本發(fā)明涉及分析檢測(cè)，尤其涉及一種同時(shí)測(cè)定尿液中多種揮發(fā)性有機(jī)物代謝物的方法。

背景技術(shù)：

1、揮發(fā)性有機(jī)物（voc）在環(huán)境中無(wú)處不在，人類可以通過(guò)吸入、攝入和皮膚接觸等途徑接觸揮發(fā)性有機(jī)物。長(zhǎng)期接觸某些揮發(fā)性有機(jī)物可能會(huì)增加罹患白血病、膀胱癌、先天缺陷和神經(jīng)認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)。揮發(fā)性有機(jī)物通過(guò)呼吸道、皮膚等進(jìn)入人體后，一部分進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生代謝反應(yīng)，例如揮發(fā)性有機(jī)物和/或其代謝物會(huì)與谷胱甘肽發(fā)生反應(yīng)，并進(jìn)一步代謝形成巰基酸，這些代謝物隨后由腎臟從血液中清除，并隨尿液排出體外。

2、通過(guò)檢測(cè)尿液中揮發(fā)性有機(jī)物的代謝物，可以反映外界環(huán)境對(duì)體內(nèi)代謝情況的影響，同時(shí)可為測(cè)量呼出氣體或血液中的揮發(fā)性有機(jī)物提供補(bǔ)充數(shù)據(jù)。

3、相關(guān)技術(shù)中公布了檢測(cè)尿液中揮發(fā)性有機(jī)物代謝物的方法，其中樣品的前處理過(guò)程繁瑣，需要加入水解酶對(duì)尿液樣品進(jìn)行酶解，并且目前的檢測(cè)方法存在基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)的缺點(diǎn)，靈敏度和準(zhǔn)確性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種同時(shí)測(cè)定尿液中多種揮發(fā)性有機(jī)物代謝物的方法。本發(fā)明提供的方法樣品前處理簡(jiǎn)單，無(wú)需添加水解酶，且基質(zhì)效應(yīng)小，靈敏度和準(zhǔn)確性高。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、一種同時(shí)測(cè)定尿液中多種揮發(fā)性有機(jī)物代謝物的方法，包括以下步驟：

4、將尿液樣品、同位素內(nèi)標(biāo)和鹽酸溶液混合，將所得混合液進(jìn)行固相萃取，得到凈化液；將所述凈化液進(jìn)行稀釋，得到待測(cè)液；

5、將所述待測(cè)液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)尿液中的揮發(fā)性有機(jī)物代謝物進(jìn)行定性和定量；

6、所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的高效液相色譜條件包括：流動(dòng)相為流動(dòng)相a和流動(dòng)相b，所述流動(dòng)相a為甲酸水溶液，所述流動(dòng)相b為甲醇；洗脫方式為梯度洗脫，所述梯度洗脫的程序?yàn)椋?~5?min，流動(dòng)相b的體積百分含量由0勻速變化至1%，5~7.5?min，流動(dòng)相b的體積百分含量由1%勻速變化至15%，7.5~11?min，流動(dòng)相b的體積百分含量由15%勻速變化至90%，11~11.1?min，流動(dòng)相b的體積百分含量由90%勻速變換至100%，11.1~13?min，流動(dòng)相b的體積百分含量由100%勻速變化至1%；

7、所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的質(zhì)譜條件包括：離子源為esi離子源；離子源溫度為500~600℃；掃描模式為負(fù)電離；檢測(cè)方式為多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)；

8、所述揮發(fā)性有機(jī)物代謝物包括n-乙?；?s-(2-氨基甲酰基乙基)-l-半胱氨酸、n-乙酰基-s-(2-羥乙基)-l-半胱氨酸、n-乙?；?s-(3,4-二羥基丁基)-l-半胱氨酸、n-乙酰基-s-(n-甲基氨基甲?；?-l-半胱氨酸、n-乙酰基-s-(2-氰基乙基)-l-半胱氨酸、n-乙?；?s-(3-羥丙基)-l-半胱氨酸、n-乙?；?s-(2-羧乙基)-l-半胱氨酸、n-乙?；?s-(2-羥丙基)-l-半胱氨酸、苯乙醛酸、反,反-黏糠酸、扁桃酸、2-甲基馬尿酸、3-甲基馬尿酸、4-甲基馬尿酸、苯巰基尿酸和n-乙?；?s-(芐基)-l-半胱氨酸。

9、優(yōu)選的，所述甲酸水溶液中甲酸的體積百分含量為0.05~0.15%。

10、優(yōu)選的，所述高效液相色譜條件還包括：色譜柱為waters?acquity?uplc?hss?t3，柱溫為為35~40℃，進(jìn)樣量為5~10?μl，流動(dòng)相的流速為0.2~0.4?ml/min。

11、優(yōu)選的，所述質(zhì)譜條件還包括：碰撞氣為medium，氣簾氣為30~35?psi；霧化氣為40~50?psi；加熱氣為40~50?psi；噴霧電壓為-3500~-4000?v；入口電壓為-8~-10?v；碰撞室射出電壓為-10~-15?v。

12、優(yōu)選的，固相萃取采用的填料為結(jié)合有非電離的羥基基團(tuán)的水可濕性聚苯乙烯-二乙烯基苯；所述固相萃取采用固相萃取板進(jìn)行；所述固相萃取板為96孔固相萃取板；所述固相萃取采用的洗脫劑為甲醇。

13、優(yōu)選的，所述固相萃取包括：將所述固相萃取板依次進(jìn)行甲醇活化和純水平衡，然后將所述混合液轉(zhuǎn)移至平衡后的固相萃取板中，施加壓力使混合液通過(guò)固相萃取填料，之后依次進(jìn)行純水淋洗和甲醇洗脫。

14、優(yōu)選的，所述鹽酸溶液的質(zhì)量濃度為36~38%；所述尿液樣品和鹽酸溶液的體積比為50:2~50:5。

15、優(yōu)選的，所述稀釋采用的稀釋劑為純水，所述凈化液和純水的體積比為1:3~1:5。

16、優(yōu)選的，所述同位素內(nèi)標(biāo)為混合同位素內(nèi)標(biāo)，所述混合同位素內(nèi)標(biāo)中的內(nèi)標(biāo)物包括n-乙?；?s-(2-氨基甲?；一?-l-半胱氨酸-d3、n-乙?；?s-(2-羥乙基)-l-半胱氨酸-d4、n-乙酰基-s-(3,4-二羥基丁基)-l-半胱氨酸-d7、n-乙酰基-s-(n-甲基氨基甲?；?-l-半胱氨酸-d3、n-乙?；?s-(2-氰基乙基)-l-半胱氨酸-d3、n-乙?；?s-(3-羥丙基)-l-半胱氨酸-d6、n-乙酰基-s-(2-羧乙基)-l-半胱氨酸-d3、n-乙酰基-s-(2-羥丙基)-l-半胱氨酸-d3、苯乙醛酸-d5、反,反-黏糠酸-d4、扁桃酸-d5、2-甲基馬尿酸-d7、3-甲基馬尿酸-d7、4-甲基馬尿酸-d7、n-乙?；?s-(苯基)-l-半胱氨酸-d2和n-乙?；?s-(芐基)-l-半胱氨酸-d3。

17、優(yōu)選的，所述定量的方法為：根據(jù)檢測(cè)所得色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間和質(zhì)譜特征進(jìn)行定性；

18、所述定量的方法為：根據(jù)檢測(cè)所得色譜圖中色譜峰的峰面積以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿液中揮發(fā)性有機(jī)物代謝物的含量；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為目標(biāo)物與對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積之比，橫坐標(biāo)為目標(biāo)物與對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度之比。

19、本發(fā)明提供了一種同時(shí)測(cè)定尿液中多種揮發(fā)性有機(jī)物代謝物的方法，本發(fā)明將尿液樣品、同位素內(nèi)標(biāo)和鹽酸溶液混合，將所得混合液進(jìn)行固相萃取，得到凈化液；將所述凈化液進(jìn)行稀釋，得到待測(cè)液；將所述待測(cè)液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)尿液中的揮發(fā)性有機(jī)物代謝物進(jìn)行定性和定量。本發(fā)明通過(guò)固相萃取的方法對(duì)尿液樣品進(jìn)行凈化，并且在尿液樣品中添加鹽酸以增強(qiáng)樣品在固相萃取填料上的保留性，從而提高凈化效果；本發(fā)明采用固相萃取的方法，能夠在萃取目標(biāo)物的同時(shí)有效祛除樣品中的干擾物質(zhì)，且溶劑用量少，基質(zhì)效應(yīng)??；本發(fā)明在樣品前處理時(shí)無(wú)需添加水解酶，操作簡(jiǎn)單，大幅減少樣品前處理所需的時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。進(jìn)一步的，本發(fā)明采用96孔固相萃取板，能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化高通量測(cè)定。實(shí)施例結(jié)果表明，本發(fā)明提供的方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，能夠滿足非職業(yè)暴露人群內(nèi)暴露監(jiān)測(cè)需求。

技術(shù)特征：

1.一種同時(shí)測(cè)定尿液中多種揮發(fā)性有機(jī)物代謝物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲酸水溶液中甲酸的體積百分含量為0.05~0.15%。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色譜條件還包括：色譜柱為waters?acquity?uplc??hss?t3，柱溫為35~40℃，進(jìn)樣量為5~10?μl，流動(dòng)相的流速為0.2~0.4?ml/min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜條件還包括：碰撞氣為medium，氣簾氣為30~35?psi；霧化氣為40~50?psi；加熱氣為40~50?psi；噴霧電壓為-3500~-4000?v；入口電壓為-8~-10?v；碰撞室射出電壓為-10~-15?v。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相萃取采用的填料為結(jié)合有非電離的羥基基團(tuán)的可濕性聚苯乙烯-二乙烯基苯；所述固相萃取采用固相萃取板進(jìn)行；所述固相萃取板為96孔固相萃取板；所述固相萃取采用的洗脫劑為甲醇。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述固相萃取包括：將所述固相萃取板依次進(jìn)行甲醇活化和純水平衡，然后將所述混合液轉(zhuǎn)移至平衡后的固相萃取板中，施加壓力使混合液通過(guò)固相萃取填料，之后依次進(jìn)行純水淋洗和甲醇洗脫。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鹽酸溶液的質(zhì)量濃度為36~38%；所述尿液樣品和鹽酸溶液的體積比為50:2~50:5。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀釋采用的稀釋劑為純水，所述凈化液和純水的體積比為1:3~1:5。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述同位素內(nèi)標(biāo)為混合同位素內(nèi)標(biāo)，所述混合同位素內(nèi)標(biāo)中的內(nèi)標(biāo)物包括n-乙酰基-s-(2-氨基甲?；一?-l-半胱氨酸-d3、n-乙?；?s-(2-羥乙基)-l-半胱氨酸-d4、n-乙?；?s-(3,4-二羥基丁基)-l-半胱氨酸-d7、n-乙酰基-s-(n-甲基氨基甲?；?-l-半胱氨酸-d3、n-乙?；?s-(2-氰基乙基)-l-半胱氨酸-d3、n-乙?；?s-(3-羥丙基)-l-半胱氨酸-d6、n-乙酰基-s-(2-羧乙基)-l-半胱氨酸-d3、n-乙酰基-s-(2-羥丙基)-l-半胱氨酸-d3、苯乙醛酸-d5、反,反-黏糠酸-d4、扁桃酸-d5、2-甲基馬尿酸-d7、3-甲基馬尿酸-d7、4-甲基馬尿酸-d7、n-乙?；?s-(苯基)-l-半胱氨酸-d2和n-乙?；?s-(芐基)-l-半胱氨酸-d3。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述定量的方法為：根據(jù)檢測(cè)所得色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間和質(zhì)譜特征進(jìn)行定性；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種同時(shí)測(cè)定尿液中多種揮發(fā)性有機(jī)物代謝物的方法。本發(fā)明通過(guò)固相萃取的方法對(duì)尿液樣品進(jìn)行凈化，并且在尿液樣品中添加鹽酸以增強(qiáng)其在固相萃取填料上的保留性，從而提高凈化效果，在萃取目標(biāo)物的同時(shí)有效祛除樣品中的干擾物質(zhì)，并且溶劑用量少，基質(zhì)效應(yīng)??；本發(fā)明在樣品前處理時(shí)無(wú)需添加水解酶，操作簡(jiǎn)單，大幅減少樣品前處理所需的時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。實(shí)施例結(jié)果表明，本發(fā)明提供的方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，能夠滿足非職業(yè)暴露人群內(nèi)暴露監(jiān)測(cè)需求。

技術(shù)研發(fā)人員：施小明,邱天,陸一夫,呂躍斌,朱英,趙峰,丁昌明,曲英莉,張海婧,孫琦,鮑珊,李亞偉,蔡嘉旖,宋皓璨,俞曉紅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15