本發(fā)明涉及一種抗生素敏感性快速檢測方法，具體涉及采用等溫微量熱法檢測β-內(nèi)酰胺酶抗生素敏感性的快速檢測方法，屬于生化分析領域。

背景技術：

β-內(nèi)酰胺類抗生素是一類含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗菌藥物，包括青霉素類，頭孢菌素類，碳青霉烯類以及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等。β-內(nèi)酰胺抗生素主要通過抑制與細菌細胞壁肽聚糖合成相關的 PBPs 轉(zhuǎn)肽酶來實現(xiàn)殺菌目的。自1928年青霉素的發(fā)現(xiàn)以來，β-內(nèi)酰胺類抗生素被長期用于細菌感染的治療，顯著提高了人類的生命健康質(zhì)量。然而，隨著抗生素的不合理使用，細菌的耐藥性問題日益凸顯。在全球范圍內(nèi)，抗生素耐藥已成為導致患者發(fā)病及死亡的重要原因。因此，及時監(jiān)測細菌耐藥對于感染病人治療方案的確定和預防醫(yī)院內(nèi)病菌的交叉感染具有重要意義。

傳統(tǒng)的抗生素敏感性檢測方法為瓊脂稀釋法，即最小抑菌濃度MIC檢測法。該方法通過將抗菌藥物配制到瓊脂培養(yǎng)基中，制成一系列藥物濃度遞減的培養(yǎng)基以用于細菌過夜培養(yǎng)，以未見細菌生長的最低抗生素濃度（即MIC值）來評估細菌的藥敏性。該方法的優(yōu)點是定量、準確，其主要缺點是操作復雜耗時長，通常得到測試結果需要16到24小時，對于一些生長較慢的菌種所需時間更長。細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制是細菌進化產(chǎn)生一種抗生素鈍化酶，即β-內(nèi)酰胺酶，其催化的β-內(nèi)酰胺環(huán)水解反應可以導致該類抗生素失效。因此，近年來，基于抗生素鈍化酶基因或生化活性的耐藥檢測方法越來越受歡迎。該方法的優(yōu)點是可以較快地從分子水平確定特定β-內(nèi)酰酶的表達，缺點是其所用引物只能用于檢測已知基因，不能用于新β-內(nèi)酰胺酶基因和突變基因的檢測。直接檢測細菌β-內(nèi)酰胺酶活性的實驗方法也有報道，例如伯納烏、皮雷利等人采用紫外分光光度法分析細菌裂解液水解β-內(nèi)酰胺抗生素水平以提供其耐藥信息。但是該方法工作量大，而且仍需要數(shù)個小時才能得出測試結果。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種方便快捷、操作簡單，基于等溫滴定微量熱技術快速檢測β-內(nèi)酰胺酶耐藥特征的方法。該方法通過實時觀察樣品（e.g. β-內(nèi)酰胺酶溶液或臨床細菌）與抗生素混合后是否產(chǎn)生熱量變化（抗生素水解是放熱反應）從而快速獲得藥物對樣品的敏感信息，或樣品是否含β-內(nèi)酰胺酶（e.g. 產(chǎn)酶菌株），對臨床用藥指導和預防耐藥細菌傳播具有重要指導意義。

本發(fā)明實現(xiàn)過程如下：

一種β-內(nèi)酰胺酶藥敏快速檢測方法：將待測樣品與β-內(nèi)酰胺類抗生素在等溫滴定微量熱儀反應池中混合，記錄實時熱量變化，通過是否產(chǎn)生熱量變化判斷樣品對藥物的敏感信息，若放出熱量，則待測樣品含有β-內(nèi)酰胺酶活。

上述待測樣品為純化的蛋白質(zhì)、細菌裂解液或臨床細菌。

上述臨床細菌為大腸桿菌、鮑曼不動桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌或金黃色葡萄球菌。

上述β-內(nèi)酰胺類抗生素為青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類。

具體地說，上述的β-內(nèi)酰胺酶藥敏快速檢測方法，包括以下步驟：

1)給等溫滴定微量熱儀樣品池加待測樣品，待測樣品濃度為純化蛋白質(zhì)0.5-50 nM 或細菌懸液 OD600 = 1~20;

2)滴定針加樣β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物，抗生素濃度 1-5 mM，緩沖液含50 mM Tris，pH 7.0；

3)將滴定針中β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物加入樣品池，實時記錄樣品池中熱量變化；反應條件：滴定體積 20-40μL，spacing time = 400s，滴定針轉(zhuǎn)速750 rpm, 反應溫度25 oC。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

（1）該方法靈敏快速，可以在10分鐘內(nèi)快速獲得β-內(nèi)酰胺酶是否對特定抗生素具有水解活性或樣品是否含β-內(nèi)酰胺酶的信息。大大節(jié)省了傳統(tǒng)藥敏測試的時間，因此可以用于臨床實驗室進行快速耐藥分析，指導醫(yī)生確定臨床用藥方案。

（2）該方法操作簡單，無需標記抗生素也無需根據(jù)不同抗生素調(diào)整實驗條件，唯一的探針是熱量的變化。因此，所有的β-內(nèi)酰胺抗生素都可以采用相同的實驗體系進行測試，避免了紫外分光光度法中不同抗生素需要選擇不同檢測波長的缺點。

（3）本方法應用性廣，既可用于純化的蛋白，也可用于細菌裂解液、甚至是活細菌的耐藥檢測，而紫外分光光度法不適用于懸濁液的分析。

附圖說明

圖1為實施例1中純化的金屬β-內(nèi)酰胺酶L1與青霉素G、亞胺培南、先鋒霉素（V）進行滴定的ITC圖譜；

圖2為實施例1中表達L1蛋白的重組大腸桿菌細胞（E.coli-L1）與青霉素G、亞胺培南、先鋒霉素（V）進行滴定的ITC圖譜；

圖3為實施例2中臨床大腸桿菌與三種β-內(nèi)酰胺抗生素的ITC圖譜；

圖4為實施例3中臨床鮑曼不動桿菌與三種β-內(nèi)酰胺藥物的ITC圖譜。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實例中所用等溫滴定微量熱儀型號為馬爾文公司所生產(chǎn)的ITC200量熱儀。

本發(fā)明采用等溫滴定微量熱儀（ITC）進行抗生素耐藥性分析的實驗方法，包括如下步驟：

（1）在等溫滴定微量熱儀（ITC）的滴定針內(nèi)加入1mM 待測抗生素（青霉素、亞胺培南、先鋒霉素等）；

（2）在等溫滴定微量熱儀（ITC）的樣品池內(nèi)加入含有待測β-內(nèi)酰胺酶的溶液或待測細菌懸濁液；

（3）設置電腦程序滴加20-40 μL 抗生素至樣品池，滴定針轉(zhuǎn)速750 rpm, 檢測溫度25 oC， 在20 min 內(nèi)通過電腦記錄樣品池中實時熱量變化，直至熱量變化回到基線（所有抗生素被水解完全）；

（4）根據(jù)電腦記錄的熱量隨時間變化曲線判定藥物的敏感性，如所述樣品對抗生素具有水解活性，即可觀察到負熱量變化（抗生素水解為放熱反應）。如所述樣品對抗生素無水解活性，或所述樣品不含有β-內(nèi)酰胺酶，則觀察不到負熱量變化。

實施例1、金屬β-內(nèi)酰胺酶L1耐藥分析

如圖1-2所示，本發(fā)明提供的實驗方法可以用于分析金屬β-內(nèi)酰胺酶L1的耐藥性，該實例中圖1使用的樣品是純化的L1蛋白質(zhì)，圖2使用的是表達L1蛋白的重組大腸桿菌細胞（E.coli-L1）。根據(jù)該圖，L1 可以水解青霉素G鈉鹽、亞胺培南、先鋒霉素V這三種抗生素，與文獻報道L1抗生素耐藥譜一致。

耐藥分析具體步驟如下：

（1）將L1單克隆大腸桿菌（pET26b-L1）接種于50 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫隔夜培養(yǎng)；

（2）隔天接菌擴大培養(yǎng)，待 OD600 達到 0.6，加入 IPTG 誘導反應 3 h 后，離心收集細胞；

（3）步驟（2）所述細胞經(jīng)超聲破碎，收集清液用陰離子交換柱（Q柱）進行純化；

（4）步驟（3）所述純化蛋白透析至ITC緩沖液 (50 mM Tris, pH 7.0)，用注射器吸取210 μL上樣至樣品池。優(yōu)選蛋白濃度為20 nM；

（5）如果是細菌實驗，將步驟（2）收集的細菌用ITC緩沖液 (50 mM Tris, pH 7.0)配制成菌懸液，優(yōu)選濃度OD600 = 0.6，用注射器吸取210 μL上樣至樣品池；

（6）配制1 mM 抗生素溶液至 ITC 緩沖液 (50 mM Tris, pH 7.0)，上樣至滴定針。設置電腦程序分別滴加20 μL 抗生素溶液至樣品池，實時記錄樣品池內(nèi)熱量變化曲線。滴定針轉(zhuǎn)速優(yōu)選750 rpm，檢測溫度優(yōu)選25 oC；

（7）如圖1，三種抗生素與L1酶混合后均可檢測到負的熱量變化，說明L1可以水解這三種抗生素，且該水解反應是放熱反應。其中L1酶催化青霉素G鈉鹽的水解反應最快，熱量變化最快回到基線水平（180 sec）。如圖2，三種抗生素與步驟（2）中重組大腸桿菌細胞（E.coli-L1）混合后檢測到的熱量變化曲線與圖1類似，說明該方法同樣適用于細菌對β-內(nèi)酰胺的藥敏分析。

實施例2、臨床大腸桿菌β-內(nèi)酰胺耐藥性分析

如圖3所示，本發(fā)明提供的實驗方法可以用于分析臨床大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺藥物的耐藥特征，且單次分析在400 sec 內(nèi)即可完成。該實例中使用的樣品是經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院從臨床病人體液中分離得到的一株大腸桿菌菌株。

具體步驟如下：

（1）挑取新鮮血平板上的單菌落用MH肉湯培養(yǎng)液在37℃進行隔夜培養(yǎng)；

（2）離心培養(yǎng)液，用 ITC 緩沖液 (50 mM Tris, pH 7.0) 配制成 OD600 = 1~4 的菌懸液，優(yōu)選濃度 OD600 = 3，用注射器吸取210 μL至樣品池；

（3）如實施例1步驟（6）進行菌液ITC藥敏實驗。步驟（2）中的臨床菌懸液分別與1mM 的青霉素G、亞胺培南、先鋒霉素（V）進行滴定。 反應條件：滴定體積 20 μL，spacing time = 400 s，轉(zhuǎn)速750 rpm, 反應溫度25 oC。標準菌株E.coli ATCC 25922 作為陰性參照；

（4）圖3為三種抗生素滴定臨床大腸桿菌和陰性菌株的熱量變化。三種抗生素滴定陰性菌株 E.coli ATCC 25922 均無熱量變化，符合該菌株對抗生素敏感的特征。青霉素G與先鋒霉素（V）滴定臨床大腸桿菌產(chǎn)生負的熱量變化，而滴定亞胺培南無熱量變化，說明該臨床菌株對青霉素G鈉鹽與先鋒霉素（V）有水解活性，對亞胺培南無水解活性；

（5）采用瓊脂稀釋法對該臨床大腸桿菌菌株進行藥敏實驗，結果表明該菌株對

青霉素G、先鋒霉素（V）和亞胺培南的最小抑菌濃度（MIC）分別為 25000、6300 和 1 μg/mL。該測試結果與ITC檢測結果一致，此臨床菌株對青霉素G與先鋒霉素（V）耐藥，對亞胺培南敏感。

實施例3、臨床鮑曼不動桿菌β-內(nèi)酰胺耐藥性分析

如圖4所示，本發(fā)明提供的實驗方法可以用于分析臨床鮑曼不動桿菌對β-內(nèi)酰胺藥物的耐藥特征，且單次分析可在500 sec 內(nèi)完成。該實例中使用的樣品是經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院從臨床病人體液中分離得到的一株鮑曼不動桿菌菌株。

具體步驟如下：

（1）用接種環(huán)在新鮮血平板上直接刮取鮑曼不動桿菌菌落，用ITC緩沖液 (50 mM Tris, pH 7.0) 配制成 OD600 = 1~4 的菌懸液，優(yōu)選濃度 OD600 = 1.4，用注射器吸取210 μL至樣品池；

（2）如實施例1步驟（6）進行菌液ITC藥敏實驗。步驟（1）中的菌液及陰性參照菌液分別與1mM 的青霉素G鈉鹽、亞胺培南、先鋒霉素（V）進行滴定。 反應條件：滴定體積 20μL，spacing time = 400s，轉(zhuǎn)速750 rpm, 反應溫度25 oC；

（4）圖4為三種抗生素滴定臨床大腸桿菌和陰性菌株的熱量變化。三種抗生素滴定陰性菌株均無熱量變化，滴定待測鮑曼不動桿菌均有明顯負的熱量變化，表明該菌株對青霉素G、先鋒霉素（V）和亞胺培南均可水解；

（5）采用瓊脂稀釋法對該臨床鮑曼不動桿菌菌株進行藥敏實驗，結果表明該菌株對青霉素G鈉鹽、先鋒霉素（V）和亞胺培南的最小抑菌濃度（MIC）分別為 25000、6300 和 60 μg/mL。該測試結果與ITC檢測結果一致，此臨床菌株對青霉素G、先鋒霉素（V）以及亞胺培南均耐藥。