菌裂解液，試劑管e和試劑管f內(nèi)盛裝吸附層沖洗液，試劑管g內(nèi)盛裝帶有染料分子的特異性抗體溶液，試劑管h內(nèi)盛裝吸附層沖洗液；所述觀察孔位于吸附層正上方，開孔在箱體頂部。

本發(fā)明所述的裝置集成在0.3m*0.2m*0.2m的硬質(zhì)包裝盒中，用戶只需要根據(jù)說明書進(jìn)行注射操作即可。

前排試劑管(a-h)為預(yù)置的裂解、洗滌、標(biāo)記溶液，未使用時(shí)以鋁箔封裝好，使用時(shí)撕掉鋁箔，按照說明書逐個(gè)置于試劑管放置位置1，以使不同溶液以一定的順序流經(jīng)濾膜和吸附層。i位置為觀察孔，用于觀察吸附層的顏色，并與預(yù)置的參照比色卡相比較，以讀出樣品中srb的濃度。

本發(fā)明中，細(xì)菌富集是通過樣品流經(jīng)濾膜實(shí)現(xiàn)的。撕開試劑管上方鋁箔，取空的試劑管a，放入1ml待測樣品，將a放入試劑管放置位置1后，樣品管底部鋁箔包裝被下部金 屬尖刺破，液體流入濾膜2上方，此時(shí)在上方施加壓力，推動(dòng)液體經(jīng)過濾膜，大于濾膜孔徑的固體物質(zhì)被留在濾膜上，液體流出。此時(shí)閥門5b開啟，閥門5a關(guān)閉，廢液流出至右側(cè)廢液池4b。當(dāng)樣品為油田廢水等水相物質(zhì)時(shí)，采用親水性濾膜，濾膜尺寸應(yīng)在0.5微米以下以確保目標(biāo)微生物能夠保留在濾膜上。當(dāng)樣品為成品油等油相物質(zhì)時(shí)，采用親油性濾膜。當(dāng)樣品全部流經(jīng)濾膜后，拔除樣品管，取出上部活塞，將預(yù)置于前排的試劑管b放入試劑管放置位置1，樣品管底部鋁箔包裝被下部金屬尖刺破，放入活塞，重復(fù)上述加壓流程以沖洗濾膜。繼續(xù)更替為試劑管c進(jìn)行沖洗。當(dāng)沖洗結(jié)束后，加入試劑管d，內(nèi)含細(xì)菌裂解液，等待一定時(shí)間后開始加壓，此時(shí)閥門5b關(guān)閉，閥門5a開啟，細(xì)菌裂解液流經(jīng)吸附層3后進(jìn)入左側(cè)廢液池4a。吸附層3的材質(zhì)可以選擇為特異性吸附蛋白質(zhì)的材料、不同截留分子量的超濾膜、表面功能化了aps抗體的吸附材料等。繼續(xù)更換試劑管e、試劑管f進(jìn)行沖洗，此步驟目的為移除細(xì)菌裂解液中除(目標(biāo))蛋白質(zhì)外的雜質(zhì)。g為帶有染料分子的特異性抗體溶液，染料分子通過抗體與aps特異性結(jié)合，染料分子的數(shù)量與aps成正比。染料分子可以為金納米顆粒、其它顆粒、其它帶有顏色的分子等。最后由試劑管h中的溶液沖洗走多余未與aps結(jié)合的抗體。吸附層3的位置與上方觀察孔i對(duì)應(yīng)，在吸附層3位置邊預(yù)置不同濃度對(duì)應(yīng)的比色卡作為定量參照。

為了使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)、技術(shù)方案更加清楚、明確，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的步驟做詳細(xì)說明。

廢水中srb的定量檢測

1)開啟閥門5b，關(guān)閉閥門5a；

2)取試劑管，撕開上方鋁箔封裝，取下空試劑管a，裝入1ml樣品，將其放入試劑管放置位置1，放入活塞，向下推動(dòng)活塞使液體流經(jīng)濾膜；

3)待全部液體流經(jīng)濾膜后，移除試劑管a，取下活塞，將試劑管b放入試劑管放置位置1，推動(dòng)活塞使試劑管b中液體全部流經(jīng)濾膜；

4)對(duì)試劑管c重復(fù)2)中操作；

5)開啟閥門5a，關(guān)閉閥門5b；

6)取試劑管d，將其放入試劑管放置位置1后略搖晃，使底部鋁箔與針接觸的位置有空隙，使液體流下至濾膜上方，靜置10分鐘；推動(dòng)活塞，控制流速使液體緩慢流經(jīng)濾膜和吸附層；

7)待全部液體流經(jīng)濾膜后，移除試劑管d，取下活塞，將試劑管e放入試劑管放置位置1，推動(dòng)活塞使試劑管e中液體全部流經(jīng)濾膜；

8)對(duì)試劑管f重復(fù)7)中操作；

9)取試劑管g，將其放入試劑管放置位置1后推動(dòng)活塞，控制流速使液體停留在吸附層3前，靜置10分鐘；推動(dòng)活塞，控制流速使液體緩慢流經(jīng)吸附層；

10)待全部液體流經(jīng)濾膜后，移除試劑管g，取下活塞，將試劑管h放入試劑管放置位置1，推動(dòng)活塞使試劑管h中液體全部流經(jīng)濾膜；

11)觀察吸附層3的顏色，與比色卡比較，讀出對(duì)應(yīng)濃度。

在本實(shí)施例中，放入樣品為1ml含有10⁷cfu/mlsrb的水溶液，操作總時(shí)長為1小時(shí)30分鐘左右，經(jīng)與比色卡比較，最終測得濃度為5×10⁶cfu/ml-10⁷cfu/ml之間，與樣品值相同。

需要說明的是，在本說明書的教導(dǎo)下本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以作出這樣或那樣的容易變化方式，諸如等同方式，或明顯變形方式，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。