本發(fā)明涉及一種疏水磁珠、混合磁珠及其制備方法和應(yīng)用、蛋白檢測方法。

背景技術(shù)：

1、1994年，澳大利亞科學(xué)家威爾金斯和威廉姆斯提出蛋白組學(xué)概念。蛋白組學(xué)是從整體角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，進(jìn)而了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動規(guī)律的一個新的研究領(lǐng)域。

2、蛋白質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵步驟是蛋白質(zhì)材料的最佳提取和處理，以確保下游檢測的最高靈敏度。實現(xiàn)這一目標(biāo)需要一種新的樣品處理技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)表現(xiàn)出無偏見的蛋白質(zhì)操作、試劑使用的靈活性，以及幾乎無損的處理過程。

3、而當(dāng)前階段，生物樣本蛋白質(zhì)組學(xué)研究的處理技術(shù)仍然存在諸多不足：

4、1）多步提取及復(fù)提方法：采用多種緩沖液進(jìn)行大豆等植物種子蛋白初提和復(fù)提，并結(jié)合一維電泳預(yù)分離，可有效提高蛋白鑒定率，然而此方法處理步驟較繁瑣，且存在膠內(nèi)酶切過程中分子量大和疏水性強(qiáng)的肽段抽提難、酶解肽段回收率低的問題。

5、2）熱變性方法：研究發(fā)現(xiàn)大豆種子蛋白樣品經(jīng)過熱變性處理后，蛋白質(zhì)更容易被酶解。除熱變性方法外，化學(xué)變性法也是廣泛使用的樣品處理方法。十二烷基硫酸鈉（sds）是用于細(xì)胞、組織變性和增溶的首選試劑，但sds在溶液中很難被完全去除，對后續(xù)酶切、色譜分離和質(zhì)譜分析有明顯影響。

6、3）tca/丙酮沉淀法：也是常用的蛋白提取方法，操作簡單，還可以很好地去除酚類、色素和脂類，但無法去除蛋白提取物中的多糖和醌類。同時，丙酮試劑屬于易制毒試劑，難以獲取。

7、針對如上技術(shù)缺陷，一種基于順磁珠的sp3（single-pot?solid-phase-enhancedsample?preparation）技術(shù)被用于快速、穩(wěn)健和有效地處理蛋白質(zhì)組學(xué)分析，實現(xiàn)蛋白質(zhì)無偏提取。sp3技術(shù)利用親水性相互作用機(jī)制，在下游蛋白質(zhì)組學(xué)分析之前，交換或去除通常用于促進(jìn)細(xì)胞或組織裂解、蛋白質(zhì)增溶和酶消化的成分。sp3技術(shù)包括非選擇性蛋白質(zhì)結(jié)合和沖洗步驟，這些步驟通過使用乙醇驅(qū)動的溶劑化捕獲親水磁珠表面，并在水條件下洗脫純化的物質(zhì)。與其他方法相比，sp3技術(shù)結(jié)合了與大量溶液添加劑的兼容性，以及與輸入量無關(guān)的幾乎無損和無偏的蛋白質(zhì)恢復(fù)，所有步驟在一個管中即可完成，設(shè)備和流程簡單，用時短，速度快，效率高。

8、如上，sp3技術(shù)以其無偏、高效的蛋白質(zhì)提取能力廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但現(xiàn)有順磁珠種類有限，難以適配多樣化樣本（如植物、微生物和復(fù)雜組織），尤其在親水性和疏水性樣本處理方面存在不足。以大豆為代表的植物樣本中，高含量的多糖和次生代謝產(chǎn)物（如醌類化合物）可能對磁珠結(jié)合效率產(chǎn)生負(fù)面影響，降低目標(biāo)蛋白回收率。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中廣泛使用的順磁珠多為進(jìn)口產(chǎn)品，成本高昂，且在復(fù)雜樣本中的適配性和性能穩(wěn)定性欠佳，導(dǎo)致實驗結(jié)果的重復(fù)性和可靠性受限。

9、因此，亟需一種蛋白結(jié)合效率高、適配性強(qiáng)、性能穩(wěn)定且成本低廉的磁珠。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有sp3技術(shù)中所存在的如上技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種疏水磁珠、混合磁珠及其制備方法和應(yīng)用、蛋白檢測方法。本發(fā)明制備而得的疏水磁珠具備高蛋白結(jié)合率及高穩(wěn)定性；進(jìn)一步和親水磁珠混合使用后，可展示出協(xié)同作用，實現(xiàn)復(fù)雜生物樣本中蛋白質(zhì)的無偏提取，具備更強(qiáng)的適配性及更低的成本。

2、為實現(xiàn)如上目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案。

3、本發(fā)明提供了一種制備疏水磁珠的方法，所述方法包括如下步驟：

4、s1、對磁珠表面進(jìn)行羥基修飾得羥基磁珠；

5、s2、對所述羥基磁珠表面進(jìn)行雙鍵修飾得雙鍵磁珠；

6、s3、對所述雙鍵磁珠表面進(jìn)行羧基修飾得疏水磁珠；

7、其中，所述羧基修飾包括如下步驟：所述雙鍵磁珠、巰基羧酸、引發(fā)劑和溶劑的混合溶液經(jīng)自由基加成反應(yīng)，即得。

8、本發(fā)明利用雙鍵磁珠表面的雙鍵基團(tuán)和巰基羧酸發(fā)生自由基加成反應(yīng)（即點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)），從而于磁珠表面以形成共價鍵（c-s鍵和c-c鍵）的方式連接羧基；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該方式具備更高的羧基修飾密度的同時，形成的c-s鍵和c-c鍵具備明顯更優(yōu)的化學(xué)穩(wěn)定性，不易在復(fù)雜環(huán)境中水解或脫落；在此基礎(chǔ)上，基于所得疏水磁珠表面的疏水特性，可進(jìn)一步減少磁珠在水相中的團(tuán)聚現(xiàn)象，提高其分散穩(wěn)定性；整體而言，本發(fā)明如上修飾方式較常規(guī)的開環(huán)反應(yīng)修飾羧基所形成的酯鍵或硫醚鍵更穩(wěn)定。

9、在一些實施方案中，步驟s3中，所述雙鍵磁珠、巰基羧酸和引發(fā)劑的質(zhì)量比為(2-6):(0.28-0.36):(8-16)，例如4:0.32:12、3:0.28:8、6:0.36:16或5:0.34:14。

10、在一些實施方案中，步驟s3中，所述巰基羧酸包括4-巰基苯甲酸和/或巰基乙酸。

11、在一些實施方案中，步驟s3中，所述引發(fā)劑包括2,2-偶氮二異丁腈、過氧化二苯甲酰（bpo）和過硫酸銨中的一種或多種。

12、在一些實施方案中，步驟s3中，所述雙鍵磁珠和溶劑的用量比為(2-6)g:(960-1440)ml，例如4g:1200ml、3g:960ml、6g:1440ml或5g:1320ml。

13、在一些實施方案中，步驟s3中，所述溶劑包括極性非質(zhì)子溶劑，較佳地包括n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、二甲基乙酰胺（dmac）、二甲基亞砜（dmso）和乙腈中的一種或多種。

14、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s3中，所述雙鍵磁珠、巰基羧酸和引發(fā)劑的質(zhì)量比為(2-6):(0.28-0.36):(8-16)；所述巰基羧酸為4-巰基苯甲酸；所述引發(fā)劑為2,2-偶氮二異丁腈；所述雙鍵磁珠和溶劑的用量比為(2-6)g:(960-1440)ml；所述溶劑為n,n-二甲基甲酰胺。

15、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s3中，所述雙鍵磁珠、巰基羧酸和引發(fā)劑的質(zhì)量比為(2-6):(0.28-0.36):(8-16)；所述巰基羧酸為巰基乙酸；所述引發(fā)劑為過氧化二苯甲酰；所述雙鍵磁珠和溶劑的用量比為(2-6)g:(960-1440)ml；所述溶劑為二甲基乙酰胺。

16、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s3中，所述雙鍵磁珠、巰基羧酸和引發(fā)劑的質(zhì)量比為(2-6):(0.28-0.36):(8-16)；所述巰基羧酸為4-巰基苯甲酸；所述引發(fā)劑為過硫酸銨；所述雙鍵磁珠和溶劑的用量比為(2-6)g:(960-1440)ml；所述溶劑為二甲基亞砜。

17、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s3中，所述雙鍵磁珠、巰基羧酸和引發(fā)劑的質(zhì)量比為(2-6):(0.28-0.36):(8-16)；所述巰基羧酸為巰基乙酸；所述引發(fā)劑為2,2-偶氮二異丁腈；所述雙鍵磁珠和溶劑的用量比為(2-6)g:(960-1440)ml；所述溶劑為乙腈。

18、在一些實施方案中，步驟s3中，所述反應(yīng)的溫度為60-90℃，例如70℃或80℃。

19、在一些實施方案中，步驟s3中，所述反應(yīng)的時間為3-10h，例如6h或8h。

20、在一些實施方案中，步驟s3中，所述反應(yīng)在油浴條件下進(jìn)行。

21、在一些實施方案中，步驟s3中，所述混合溶液的制備包括：先將所述雙鍵磁珠和部分所述溶劑混合，再加入所述巰基羧酸和剩余所述溶劑，最后加入所述引發(fā)劑。

22、在一些實施方案中，步驟s3中，所述羧基修飾后還包括以所述溶劑洗滌的步驟。

23、在一些實施方案中，步驟s1中，所述磁珠的制備包括如下步驟：聚乙二醇4000、三價鐵鹽和溶劑a的混合溶液a經(jīng)水熱反應(yīng)制得；所述溶劑a包括乙二醇。

24、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述三價鐵鹽為氯化鐵。

25、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述聚乙二醇4000和三價鐵鹽的質(zhì)量比為(15-23):(20-26)，例如18.52:23.21、15:21、23:26或20:24。

26、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述聚乙二醇4000和溶劑a的用量比為(15-23)g:(400-800)ml，例如18.52g:600ml、15g:400ml、23g:800ml或20g:700ml。

27、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述混合溶液a中還包括乙酸鈉；所述聚乙二醇、三價鐵鹽和乙酸鈉的質(zhì)量比為(15-23):(20-26):(50-60)，例如18.52:23.21:54.08、15:21:50、23:26:60或20:24:56。

28、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述水熱反應(yīng)的溫度為180-270℃，例如200℃、260℃或220℃。

29、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述水熱反應(yīng)的時間為10-15h，例如12h或13h。

30、在一些實施方案中，步驟s1中，所述羥基修飾包括如下步驟：所述磁珠、氨水、羥基化試劑和溶劑b的混合溶液b反應(yīng)，即得；所述溶劑b包括水和/或乙醇。

31、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述羥基化試劑包括正硅酸乙酯。

32、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述磁珠、氨水和羥基化試劑的用量比為(2-6)g:(20-30)ml:(8-16)ml，例如4g:25ml:12ml、3g:20ml:10ml、6g:30ml:14ml或5g:25ml:13ml。

33、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述磁珠和溶劑b的用量比為(2-6)g:(990-1520)ml，例如4g:1200ml、3g:990ml、6g:1510ml或5g:1380ml。

34、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述反應(yīng)的溫度為40-60℃，例如50℃或55℃。

35、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述反應(yīng)的時間為12-20h，例如16h或18h。

36、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述混合溶液b的制備包括先將所述磁珠和部分所述溶劑b混合，再加入所述氨水，最后加入所述羥基化試劑和剩余所述溶劑b。

37、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s1中，所述羥基修飾后還包括以水洗滌的步驟。

38、在一些實施方案中，步驟s2中，所述雙鍵修飾包括如下步驟：所述羥基磁珠、氨水、硅烷試劑和溶劑c的混合溶液反應(yīng)，即得；所述溶劑c包括乙醇。

39、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s2中，所述硅烷試劑包括乙烯基三乙氧基硅烷。

40、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s2中，所述羥基磁珠、氨水和硅烷試劑的用量比為(2-6)g:(20-40)ml:(25-40)ml，例如4g:25ml:30ml、3g:20ml:20ml、6g:40ml:40ml或5g:25ml:35ml。

41、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s2中，所述羥基磁珠和溶劑c的用量比為(2-6)g:(880-1720)ml，例如4g:1300ml、3g:880ml、6g:1360ml或5g:1240ml。

42、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s2中，所述反應(yīng)的溫度為20-25℃。

43、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s2中，所述反應(yīng)的時間為12-20h，例如16h或18h。

44、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s2中，所述混合溶液的制備包括先將所述羥基磁珠和部分所述溶劑混合，再加入所述硅烷試劑和剩余所述溶劑，最后加入所述氨水。

45、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟s2中，所述雙鍵修飾后還包括以所述溶劑洗滌的步驟。

46、本發(fā)明還提供了一種疏水磁珠，其由如前所述的方法制得。

47、本發(fā)明還提供了一種制備混合磁珠的方法，其包括將親水磁珠和疏水磁珠混合的步驟；所述疏水磁珠的制備如前所定義。

48、本發(fā)明中，所述親水磁珠可為本領(lǐng)域常規(guī)操作步驟制得的、表面修飾有羧基的親水磁珠。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，生物樣本中蛋白質(zhì)的親疏水特性差異較大，單一類型磁珠難以同時高效回收親水性和疏水性蛋白，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)丟失，特別是處于極端親水或疏水特性區(qū)間的蛋白質(zhì)；即使可通過采用含不同類型磁珠的混合磁珠改善該情況，但也會存在互相影響蛋白質(zhì)結(jié)合的情況；其次，尤其在低濃度樣本或稀釋蛋白質(zhì)溶液中，親水、疏水磁珠對目標(biāo)蛋白的回收效率不穩(wěn)定，也可能導(dǎo)致特定蛋白的檢測漏失。而本發(fā)明采用如前的疏水磁珠時，基于其自身的穩(wěn)定性及修飾密度，可進(jìn)一步改善蛋白質(zhì)結(jié)合以及漏失的情況。

49、在一些實施方案中，所述疏水磁珠和親水磁珠的質(zhì)量比為(0.5-3):1，較佳地為(1-3):1，更佳地為1:1。

50、在一些實施方案中，所述親水磁珠的制備方法包括如下步驟：

51、（1）、對磁珠表面進(jìn)行羥基修飾得羥基磁珠；

52、（2）、對所述羥基磁珠表面進(jìn)行氨基修飾得氨基磁珠；

53、（3）、對所述氨基磁珠表面進(jìn)行羧基修飾得親水磁珠。

54、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟（1）同前所定義的步驟s1。

55、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟（2）中，所述氨基修飾包括如下步驟：所述羥基磁珠、氨水、氨基化試劑和溶劑的混合溶液反應(yīng)，即得；所述溶劑包括乙醇。

56、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（2）中，所述氨基化試劑包括γ-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes）。

57、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（2）中，所述羥基磁珠、氨水和氨基化試劑的用量比為(2-6)g:(20-40)ml:(20-40)ml，例如4g:25ml:30ml、3g:20ml:20ml、6g:40ml:40ml或5g:25ml:35ml。

58、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（2）中，所述反應(yīng)的溫度為室溫（20-25℃）。

59、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（2）中，所述反應(yīng)的時間為12-24h，例如16h或18h。

60、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（2）中，所述混合溶液的制備包括先將所述羥基磁珠和部分所述溶劑混合，再加入所述氨水，最后加入所述氨基化試劑和剩余所述溶劑。

61、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（2）中，所述氨基修飾后還包括以水洗滌的步驟。

62、在一些優(yōu)選實施方案中，步驟（3）中，所述羧基修飾包括如下步驟：所述氨基磁珠、羧基化試劑和溶劑的混合溶液反應(yīng)，即得；所述溶劑包括乙醇。

63、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（3）中，所述羧基化試劑為戊二酸酐。

64、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（3）中，所述氨基磁珠和羧基化試劑的質(zhì)量比為(2-6):(2-6)，例如4:4。

65、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（3）中，所述反應(yīng)的溫度為40-60℃，例如50℃或55℃。

66、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（3）中，所述反應(yīng)的時間為12-20h，例如16h或18h。

67、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（3）中，所述混合溶液的制備包括先將所述氨基磁珠和所述溶劑混合，再加入所述羧基化試劑。

68、在一些更優(yōu)選實施方案中，步驟（3）中，所述羧基修飾后還包括以水洗滌的步驟。

69、本發(fā)明還提供了一種混合磁珠，其由如前所述的方法制得。

70、本發(fā)明還提供了一種蛋白檢測方法，其選自如下兩種方式：

71、方式一、如前所述的疏水磁珠與待測生物樣本孵育、除鹽、酶解洗脫后，以質(zhì)譜測定即得；

72、方式二、如前所述的混合磁珠與待測生物樣本孵育、除鹽、酶解洗脫后，以質(zhì)譜測定即得。

73、在一些優(yōu)選實施方案中，所述待測生物樣本通過液氮研磨或裂解液處理而得。

74、在一些優(yōu)選實施方案中，所述待測生物樣本的來源包括植物組織、動物組織和細(xì)胞中的一種或多種，較佳地包括大豆組織、擬南芥組織、煙草組織、玉米組織、兔小腸組織和hela細(xì)胞中的一種或多種。

75、在一些優(yōu)選實施方案中，所述待測生物樣本與疏水磁珠的質(zhì)量比為(8-15):1，例如10:1；或者，所述待測生物樣本與混合磁珠的質(zhì)量比為(8-15):1，例如10:1。

76、在一些實施方案中，所述蛋白檢測方法為非疾病診斷目的的。

77、本發(fā)明還提供了一種如前所述的疏水磁珠或如前所述的混合磁珠在蛋白檢測中的應(yīng)用。

78、在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

79、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

80、本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

81、本發(fā)明經(jīng)修飾羥基、修飾雙鍵以及進(jìn)一步經(jīng)自由基加成反應(yīng)修飾羧基后制得疏水磁珠，所得疏水磁珠具備高蛋白結(jié)合率及高穩(wěn)定性（化學(xué)穩(wěn)定性及分散穩(wěn)定性）；進(jìn)一步和親水磁珠混合使用后，可展示出協(xié)同作用，實現(xiàn)不同生物樣本（尤其是復(fù)雜生物樣本）中蛋白質(zhì)的無偏提取及快速提取，具備更強(qiáng)的適配性，且蛋白提取數(shù)較進(jìn)口磁珠處理、過濾輔助樣品制備（如超濾管處理）等明顯更高。