本發(fā)明涉及膜酶活性科研實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種利于膜酶鑲嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制備方法。
背景技術(shù)：
生物細(xì)胞尤其是真核生物細(xì)胞有發(fā)達(dá)的生物膜(biomembrane)系統(tǒng)。生物膜是鑲嵌有蛋白質(zhì)和糖類的磷脂雙分子層。真核細(xì)胞除質(zhì)膜(又稱細(xì)胞膜)外，還有分隔各種細(xì)胞器的膜系統(tǒng)，包括核膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體膜、高爾基體膜、葉綠體膜、液泡膜、過氧化酶體膜等。生物膜形態(tài)上都呈雙分子層的片層結(jié)構(gòu)，厚度約5～10納米。生物膜起著劃分和分隔細(xì)胞和細(xì)胞器的作用，也是與許多能量轉(zhuǎn)化和細(xì)胞內(nèi)通訊有關(guān)的重要部位，同時(shí)，生物膜上還有大量的酶結(jié)合位點(diǎn)。不同的生物膜具體作用又各不相同。
1965年，英國學(xué)者banghamad把磷脂分散到過量水中，形成了一種由雙分子膜組成的閉合磷脂微囊，這一發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了新的研究領(lǐng)域。人工磷脂微囊具有類似于生物膜的結(jié)構(gòu)，構(gòu)成雙分子層的類脂親水性的頭部形成膜的內(nèi)表面，而親脂性的尾部則處于膜的中間，這種類膜結(jié)構(gòu)使其能夠包裹多種物質(zhì)。人工模擬生物膜有利于研究其功能，例如各種物質(zhì)穿過膜的機(jī)理、生物膜上的各種蛋白質(zhì)和糖類的功能。在醫(yī)學(xué)上，人工生物膜微囊可以作為藥物的載體，攜帶藥物進(jìn)入細(xì)胞，該進(jìn)藥方式具有靶向、長(zhǎng)效、低毒、緩釋、無免疫原性及保護(hù)包封藥物的優(yōu)點(diǎn)。另外，人工磷脂微囊還可以作為基因轉(zhuǎn)染載體，還可以用于免疫學(xué)檢測(cè)等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：以往的人工磷脂微囊形成方法往往技術(shù)復(fù)雜，所形成的磷脂微囊小，不利于將酶蛋白嵌入到微囊膜上。從而提供了一種利于膜酶鑲嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種利于膜酶鑲嵌及其活性研究的酶-磷脂微囊制備方法，主要包括以下步驟：
s1、磷脂微粒的制備：
(1)把40mg丙酮洗過的磷脂，懸浮在1ml緩沖液中，并加入膽酸鈉至終濃度為2％，過程中控制溫度27～28℃；
(2)冰上超聲波處理5分鐘，超聲處理時(shí)，要不斷的通入氬氣，以保證無氧環(huán)境；
(3)靜置5分鐘后，再超聲處理5分鐘；
s2、酶蛋白質(zhì)嵌入磷脂微囊：
(1)準(zhǔn)備酶溶液300μl，其中酶蛋白含量為1～2mg/ml；將所述酶溶液置于-60℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融3～5次，每次凍融后均用勻漿機(jī)高速勻漿處理；
(2)往酶溶液中加膽酸鈉溶液至終濃度為0.5％，過程中控制溫度27～28℃；
(3)加入s1制備得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的質(zhì)量比為1:40；
(4)在冰上孵育30分鐘；向孵育后的溶液中加入5.0～10.0％海藻酸鈉與4.5～6.0％二硫蘇糖醇混合溶液，最終使海藻酸鈉的質(zhì)量百分濃度為0.5～3％，二硫蘇糖醇的質(zhì)量百分濃度為0.3～2％，顛倒混勻后再置于冰上進(jìn)行二次孵育30～50min；
(5)在冰上或冷室中透析4小時(shí)，透析液體積為酶溶液體積的100倍，透析過程中不斷攪拌；
(6)用200倍體積的緩沖液繼續(xù)過夜透析，中間更換一次透析液，透析過程中不斷攪拌；
(7)用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡檢查微囊的大??；
(8)除菌，4℃密封保存。
進(jìn)一步地，在上述方案中，步驟s1中(1)所述磷脂為大豆磷脂(asolectin)。
進(jìn)一步地，在上述方案中，其特征在于，步驟s1中(1)所述緩沖液為ph為7.0、濃度為0.02～0.04mol/l的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，或者ph為7.4、濃度為50mm的磷酸緩沖液，或者ph為7.3、濃度為100mm的hepes-koh緩沖液。
進(jìn)一步地，在上述方案中，步驟s1中(2)所述的冰上超聲波處理具體操作為：將溶液放入容器中，利用20khz的探頭式脈沖超聲波進(jìn)行處理；處理過程如下：探頭插入液下1.3cm，液面高度保持6～10cm，脈沖時(shí)間為5～8s，占空比為40％～70％，溫度8～26℃，聲強(qiáng)150.22～672.34w/cm2。
進(jìn)一步地，在上述方案中，步驟s1中(3)所述的超聲處理是以每超聲10～13s，間歇2～5s的方法間歇超聲處理共5分鐘。步驟s1中(2)和(3)的超聲儀探頭插入溶液不易過淺，以免表面活性劑膽酸鈉產(chǎn)生泡沫。
進(jìn)一步地，在上述方案中，步驟s2中(1)所述酶包括但不限于牛心線粒體內(nèi)膜復(fù)合物ⅲ和牛心線粒體內(nèi)膜復(fù)合物iv，尤其適合于各種生物膜酶。
進(jìn)一步地，在上述方案中，步驟s2中(4)所述的二次孵育期間每隔5～10min混勻一次。
進(jìn)一步地，在上述方案中，步驟s2中(5)所述的透析液與步驟s1中(1)所述緩沖液相同。
進(jìn)一步地，在上述方案中，步驟s2中(5)和(6)所述的透析過程中透析袋的透過分子量為8000～14000之間。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：
(1)本發(fā)明方法形成的是大單層微囊，其體積大，能達(dá)到1微米左右，并且具有良好的穩(wěn)定性，有利于酶蛋白的嵌入。
(2)由于表面活性劑膽酸鈉的加入，改善了膜的流動(dòng)性，這也有利于膜酶蛋白的嵌入。
(3)本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，適合于研究各種膜酶的活性和功能。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說。
實(shí)施例1
一種利于牛心線粒體內(nèi)膜復(fù)合物?；钚匝芯康拿?磷脂微囊制備方法，主要包括以下步驟：
s1、磷脂微粒的制備：
(1)把40mg丙酮洗過的大豆磷脂，懸浮在1ml緩沖液中，并加入膽酸鈉至終濃度為2％，過程中控制溫度27℃；其中的緩沖液為ph為7.0、濃度為0.02mol/l的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；
(2)冰上超聲波處理5分鐘：將溶液放入容器中，利用20khz的探頭式脈沖超聲波進(jìn)行處理；處理過程如下：探頭插入液下1.3cm，液面高度保持6cm，脈沖時(shí)間為5s，占空比為40％，溫度8℃，聲強(qiáng)150.22w/cm；超聲處理時(shí)，要不斷的通入氬氣，以保證無氧環(huán)境；
(3)靜置5分鐘后，再以每超聲10s，間歇2s的方法間歇超聲處理共5分鐘；
s2、酶蛋白質(zhì)嵌入磷脂微囊：
(1)準(zhǔn)備酶溶液300μl，其中酶蛋白含量為1mg/ml；將所述酶溶液置于-60℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融3次，每次凍融后均用勻漿機(jī)高速勻漿處理；
(2)往酶溶液中加膽酸鈉溶液至終濃度為0.5％，過程中控制溫度27℃；
(3)加入s1制備得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的質(zhì)量比為1:40；
(4)在冰上孵育30分鐘；向孵育后的溶液中加入5.0％海藻酸鈉與4.5％二硫蘇糖醇混合溶液，最終使海藻酸鈉的質(zhì)量百分濃度為0.5％，二硫蘇糖醇的質(zhì)量百分濃度為0.3％，顛倒混勻后再置于冰上進(jìn)行二次孵育30min，二次孵育期間每隔5min混勻一次；
(5)在冰上透析4小時(shí)，透析過程中透析袋的透過分子量為8000，透析液體積為酶溶液體積的100倍，透析過程中不斷攪拌；透析液為ph為7.0、濃度為0.02mol/l的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；
(6)用200倍體積的緩沖液繼續(xù)過夜透析，中間更換一次透析液；其中，透析過程中透析袋的透過分子量為8000；
(7)用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡檢查微囊的大小為1.02微米；
(8)除菌，4℃密封保存。
實(shí)施例2
一種利于牛心線粒體內(nèi)膜復(fù)合物ⅳ活性研究的酶-磷脂微囊制備方法，主要包括以下步驟：
s1、磷脂微粒的制備：
(1)把40mg丙酮洗過的大豆磷脂，懸浮在1ml緩沖液中，并加入膽酸鈉至終濃度為2％，過程中控制溫度27.5℃；其中的緩沖液為ph為7.4、濃度為50mm的磷酸緩沖液；
(2)冰上超聲波處理5分鐘：將溶液放入容器中，利用20khz的探頭式脈沖超聲波進(jìn)行處理；處理過程如下：探頭插入液下1.3cm，液面高度保持8cm，脈沖時(shí)間為6s，占空比為55％，溫度17℃，聲強(qiáng)411.28w/cm；超聲處理時(shí)，要不斷的通入氬氣，以保證無氧環(huán)境；
(3)靜置5分鐘后，再以每超聲12s，間歇3.5s的方法間歇超聲處理共5分鐘；
s2、酶蛋白質(zhì)嵌入磷脂微囊：
(1)準(zhǔn)備酶溶液300μl，其中酶蛋白含量為1.5mg/ml；將所述酶溶液置于-60℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融4次，每次凍融后均用勻漿機(jī)高速勻漿處理；
(2)往酶溶液中加膽酸鈉溶液至終濃度為0.5％，過程中控制溫度27.5℃；
(3)加入s1制備得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的質(zhì)量比為1:40；
(4)在冰上孵育30分鐘；向孵育后的溶液中加入7.5％海藻酸鈉與5.2％二硫蘇糖醇混合溶液，最終使海藻酸鈉的質(zhì)量百分濃度為1.75％，二硫蘇糖醇的質(zhì)量百分濃度為1.1％，顛倒混勻后再置于冰上進(jìn)行二次孵育40min，二次孵育期間每隔7min混勻一次；
(5)在冷室中透析4小時(shí)，透析過程中透析袋的透過分子量為11000，透析液體積為酶溶液體積的100倍，透析過程中不斷攪拌；透析液為ph為7.4、濃度為50mm的磷酸緩沖液；
(6)用200倍體積的緩沖液繼續(xù)過夜透析，中間更換一次透析液；其中，透析過程中透析袋的透過分子量為110001；
(7)用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡檢查微囊的大小為0.98微米；
(8)除菌，4℃密封保存。
實(shí)施例3
一種利于牛心線粒體內(nèi)膜復(fù)合物ⅳ活性研究的酶-磷脂微囊制備方法，主要包括以下步驟：
s1、磷脂微粒的制備：
(1)把40mg丙酮洗過的大豆磷脂，懸浮在1ml緩沖液中，并加入膽酸鈉至終濃度為2％，過程中控制溫度28℃；其中的緩沖液為ph為7.3、濃度為100mm的hepes-koh緩沖液；
(2)冰上超聲波處理5分鐘：將溶液放入容器中，利用20khz的探頭式脈沖超聲波進(jìn)行處理；處理過程如下：探頭插入液下1.3cm，液面高度保持10cm，脈沖時(shí)間為8s，占空比為70％，溫度26℃，聲強(qiáng)672.34w/cm；超聲處理時(shí)，要不斷的通入氬氣，以保證無氧環(huán)境；
(3)靜置5分鐘后，再以每超聲13s，間歇5s的方法間歇超聲處理共5分鐘；
s2、酶蛋白質(zhì)嵌入磷脂微囊：
(1)準(zhǔn)備酶溶液300μl，其中酶蛋白含量為2mg/ml；將所述酶溶液置于-60℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融5次，每次凍融后均用勻漿機(jī)高速勻漿處理；
(2)往酶溶液中加膽酸鈉溶液至終濃度為0.5％，過程中控制溫度28℃；
(3)加入s1制備得到的磷脂微粒，使酶蛋白和磷脂的質(zhì)量比為1:40；
(4)在冰上孵育30分鐘；向孵育后的溶液中加入10.0％海藻酸鈉與6.0％二硫蘇糖醇混合溶液，最終使海藻酸鈉的質(zhì)量百分濃度為3％，二硫蘇糖醇的質(zhì)量百分濃度為2％，顛倒混勻后再置于冰上進(jìn)行二次孵育50min，二次孵育期間每隔10min混勻一次；
(5)在冰上透析4小時(shí)，透析過程中透析袋的透過分子量為14000，透析液體積為酶溶液體積的100倍，透析過程中不斷攪拌；透析液為ph為7.3、濃度為100mm的hepes-koh緩沖液；
(6)用200倍體積的緩沖液繼續(xù)過夜透析，中間更換一次透析液；其中，透析過程中透析袋的透過分子量為14000；
(7)用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡檢查微囊的大小為1.1微米；
(8)除菌，4℃密封保存。
以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭示的方法范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的方法及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。