背景技術(shù)：

1、治療性抗體廣泛用于治療嚴(yán)重疾病。它們中的大多數(shù)會(huì)改變免疫細(xì)胞并在免疫突觸內(nèi)發(fā)揮作用；引導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞間相互作用。盡管產(chǎn)生并評(píng)估了許多抗體設(shè)計(jì)，但缺乏用于系統(tǒng)抗體表征和功能預(yù)測(cè)的高通量工具。

2、免疫突觸的形成是由t細(xì)胞與其對(duì)應(yīng)的抗原呈遞細(xì)胞(apc)的相互作用誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的第一事件。這種快速形成的細(xì)胞-細(xì)胞界面是通過由t細(xì)胞受體(tcr)識(shí)別負(fù)載肽的mhc復(fù)合物而啟動(dòng)的。它涉及細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白絲的重排以及向新生突觸募集信號(hào)傳導(dǎo)、共刺激、共抑制和粘附分子[1,2]。該過程對(duì)于觸發(fā)和微調(diào)t細(xì)胞應(yīng)答并確保完整的免疫反應(yīng)是至關(guān)重要的。已經(jīng)在若干種免疫相關(guān)病癥中觀察到功能失調(diào)的免疫突觸形成[3-8]，并且因此已經(jīng)被認(rèn)為是通過調(diào)節(jié)其組裝或功能來刺激或抑制免疫應(yīng)答的潛在靶標(biāo)[9-11]。例如，開發(fā)了各種改變免疫突觸形成以治療癌癥和自身免疫性疾病的治療性抗體[12-15]。盡管近年來已經(jīng)在開發(fā)免疫突觸靶向劑方面取得了重大進(jìn)展[9]，但仍需要進(jìn)一步完善化合物，特別是提高其功效。已經(jīng)鑒定到，抗體大小和形式[16,17]、劑量以及靶標(biāo)表達(dá)[18]可能是免疫突觸形成及其對(duì)t細(xì)胞功能的影響的關(guān)鍵參數(shù)。

3、然而，目前尚未報(bào)道用于系統(tǒng)地定量和表征免疫突觸形態(tài)、研究其與t細(xì)胞應(yīng)答的相關(guān)性或鑒定在體外預(yù)測(cè)抗體功效的特性的方法。

4、為此目的進(jìn)行高通量數(shù)據(jù)采集的關(guān)鍵技術(shù)是成像流式細(xì)胞術(shù)(ifc)，從而將傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的益處與單細(xì)胞水平上的深度多通道成像相結(jié)合。ifc最近已經(jīng)成功應(yīng)用于可視化和定量原代人t:apc細(xì)胞綴合物的免疫突觸[19-21]，然而，這些研究都沒有調(diào)查在t細(xì)胞功能背景下免疫突觸的形成。

5、最近的研究已經(jīng)證明了機(jī)器學(xué)習(xí)算法在對(duì)高通量成像數(shù)據(jù)進(jìn)行更穩(wěn)健且準(zhǔn)確的分析方面的潛力，這種方法已經(jīng)被證明可克服常規(guī)門控策略的局限性[22-24]。利用機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)行ifc數(shù)據(jù)分析還使得能夠鑒定細(xì)胞中的形態(tài)模式、對(duì)rna和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組合分析并且實(shí)施預(yù)測(cè)模型[22-26]。雖然為ifc數(shù)據(jù)分析設(shè)計(jì)的有限開源軟件實(shí)施方案是可用的[26,27]，但它們要么依賴于額外的軟件，增加了分析流水線的復(fù)雜性，要么只關(guān)注預(yù)測(cè)性能而缺乏可解釋性。

6、免疫突觸先前已經(jīng)通過人工apc系統(tǒng)使用對(duì)人類細(xì)胞系和原代細(xì)胞的高含量細(xì)胞成像進(jìn)行研究，所述系統(tǒng)利用板結(jié)合的icam-1和刺激性抗體[37]。盡管german等人通過對(duì)免疫突觸進(jìn)行譜分析令人信服地證明了他們的流水線的能力，但是他們沒有研究是否可以使用這些譜來預(yù)測(cè)藥物有效性[37]。在其他研究中，還研究了突觸形成在car?t細(xì)胞療法方面的潛力，其中研究人員使用染色的平均強(qiáng)度(諸如每個(gè)細(xì)胞的f-肌動(dòng)蛋白和p-cd3ζ)、腫瘤抗原的聚類和含穿孔素顆粒的極化作為突觸形成質(zhì)量的量度。這些特征在不同的car?t細(xì)胞之間有所不同，并與其體外和體內(nèi)有效性以及臨床結(jié)果相關(guān)[39,40]。

7、m.chen等人公開，肝素結(jié)合egf樣生長因子獨(dú)立于表皮生長因子受體調(diào)節(jié)cd4+t細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的雙向激活(am.j.resp.crit.care,2018,meetingabstracts.a5826)。

8、b.h.hosseini等人公開，免疫突觸形成確定了通過原子力顯微鏡測(cè)得的t細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞之間的相互作用力(proc.natl.acad.sci?usa?106(2009)17852-17857)。

9、f.ahmed等人公開，數(shù)字在使用成像流式細(xì)胞術(shù)對(duì)免疫突觸形成的定量和動(dòng)態(tài)分析中很重要(j.immunol.meth.347(2009)79-86)。

10、g.wabnitz等人公開，人白細(xì)胞的流入顯微鏡是用于對(duì)免疫突觸中的肌動(dòng)蛋白重排進(jìn)行定量分析的工具(j.immunol.meth.423(2015)29-39)。

11、us2021/270812公開了用于分析免疫細(xì)胞的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文報(bào)道了一種用于使用單細(xì)胞成像流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞混合物中的細(xì)胞進(jìn)行分類的方法。

2、本文進(jìn)一步報(bào)道了一種用于使用單細(xì)胞成像流式細(xì)胞術(shù)與人工智能的組合(scifai)對(duì)細(xì)胞混合物中的細(xì)胞進(jìn)行分類以對(duì)成像流式細(xì)胞術(shù)(ifc)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理、特征工程和可說明的預(yù)測(cè)性機(jī)器學(xué)習(xí)的方法。圖40中呈現(xiàn)了算法流程圖。

3、利用根據(jù)本發(fā)明的方法，可以分析不同免疫刺激下的類別頻率以及形態(tài)變化。通過分析跨多個(gè)供體和治療性抗體的t細(xì)胞因子產(chǎn)生，已經(jīng)證明了根據(jù)本發(fā)明的方法的適用性。已經(jīng)在體外定量地預(yù)測(cè)這些特性，從而將形態(tài)特征與功能聯(lián)系起來，并顯示出顯著影響抗體設(shè)計(jì)的潛力。

4、根據(jù)本發(fā)明的方法普遍適用于ifc數(shù)據(jù)，并且考慮到其模塊化架構(gòu)，可以直接并入到現(xiàn)有的工作流程和分析流水線中，例如用于快速抗體篩選和功能表征。

5、因此，本發(fā)明涵蓋以下實(shí)施例：

6、1.一種用于對(duì)細(xì)胞混合物中的細(xì)胞進(jìn)行分類的方法，其中所述混合物包含t細(xì)胞和活化的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，所述方法包括以下步驟：

7、a)將至少與f-肌動(dòng)蛋白、mhcii和cd3結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體施加于所述細(xì)胞混合物，以獲得經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物，其中所述抗體各自用染料進(jìn)行標(biāo)記，其中所述染料具有不同的(任選地不重疊的)發(fā)射波長，

8、b)獲取所述細(xì)胞混合物的至少一個(gè)圖像，以及

9、c)將所述細(xì)胞混合物中的所述細(xì)胞分類為

10、i)分離的細(xì)胞，如果所述細(xì)胞為單一細(xì)胞，呈f-肌動(dòng)蛋白陽性，并且

11、-呈mhcii陽性且cd3陰性，或

12、-呈mhcii陰性且cd3陽性，

13、ii)細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述細(xì)胞為兩個(gè)或三個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的聚集體，呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性且cd3陽性。

14、1a.一種用于對(duì)細(xì)胞混合物中的細(xì)胞進(jìn)行分類的方法，其中所述混合物包含t細(xì)胞和活化的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，所述方法包括以下步驟：

15、a)將至少與f-肌動(dòng)蛋白、mhcii和cd3結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體施加于所述細(xì)胞混合物，以獲得經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物，其中所述抗體各自用染料進(jìn)行標(biāo)記，其中所述染料具有不同的(任選地不重疊的)發(fā)射波長，

16、b)獲取所述細(xì)胞混合物的至少一個(gè)圖像，以及

17、c)將所述圖像分類如下：

18、所述圖像包含

19、i)分離的細(xì)胞，如果所述圖像中的所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性，并且

20、-呈mhcii陽性且cd3陰性，或

21、-呈mhcii陰性且cd3陽性，

22、ii)細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述圖像中的所述細(xì)胞是兩個(gè)或三個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的聚集體，并且所述聚集體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性且cd3陽性。

23、2.根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，其中

24、步驟a)是：將至少與f-肌動(dòng)蛋白、mhcii、cd3和p-cd3ζ結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體施加于所述細(xì)胞混合物，其中所述抗體各自用染料進(jìn)行標(biāo)記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

25、并且步驟c)是：將所述細(xì)胞混合物中的所述細(xì)胞分類為

26、i)單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性，

27、ii)無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

28、iii)有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性，

29、iv)形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

30、v)形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體或多聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

31、2a.根據(jù)實(shí)施例1a所述的方法，其中

32、步驟a)是：將至少與f-肌動(dòng)蛋白、mhcii、cd3和p-cd3ζ結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體施加于所述細(xì)胞混合物，其中所述抗體各自用染料進(jìn)行標(biāo)記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

33、并且步驟c)是：將所述圖像分類如下：

34、所述圖像包含

35、i)單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，如果所述圖像中的所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性，

36、ii)無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述圖像中的所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

37、iii)有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述圖像中的所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性，

38、iv)形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，如果所述圖像中的所述細(xì)胞雙聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

39、v)形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述圖像中的所述細(xì)胞雙聯(lián)體或細(xì)胞多聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

40、3.根據(jù)實(shí)施例1至2a中任一項(xiàng)所述的方法，其中

41、步驟b)是：使用成像流式細(xì)胞儀獲取所述細(xì)胞混合物的圖像。

42、4.根據(jù)實(shí)施例1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所獲取的圖像為各自示出單一細(xì)胞或分離的雙聯(lián)體或多聯(lián)體的圖像。

43、5.一種用于對(duì)細(xì)胞混合物中的細(xì)胞進(jìn)行分類的方法，其中所述混合物包含t細(xì)胞和活化的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，所述方法包括以下步驟：

44、a)獲取所述細(xì)胞混合物的至少一個(gè)圖像，

45、b)生成特征提取流水線以從所述至少一個(gè)圖像中得出生物學(xué)上可解釋的特征，

46、c)基于所得出的生物學(xué)上可解釋的特征預(yù)測(cè)所述細(xì)胞屬于以下類別之一

47、i)單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，

48、ii)無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，

49、iii)有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，

50、iv)形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，

51、v)形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體。

52、5a.一種用于對(duì)細(xì)胞混合物中的細(xì)胞進(jìn)行分類的方法，其中所述混合物包含t細(xì)胞和活化的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，所述方法包括以下步驟：

53、a)獲取所述細(xì)胞混合物的至少一個(gè)圖像，

54、b)生成特征提取流水線以從所述至少一個(gè)圖像中得出生物學(xué)上可解釋的特征，

55、c)基于所得出的生物學(xué)上可解釋的特征預(yù)測(cè)所述圖像中的所述細(xì)胞為

56、i)單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，

57、ii)無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，

58、iii)有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，

59、iv)形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，

60、v)形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體。

61、6.根據(jù)實(shí)施例1至5a中任一項(xiàng)所述的方法，其中基于形態(tài)、標(biāo)記強(qiáng)度、標(biāo)記的共定位、紋理和突觸特征，(所述圖像中的)所述細(xì)胞雙聯(lián)體和多聯(lián)體被分類為突觸。

62、7.根據(jù)實(shí)施例1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中基于以下一個(gè)或多個(gè)另外的特征，(所述圖像中的)所述細(xì)胞雙聯(lián)體和多聯(lián)體被分類為突觸：

63、-cd3和mhcii標(biāo)記的共定位，和/或

64、-mhcii和p-cd3ζ標(biāo)記的共定位，和/或

65、-mhcii的紋理，和/或

66、-cd3標(biāo)記的紋理，和/或

67、-p-cd3ζ標(biāo)記的強(qiáng)度。

68、8.根據(jù)實(shí)施例1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中基于突觸區(qū)域中的標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度與整個(gè)細(xì)胞的比率來確定每個(gè)細(xì)胞或雙聯(lián)體或多聯(lián)體或圖像的特征。

69、9.根據(jù)實(shí)施例1至4和6至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物是通過固定所述細(xì)胞、能透過所述細(xì)胞并施加所述經(jīng)標(biāo)記的抗體而獲得的細(xì)胞內(nèi)經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物。

70、9a.根據(jù)實(shí)施例1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括以下步驟d)：

71、d)對(duì)每個(gè)類別中的細(xì)胞或細(xì)胞圖像的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算每個(gè)類別中的所述細(xì)胞在所述細(xì)胞混合物中的相對(duì)頻率。

72、10.根據(jù)實(shí)施例1至9a中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)之前去除死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞(超過三個(gè)細(xì)胞的聚集體)，或者其中不記錄死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞(超過三個(gè)細(xì)胞的聚集體)的圖像，或者其中在步驟c)之前去除死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞的圖像以及未聚焦的圖像，或者其中在步驟c)中不分析死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞的圖像以及未聚焦的圖像，或者其中在步驟d)中不對(duì)死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞的圖像以及未聚焦的圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)。

73、11.根據(jù)實(shí)施例1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)包括以下另外的子步驟：

74、b-1)對(duì)焦點(diǎn)內(nèi)的活+cd3+mhcii+細(xì)胞進(jìn)行門控，

75、b-2)使用面積和縱橫比特征從在步驟b-1)中獲得的群體中選擇示出單一cd3+t細(xì)胞和單一mhcii+b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的圖像，

76、b-3)確定突觸掩模內(nèi)經(jīng)標(biāo)記的cd3的信號(hào)強(qiáng)度(突觸掩模定義為形態(tài)cd3和mhcii掩模的組合，其中擴(kuò)張率為3)并對(duì)掩模中示出cd3信號(hào)的突觸進(jìn)行門控，以及

77、b-4)通過使用明場(chǎng)(bf)的高度和面積特征排除一層中的t細(xì)胞和b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞(的圖像)。

78、12.根據(jù)實(shí)施例5至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括以下步驟c)：

79、c)基于xgboost分類器根據(jù)所得出的生物學(xué)上可解釋的特征構(gòu)建模型，并基于模型預(yù)測(cè)細(xì)胞或圖像屬于以下類別之一

80、i)單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，

81、ii)無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，

82、iii)有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，

83、iv)形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，

84、v)形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體。

85、13.根據(jù)實(shí)施例1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述混合物包含細(xì)胞比率為約4:3的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞。

86、14.根據(jù)實(shí)施例1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述t細(xì)胞為cd4陽性記憶t細(xì)胞或cd8陽性t細(xì)胞或其混合物。

87、15.根據(jù)實(shí)施例1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述t細(xì)胞為cd4陽性記憶t細(xì)胞。

88、16.根據(jù)實(shí)施例1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中在混合之后將所述細(xì)胞混合物離心。

89、17.根據(jù)實(shí)施例1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)進(jìn)一步包括使用源自經(jīng)染色的單一細(xì)胞的補(bǔ)償矩陣來補(bǔ)償所述圖像。

90、18.一種用于對(duì)細(xì)胞混合物中的細(xì)胞進(jìn)行分類的方法，其中所述混合物包含t細(xì)胞和活化的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，所述方法包括以下步驟：

91、a)通過以下制備經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物：

92、a-1)將所述細(xì)胞混合物等分成至少兩個(gè)等分試樣，

93、a-2)向所述混合物的第一等分試樣施加與所述混合物的一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞上存在的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面靶標(biāo)結(jié)合的抗體，并且向所述混合物的第二等分試樣施加抗體，所述抗體與施加于所述第一等分試樣的抗體具有相同的結(jié)構(gòu)，但不與所述混合物的一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞上存在的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面靶標(biāo)結(jié)合，

94、a-3)溫育在步驟a-2)中獲得的等分試樣，

95、a-4)將至少與f-肌動(dòng)蛋白、mhcii和cd3結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體施加于在步驟a-3)中獲得的所述細(xì)胞混合物的經(jīng)溫育的等分試樣，以獲得經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物，其中所述抗體各自用染料進(jìn)行標(biāo)記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

96、b)獲取所述經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物的每個(gè)等分試樣的至少一個(gè)圖像，以及

97、c)分別對(duì)所述細(xì)胞混合物的每個(gè)等分試樣中的細(xì)胞圖像進(jìn)行分類，以包含

98、i)分離的細(xì)胞，如果所述圖像包含的細(xì)胞為單一細(xì)胞，呈f-肌動(dòng)蛋白陽性，并且

99、-呈mhcii陽性且cd3陰性，或

100、-呈mhcii陰性且cd3陽性，

101、ii)細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述圖像包含的細(xì)胞是兩個(gè)或三個(gè)細(xì)胞的聚集體，呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性且cd3陽性。

102、d)對(duì)于每個(gè)等分試樣，對(duì)每個(gè)類別中的細(xì)胞圖像的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算每個(gè)類別中的所述細(xì)胞在所述細(xì)胞混合物中的相對(duì)頻率，以及

103、e)確定所述第一等分試樣與所述第二等分試樣之間的類別頻率差異。

104、19.根據(jù)實(shí)施例18所述的方法，其中

105、步驟a-4)是：將至少與f-肌動(dòng)蛋白、mhcii、cd3和p-cd3ζ結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體施加于所述細(xì)胞混合物的所述經(jīng)溫育的等分試樣，其中所述抗體各自用染料進(jìn)行標(biāo)記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

106、并且步驟c)是：將所述細(xì)胞混合物中的所述細(xì)胞分類為

107、i)單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性，

108、ii)無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

109、iii)有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性，

110、iv)形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

111、v)形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體或多聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

112、19a.根據(jù)實(shí)施例18所述的方法，其中

113、步驟a-4)是：將至少與f-肌動(dòng)蛋白、mhcii、cd3和p-cd3ζ結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體施加于所述細(xì)胞混合物的所述經(jīng)溫育的等分試樣，其中所述抗體各自用染料進(jìn)行標(biāo)記，其中所述染料具有不同的(不重疊的)發(fā)射波長，

114、并且步驟c)是：將所述圖像分類如下：

115、所述圖像包含

116、i)單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，如果所述圖像中的所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性，

117、ii)無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述圖像中的所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

118、iii)有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述圖像中的所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性，

119、iv)形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，如果所述圖像中的所述雙聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性，

120、v)形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述圖像中的所述雙聯(lián)體或多聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

121、20.根據(jù)實(shí)施例18至19a中任一項(xiàng)所述的方法，其中

122、步驟b)是：使用成像流式細(xì)胞儀獲取所述細(xì)胞混合物的圖像。

123、21.根據(jù)實(shí)施例18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所獲取的圖像為各自示出單一細(xì)胞或分離的雙聯(lián)體或多聯(lián)體的圖像。

124、22.根據(jù)實(shí)施例18至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中基于形態(tài)、標(biāo)記強(qiáng)度、標(biāo)記的共定位、紋理和突觸特征，所述細(xì)胞雙聯(lián)體和多聯(lián)體或其圖像被分類為突觸。

125、23.根據(jù)實(shí)施例18至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中基于以下一個(gè)或多個(gè)另外的特征，所述圖像中的所述細(xì)胞雙聯(lián)體和多聯(lián)體被分類為突觸：

126、-cd3和mhcii標(biāo)記的共定位，和/或

127、-mhcii和p-cd3ζ標(biāo)記的共定位，和/或

128、-mhcii的紋理，和/或

129、-cd3標(biāo)記的紋理，和/或

130、-p-cd3ζ標(biāo)記的強(qiáng)度。

131、24.根據(jù)實(shí)施例18至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中基于突觸區(qū)域中的標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度與整個(gè)細(xì)胞的比率來確定每個(gè)細(xì)胞或雙聯(lián)體或多聯(lián)體或圖像的特征。

132、25.根據(jù)實(shí)施例18至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物是通過固定所述細(xì)胞、能透過所述細(xì)胞并施加所述經(jīng)標(biāo)記的抗體而獲得的細(xì)胞內(nèi)經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞混合物。

133、26.根據(jù)實(shí)施例18至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)之前去除死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞(超過三個(gè)細(xì)胞的聚集體)，或者其中不記錄死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞(超過三個(gè)細(xì)胞的聚集體)的圖像，或者其中在步驟c)之前去除死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞的圖像以及未聚焦的圖像，或者其中在步驟c)中不分析死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞的圖像以及未聚焦的圖像，或者其中在步驟d)中不對(duì)死細(xì)胞、變形細(xì)胞或裁剪細(xì)胞的圖像以及未聚焦的圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)。

134、27.根據(jù)實(shí)施例18至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)包括以下另外的子步驟：

135、b-1)對(duì)焦點(diǎn)內(nèi)的活+cd3+mhcii+細(xì)胞進(jìn)行門控，

136、b-2)使用面積和縱橫比特征從在步驟b-1)中獲得的群體中選擇示出單一cd3+t細(xì)胞和單一mhcii+b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的圖像，

137、b-3)確定突觸掩模內(nèi)經(jīng)標(biāo)記的cd3的信號(hào)強(qiáng)度(突觸掩模定義為形態(tài)cd3和mhcii掩模的組合，其中擴(kuò)張率為3)并對(duì)掩模中示出cd3信號(hào)的突觸進(jìn)行門控，以及

138、b-4)通過使用明場(chǎng)(bf)的高度和面積特征排除一層中的t細(xì)胞和b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞。

139、28.根據(jù)實(shí)施例18至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述混合物包含細(xì)胞比率為約4:3的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞。

140、29.根據(jù)實(shí)施例18至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述t細(xì)胞為cd4陽性記憶t細(xì)胞或cd8陽性t細(xì)胞或其混合物。

141、30.根據(jù)實(shí)施例18至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述t細(xì)胞為cd4陽性記憶t細(xì)胞。

142、31.根據(jù)實(shí)施例18至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中在混合之后將所述細(xì)胞混合物離心。

143、32.根據(jù)實(shí)施例18至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)進(jìn)一步包括使用源自經(jīng)染色的單一細(xì)胞的補(bǔ)償矩陣來補(bǔ)償所述圖像。

144、33.一種對(duì)大量抗體中的抗體進(jìn)行排序的方法，所述方法包括以下步驟：

145、1)單獨(dú)對(duì)所述大量抗體中的每種抗體執(zhí)行根據(jù)實(shí)施例18至31中任一項(xiàng)所述的方法，或者對(duì)所有抗體一起執(zhí)行所述方法，其中每種抗體被施加于所述混合物的單獨(dú)等分試樣，

146、2)基于以下類別中的一個(gè)或多個(gè)類別(的圖像)的頻率變化對(duì)所述抗體進(jìn)行排序：

147、i)單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，

148、ii)無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，

149、iii)有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，

150、iv)形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，以及

151、v)形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體。

152、34.根據(jù)實(shí)施例33所述的方法，其中對(duì)所述大量抗體中的所述抗體進(jìn)行排序是按免疫應(yīng)答刺激降低而定的。

153、35.根據(jù)實(shí)施例33至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)所述大量抗體中的所述抗體進(jìn)行排序是通過降低被分類為形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體的細(xì)胞或圖像的頻率來進(jìn)行的。

154、36.根據(jù)實(shí)施例33至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)所述大量抗體中的所述抗體進(jìn)行排序是通過進(jìn)一步降低突觸區(qū)域中的經(jīng)標(biāo)記的f-肌動(dòng)蛋白、經(jīng)標(biāo)記的p-cd3ζ和經(jīng)標(biāo)記的mhcii的信號(hào)強(qiáng)度來進(jìn)行的。

155、37.根據(jù)實(shí)施例33所述的方法，其中對(duì)所述大量抗體中的所述抗體進(jìn)行排序是按免疫應(yīng)答抑制降低而定的。

156、38.根據(jù)實(shí)施例33和37中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)所述大量抗體中的所述抗體進(jìn)行排序是通過降低被分類為形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體的細(xì)胞或圖像的頻率進(jìn)行的。

157、39.根據(jù)實(shí)施例33和37至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)所述大量抗體中的所述抗體進(jìn)行排序是通過進(jìn)一步增加被分類為無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞的細(xì)胞或圖像的頻率來進(jìn)行的。

158、40.根據(jù)實(shí)施例33和37至39中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)所述大量抗體中的所述抗體進(jìn)行排序是通過進(jìn)一步降低被分類為有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞的細(xì)胞或圖像的頻率來進(jìn)行的。

159、41.根據(jù)實(shí)施例33和37至40中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)所述大量抗體中的所述抗體進(jìn)行排序是通過進(jìn)一步增加經(jīng)標(biāo)記的f-肌動(dòng)蛋白的平均信號(hào)強(qiáng)度的頻率、通過增加突觸區(qū)域內(nèi)的經(jīng)標(biāo)記的p-cd3ζ的強(qiáng)度的信號(hào)并通過使t細(xì)胞受體的信號(hào)解聚類來進(jìn)行的。

160、42.根據(jù)實(shí)施例1至41中任一項(xiàng)所述的方法用于表征在t細(xì)胞與b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞之間形成的突觸的形態(tài)的用途。

161、43.根據(jù)實(shí)施例33至41中任一項(xiàng)所述的方法用于確定抗體濃度與t細(xì)胞應(yīng)答之間的相關(guān)性的用途。

162、44.根據(jù)實(shí)施例33至41中任一項(xiàng)所述的方法用于預(yù)測(cè)抗體的治療模式的用途。

163、45.根據(jù)實(shí)施例33至41中任一項(xiàng)所述的方法用于預(yù)測(cè)抗體的功效的用途。

164、46.f-肌動(dòng)蛋白、mhcii和cd3用于對(duì)包含t細(xì)胞和b細(xì)胞或活化的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的混合物中的t細(xì)胞進(jìn)行分類的用途。

165、47.f-肌動(dòng)蛋白、mhcii和cd3用于對(duì)包含t細(xì)胞和b細(xì)胞或活化的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的混合物中的b細(xì)胞進(jìn)行分類的用途。

166、48.根據(jù)實(shí)施例46至47中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述圖像包含或所述細(xì)胞被分類為分離的細(xì)胞，即，所述細(xì)胞的分類在于所述細(xì)胞為分離的細(xì)胞，如果所述細(xì)胞為單一細(xì)胞，呈f-肌動(dòng)蛋白陽性，并且

167、-呈mhcii陽性且cd3陰性，或

168、-呈mhcii陰性且cd3陽性。

169、49.根據(jù)實(shí)施例46至47中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述圖像包含或所述細(xì)胞被分類為細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，即，所述細(xì)胞的分類為所述細(xì)胞為細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述細(xì)胞為兩個(gè)或三個(gè)細(xì)胞的聚集體，呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性且cd3陽性。

170、50.根據(jù)實(shí)施例46至49中任一項(xiàng)所述的用途，其進(jìn)一步包括p-cd3ζ。

171、51.根據(jù)實(shí)施例46至50中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述圖像包含或所述細(xì)胞被分類為單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，即，所述細(xì)胞的分類為所述細(xì)胞為單一b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陰性且p-cd3ζ陰性。

172、52.根據(jù)實(shí)施例46至51中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述圖像包含或所述細(xì)胞被分類為無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，即，所述細(xì)胞的分類為所述細(xì)胞為無信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性。

173、53.根據(jù)實(shí)施例46至52中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述圖像包含或所述細(xì)胞被分類為有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，即，所述細(xì)胞的分類為所述細(xì)胞為有信號(hào)傳導(dǎo)的單一t細(xì)胞，如果所述細(xì)胞呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陰性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

174、54.根據(jù)實(shí)施例46至53中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述圖像包含或所述細(xì)胞被分類為形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與t細(xì)胞的雙聯(lián)體，即，所述細(xì)胞的分類為所述細(xì)胞為形成無信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和t細(xì)胞的雙聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陰性。

175、55.根據(jù)實(shí)施例46至54中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述圖像包含或所述細(xì)胞被分類為形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，即，所述細(xì)胞的分類為所述細(xì)胞為形成有信號(hào)傳導(dǎo)的突觸的一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)t細(xì)胞的雙聯(lián)體或多聯(lián)體，如果所述雙聯(lián)體或多聯(lián)體呈f-肌動(dòng)蛋白陽性、mhcii陽性、cd3陽性且p-cd3ζ陽性。

176、56.根據(jù)實(shí)施例1至55中任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述多聯(lián)體為兩種b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和一種t細(xì)胞的多聯(lián)體。

177、57.根據(jù)實(shí)施例1至55中任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述多聯(lián)體為一種b細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞和兩種t細(xì)胞的多聯(lián)體。

178、除了所描繪和要求保護(hù)的各種實(shí)施例之外，所公開的主題還涉及具有本文所公開和要求保護(hù)的特征的其他組合的其他實(shí)施例。這樣，本文所呈現(xiàn)的具體特征可以在所公開的主題的范圍內(nèi)以其他方式彼此組合，使得所公開的主題包括本文所公開的特征的任何合適的組合。出于圖示和描述的目的，已經(jīng)呈現(xiàn)了所公開主題的具體實(shí)施例的前文描述。其并不旨在窮舉或?qū)⑺_的主題限制為所公開的那些實(shí)施例。