本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感，具體涉及一種基于探針鏈置換反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器。

背景技術(shù)：

1、幽門(mén)螺桿菌感染（hp）是一種寄生在胃黏膜上的螺旋狀細(xì)菌，其在全球范圍內(nèi)的感染率約為50%。該病原體通過(guò)分泌尿素酶、空泡毒素等致病因子，已被證實(shí)與慢性胃炎、消化性潰瘍，甚至胃癌密切相關(guān)，因此已將其列為ⅰ類致癌物。

2、現(xiàn)行hp診斷體系主要存在雙重技術(shù)瓶頸：其一為侵入性檢測(cè)方法，包括組織病理學(xué)檢查、快速尿素酶試驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)及pcr檢測(cè)，均需依賴胃鏡獲取活體組織樣本，存在操作創(chuàng)傷性且受限于內(nèi)鏡資源分配；其二為非侵入性方法如c13/c14尿素呼氣試驗(yàn)和糞便抗原檢測(cè)，雖規(guī)避了侵入性風(fēng)險(xiǎn)，卻易受質(zhì)子泵抑制劑、抗生素等藥物的干擾影響。值得注意的是，即便被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”的胃黏膜培養(yǎng)法，亦面臨培養(yǎng)周期長(zhǎng)（3~7天）、技術(shù)要求嚴(yán)苛等現(xiàn)實(shí)困境。因此急需建立一種快速、靈敏的hp檢測(cè)方法。

3、電化學(xué)生物傳感器一種將生物識(shí)別元件與電化學(xué)轉(zhuǎn)換元件結(jié)合在一起的裝置，用于檢測(cè)特定生物分子或化學(xué)物質(zhì)，作為一種兼具生物、化學(xué)、電學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、高靈敏度和低檢測(cè)限等優(yōu)點(diǎn)。

4、鏈置換反應(yīng)本質(zhì)上是一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，其基于堿基位移的分支遷移機(jī)制，形成新的雙鏈復(fù)合體和核酸單鏈，整個(gè)反應(yīng)主要由吉布斯自由能變調(diào)控，具有高特異性，因此在生物體核酸的特異性檢測(cè)得到了廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)以上亟需兼具簡(jiǎn)便性、快速性和高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)，本發(fā)明旨在提出一種基于探針鏈置換的電化學(xué)生物傳感器，依據(jù)toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)機(jī)制，靶標(biāo)核酸與檢測(cè)探針通過(guò)不同的toehold結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)雙向可逆置換反應(yīng)。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、s1、將核孔膜浸于1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（edc）、n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）水溶液中1~4小時(shí)，使孔道內(nèi)的羧基充分活化。

4、s2、將核孔膜浸入帶有氨基基團(tuán)的捕獲探針溶液中，通過(guò)羧基與氨基縮合反應(yīng)形成酰胺官能團(tuán)，使捕獲探針固定在核孔膜的孔道中，然后使用牛血清白蛋白（bsa）對(duì)孔道內(nèi)的剩余活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉，防止非特異性結(jié)合。

5、s3、檢測(cè)探針經(jīng)過(guò)修飾連接上導(dǎo)電材料后，與處理后的核孔膜進(jìn)行孵育，用蒸餾水洗滌去過(guò)量探針及雜質(zhì)，放入h型電解池的中央，ag/agcl為參比電極，測(cè)量初始電流。

6、s4、將檢測(cè)探針結(jié)合后的核孔膜孵育在含有靶標(biāo)核酸的溶液中，經(jīng)洗滌后，放入h型電解池的中央，ag/agcl為參比電極，測(cè)量電流。

7、進(jìn)一步的，所述步驟s1中，核孔膜原材料通常采用聚碳酸酯（pc）、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯（pet）或聚丙烯（pp），浸潤(rùn)在edc濃度控制在10~15mg/ml，nhs的濃度控制在1~5mg/ml。

8、進(jìn)一步的，所述步驟s2中，捕獲探針溶液的濃度為5~10μmol/l，孵育時(shí)間為2~4小時(shí)。

9、進(jìn)一步的，所述步驟s3中，導(dǎo)電材料可以選擇無(wú)機(jī)分子金、銀、鎘納米粒子，及有機(jī)分子二茂鐵、亞甲藍(lán)以及硫瑾，其修飾方式根據(jù)不同的材料可選擇化學(xué)共價(jià)鍵和、物理吸附和自組裝法，所述與核孔膜孵育時(shí)間為10~15分鐘。

10、進(jìn)一步的，所述步驟s4中，測(cè)量電流后可將核孔膜取下浸入修飾后的檢測(cè)探針溶液中，經(jīng)洗滌后測(cè)量電流，可以作為下一個(gè)樣本的初始電流，再加入另一靶標(biāo)核酸后測(cè)量電流，如次反復(fù)通過(guò)雙向可逆置換，可實(shí)現(xiàn)多批次樣本的連續(xù)測(cè)量。

技術(shù)特征：

1.一種基于探針鏈置換反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于探針鏈置換反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，捕獲探針的5’末端帶有氨基基團(tuán)修飾，與核孔膜內(nèi)的羧基以酰胺鍵共價(jià)方式連接。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于探針鏈置換反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，所述的檢測(cè)探針位于近5’端經(jīng)導(dǎo)電材料修飾，修飾方式包括但不限于化學(xué)共價(jià)鍵法、物理吸附法和自組裝法，導(dǎo)電材料包括但不限于金、二茂鐵和亞甲藍(lán)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于探針鏈置換反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，所述可逆置換，具體表現(xiàn)為：

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述基于探針鏈置換反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器在幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于，捕獲探針和檢測(cè)探針核苷酸序列依次如seq?id?no.1和seqid?no.2所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于探針鏈置換反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器。所述傳感器通過(guò)在核孔膜中固定捕獲探針，并與檢測(cè)探針特異性結(jié)合，當(dāng)靶標(biāo)核酸存在時(shí)，基于Toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)原理，靶標(biāo)核酸置換檢測(cè)探針，引發(fā)電極阻抗變化實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。特別地，通過(guò)設(shè)計(jì)雙Toehold結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)核酸與檢測(cè)探針間可逆置換。本發(fā)明的電化學(xué)生物傳感器簡(jiǎn)便、快速、特異性高，為構(gòu)建高靈敏、可重復(fù)使用的電化學(xué)生物傳感平臺(tái)提供了新思路。

技術(shù)研發(fā)人員：劉強(qiáng),王東旭,范文紅,師鈺博,張瑜,閻爾坤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津市協(xié)和化學(xué)發(fā)光診斷試劑有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15