本發(fā)明涉及比色皿的改進(jìn)，具體涉及一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法。

背景技術(shù)：

1989年，《科學(xué)》雜志報(bào)導(dǎo)Drake等人利用原子力顯微鏡(AFM)的接觸模式觀測(cè)云母片上的凝血酶催化血纖蛋白原的聚合反應(yīng)時(shí)，觀察到了平行的彎曲纖維陣列【Science,1989,243,1586】。1990年，《Langmuir》雜志報(bào)導(dǎo)Lin等人利用原子力顯微鏡(AFM)的接觸模式觀測(cè)免疫球蛋白G(4-4-20 IgG2)在PBS緩沖液中的自組裝時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)沉積而成的褶皺結(jié)構(gòu)，其脊部呈反復(fù)彎曲狀，但整體取向大致平行【Langmuir,1990,6,509】。然而，在這些試驗(yàn)中，觀測(cè)者均未注意到探針對(duì)成纖的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法，該方法操作簡(jiǎn)便，能夠精確控制生成的膠原蛋白納米纖維陣列結(jié)構(gòu)的走向。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下：

一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法，具體步驟如下：

步驟1，將云母片固定在載玻片上，用膠帶撕開(kāi)云母片表層使其露出新鮮晶面，清洗干凈；

步驟2，在云母片的新鮮晶面上滴加40～50μg/mL的膠原蛋白單體溶液，培育2～3小時(shí)，培育結(jié)束后清洗除去吸附不牢的膠原蛋白；

步驟3，將云母晶面用水浸潤(rùn)，利用原子力顯微鏡對(duì)膠原蛋白進(jìn)行加工，采用接觸模式，探針上施加的力為10^-8～10^-6N，得到設(shè)定取向的蛋白納米纖維陣列；

步驟4，將加工后的云母片粘結(jié)成比色皿。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在原子力顯微鏡的接觸模式下，在探針上施加合適的力，膠原蛋白可以形成整體取向一致的纖維陣列，且與單體的自組裝能力無(wú)關(guān)?；趩胃w維的特性以及纖維陣列的取向與探針掃描方向的關(guān)系，發(fā)明人提出了原子力顯微鏡探針的掃把機(jī)理，即：在原子力顯微鏡的接觸模式下，樣品作用于探針上的力可分解成水平與垂直方向，其中垂直方向上的力會(huì)使懸臂發(fā)生彎曲。在掃描過(guò)程中，垂直方向的力或懸壁的彎曲度應(yīng)保持恒定，這由壓電傳感器通過(guò)調(diào)節(jié)懸臂高度來(lái)控制。當(dāng)作用在探針上的力大于樣品分子與基質(zhì)的結(jié)合力時(shí)，探針將樣品分子推動(dòng)，像掃把一樣掃動(dòng)分子并堆積起來(lái)。此時(shí)探針受力和懸臂彎曲度都會(huì)增大，當(dāng)垂直方向的力大過(guò)壓電傳感器設(shè)置的閾值時(shí)，系統(tǒng)便將懸臂上提以緩解壓力。于是，探針便滑過(guò)堆積的樣品分子表面。隨著垂直方向的力進(jìn)一步減小，壓電傳動(dòng)系統(tǒng)將探針再次放低來(lái)進(jìn)行新一輪的掃把運(yùn)動(dòng)。這樣，每一行掃描結(jié)束后，探針會(huì)將樣品分子掃成幾堆。當(dāng)接下來(lái)的一行掃描時(shí)，又會(huì)形成新的樣品分子堆積。如果行距合適使得相鄰兩行的樣品分子堆能相互接觸，它們便很可能隨機(jī)結(jié)合起來(lái)，形成了呈之字形的隨機(jī)反復(fù)彎曲的單根纖維，其大致取向垂直于探針的行掃描方向。

本發(fā)明中，在云母片表面的不同區(qū)域使用原子力顯微鏡的接觸模式來(lái)制造蛋白納米纖維時(shí)，在合適的探針作用力下才能產(chǎn)生纖維，當(dāng)探針作用力遠(yuǎn)大于吸附分子與基質(zhì)或分子之間的作用力時(shí)，探針便可能將蛋白分子掃出掃描區(qū)域；纖維取向垂直于探針行掃描方向；單根纖維的尺寸由探針作用力和掃描行間距共同決定。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，能夠精確控制生成的膠原蛋白納米纖維陣列結(jié)構(gòu)走向，比色皿表面接觸角均值達(dá)到9.5°，具有良好的親水性能，可用于細(xì)胞培養(yǎng)。此外，本發(fā)明比色皿相對(duì)的兩個(gè)云母片上的蛋白納米纖維陣列可加工成統(tǒng)一方向，具有很好的偏振特性。若作為掩模，也可以結(jié)合電化學(xué)方法合成新型的生物傳感器。

附圖說(shuō)明

圖1為原子力顯微鏡接觸模式下探針的掃把機(jī)理示意圖。

圖2為實(shí)施例1制得的去離子水覆蓋的云母晶面上的膠原蛋白膜層的原子力顯微鏡表面形貌圖。

圖3為實(shí)施例1制得的具有膠原蛋白納米纖維陣列的原子力顯微鏡高度圖。

圖4為實(shí)施例1接觸模式下原子力顯微鏡探針在去離子水覆蓋的云母晶面的不同區(qū)域制造膠原蛋白纖維陣列。

圖5為實(shí)施例2制得的具有膠原蛋白納米纖維陣列的原子力顯微鏡高度圖。

圖6為實(shí)施例2制得的具有膠原蛋白納米纖維陣列的原子力顯微鏡高度圖。

圖7為實(shí)施例2云母晶面上的靜態(tài)接觸角，其中A為嶄新的(001)晶面，B為具有膠原蛋白納米纖維膜層覆蓋的晶面。

圖8為實(shí)施例2制得的膠原蛋白納米纖維陣列膜層的透射比測(cè)試圖。

圖9為實(shí)施例2具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

實(shí)施例1

一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法，具體步驟如下：

步驟1，將云母片切割成約1cm×1cm的方片，用雙面膠貼在載玻片中央，用單面透明膠帶撕開(kāi)云母片表層使露出新鮮晶面，用去離子水潤(rùn)洗晶面兩次；

步驟2，取適量5mg/mL的膠原蛋白單體溶液，用去離子水稀釋至40μg/mL；

步驟3，立刻滴上40μg/mL的膠原蛋白單體溶液覆蓋云母晶面3小時(shí)，培育完成后除去云母晶面上的膠原蛋白單體溶液，并用去離子水小心清洗晶面2次以除去吸附不牢的蛋白質(zhì)；

步驟4，用去離子水覆蓋云母晶面，進(jìn)行膠原蛋白的原子力顯微鏡表征與加工試驗(yàn)。原子力顯微鏡對(duì)膠原蛋白樣品進(jìn)行表征工作模式設(shè)置為輕敲模式，行掃描方向平行于探針懸臂方向，振幅約100nm，驅(qū)動(dòng)頻率約8kHz，接近探針懸臂在溶液中的共振頻率，加工工作模式為接觸模式，施加在探針上的力在10^-8到10^-6N之間，兩種掃描模式的分辨率均為256×256。

AFM對(duì)樣品進(jìn)行表征和加工，圖2是具有代表性的5μm×5μm區(qū)域，其表面均方根粗糙度約為0.8nm，這種不均勻性可能是膠原蛋白單體的隨機(jī)覆蓋導(dǎo)致。然而在原子力顯微鏡的接觸模式下對(duì)同一區(qū)域進(jìn)行兩次同樣的掃描，接著使用輕敲模式進(jìn)行表征如圖1所示，在原子力顯微鏡的接觸模式下，樣品作用于探針上的力可分解成水平與垂直方向，其中垂直方向上的力會(huì)使懸臂發(fā)生彎曲。在掃描過(guò)程中，垂直方向的力或懸壁的彎曲度應(yīng)保持恒定，這由壓電傳感器通過(guò)調(diào)節(jié)懸臂或樣品臺(tái)的高度來(lái)控制。當(dāng)作用在探針上的力大于樣品分子與基質(zhì)的結(jié)合力時(shí)，探針將樣品分子推動(dòng)，像掃把一樣在圖B中掃動(dòng)分子并堆積起來(lái)。此時(shí)探針受力和懸臂彎曲度都會(huì)增大，當(dāng)垂直方向的力大過(guò)壓電傳感器設(shè)置的閾值時(shí)，系統(tǒng)便將懸臂上提以緩解壓力。于是，探針便如圖C所示滑過(guò)堆積的樣品分子表面。隨著垂直方向的力進(jìn)一步減小，在圖D中壓電傳動(dòng)系統(tǒng)將探針再次放低來(lái)進(jìn)行新一輪的掃把運(yùn)動(dòng)。這樣，每一行掃描結(jié)束后，探針會(huì)將樣品分子掃成幾堆。當(dāng)接下來(lái)的一行掃描時(shí)，又會(huì)形成新的樣品分子堆積。如果行距合適使得相鄰兩行的樣品分子堆能相互接觸，它們便很可能隨機(jī)結(jié)合起來(lái)，形成了呈之字形的隨機(jī)反復(fù)彎曲的單根纖維，其大致取向垂直于探針的行掃描方向。

AFM加工得到如圖3所示的膠原蛋白納米纖維陣列圖。接觸模式的行掃描方向平行于探針懸臂方向(圖中用白色箭頭標(biāo)出)，探針作用力設(shè)置為1×10^-7N。圖3中單根膠原蛋白納米纖維呈反復(fù)彎曲狀，但整個(gè)納米纖維陣列的取向較為一致，大致垂直于接觸模式的探針行掃描方向。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，單根蛋白納米纖維的長(zhǎng)度從幾百納米到幾微米不等，平均高度約2nm，寬度約150nm，陣列中納米纖維間距并不均勻，從互相接觸到幾百納米不等。接觸模式下的初次掃描可以均衡云母表面的蛋白單體分布，對(duì)同一區(qū)域進(jìn)行兩次同樣的掃描便可以得到較穩(wěn)定且排列規(guī)則的蛋白納米纖維陣列，兩次以上的掃描對(duì)單根納米纖維的局部排列有顯著改變，但對(duì)納米纖維陣列的整體形貌影響不大。

另選了一塊如圖4所示的10μm×10μm區(qū)域來(lái)制造蛋白納米纖維，圖中白色箭頭平行于探針懸臂。首先，在A區(qū)域(5μm×5μm)利用原子力顯微鏡的接觸模式連續(xù)掃描兩次，行掃描方向垂直于探針懸臂方向，探針作用力設(shè)置為2×10-7N。緊接著在B區(qū)域(2.5μm×2.5μm)使用同種模式、相同方向以及相同探針作用力進(jìn)行兩次連續(xù)掃描。接下來(lái)，在C區(qū)域(5μm×5μm)利用接觸模式連續(xù)掃描兩次，行掃描方向平行于探針懸臂方向，探針作用力增加到5×10-7N。接著，在D區(qū)域(2.5μm×2.5μm)使用同種模式和相同方向進(jìn)行兩次連續(xù)掃描，但是探針作用力增加到1×10-6N。最后，我們?cè)谠恿︼@微鏡的輕敲模式下對(duì)整個(gè)區(qū)域進(jìn)行表征，得到了圖4中分塊的膠原蛋白納米纖維陣列圖。很顯然，A區(qū)域和C區(qū)域的納米纖維陣列的取向互相大致垂直，均垂直于接觸模式下探針的行掃描方向。對(duì)比圖2、3，在圖4的A區(qū)域由于探針作用力增加，單根蛋白纖維的平均寬度增加到約270nm，而在B區(qū)域由于掃描行間距變小產(chǎn)生更大重疊區(qū)域，蛋白纖維變得稀疏和粗壯，單根蛋纖維高度約5nm，寬度約350nm。在C區(qū)域，由于探針作用力進(jìn)一步增加，可能有大量蛋白分子被探針帶出該區(qū)域，纖維變得稀疏且單薄。在D區(qū)域，當(dāng)探針的作用力較圖1增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)，膠原蛋白分子基本上被探針“掃”走了。

實(shí)施例2

一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法，具體步驟如下：

步驟1，將云母片切割成約1cm×1cm的方片，用雙面膠貼在載玻片中央，用單面透明膠帶撕開(kāi)云母片表層使露出新鮮晶面，用去離子水潤(rùn)洗晶面兩次；

步驟2，取適量5mg/mL的膠原蛋白單體溶液，用去離子水稀釋至50μg/mL；

步驟3，立刻滴上50μg/mL的膠原蛋白單體溶液覆蓋晶面2小時(shí)，然后除去云母晶面上的蛋白質(zhì)溶液，并用去離子水小心清洗晶面2次以除去吸附不牢的蛋白質(zhì)；

步驟4，用去離子水覆蓋云母晶面進(jìn)行膠原蛋白的原子力顯微鏡表征與加工試驗(yàn)，得到設(shè)定取向的蛋白納米纖維陣列。然后將云母片粘結(jié)成比色皿。

在去離子水覆蓋的云母片表面的不同區(qū)域使用原子力顯微鏡的接觸模式來(lái)制造蛋白納米纖維時(shí)，當(dāng)其他條件一樣，僅掃描方向不同時(shí)，我們得到了如圖5、6所示的結(jié)果。圖5、6是兩個(gè)不同位置的2.5μm×2.5μm區(qū)域。兩區(qū)域均使用原子力顯微鏡的接觸模式連續(xù)掃描兩次，緊接著使用輕敲模式來(lái)進(jìn)行表征(圖中白色箭頭為平行探針懸臂方向)；接觸模式的探針作用力均設(shè)置為1×10^-7N。在接觸模式下，圖5區(qū)域的行掃描方向?yàn)槠叫杏谔结槕冶鄯较颍瑘D6的方向?yàn)榇怪庇谔结槕冶鄯较?。圖5、6中蛋白纖維密度較圖3稀疏，平均高度約3nm，寬度約200nm。盡管單根纖維呈反復(fù)彎曲狀，但整個(gè)纖維陣列的取向大致垂直于接觸模式下的行掃描方向。

分別對(duì)嶄新的和已有膠原蛋白納米纖維膜層覆蓋的云母晶面樣品進(jìn)行靜態(tài)水滴接觸角的基線圓法測(cè)試，為減小測(cè)量誤差，我們對(duì)同一樣品取了3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量后取其平均值。結(jié)果如圖7所示。在圖7(A)中嶄新的云母晶面接觸角測(cè)量均值為25.8°，而圖7(B)有蛋白納米纖維覆蓋的晶面接觸角均值僅為9.5°。很顯然，膠原蛋白納米纖維膜層顯著地增強(qiáng)了云母晶面的親水性。

同時(shí)對(duì)膠原蛋白納米纖維膜層做透射分析，透射波長(zhǎng)范圍為360-1100nm，結(jié)果如圖8所示。從透射圖可以看出，從400nm之后，透射比為80％以上，隨著波長(zhǎng)的增大，透射比穩(wěn)定在90％左右，說(shuō)明此膜層具有良好的透光性能。

綜上所述，對(duì)制得的具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層的比色皿在AFM和接觸角測(cè)試儀上進(jìn)行性能表征，結(jié)果表明按照實(shí)例2的工藝參數(shù)，制得的膠原蛋白納米纖維陣列膜層的比色皿，如圖9所示，具有很好的線性排列特性、接觸角小、親水性好、細(xì)胞培養(yǎng)特性、生物傳感器特性。