專利名稱：一種肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌是誘發(fā)細(xì)菌性肺炎、腦膜炎、胸膜炎、心內(nèi)膜炎、中耳炎的重要病原菌，是發(fā)展中國(guó)家兒童細(xì)菌性肺炎最常見(jiàn)的病因。全球每年死于肺炎球菌感染者有100-200萬(wàn)。中國(guó)肺炎發(fā)病率一直很高，近50年來(lái)，肺炎球菌感染者中菌血癥死亡率一直徘徊在25-29％之間。此外肺炎也是導(dǎo)致60歲以上老人死亡的主要原因之一。由于肺炎鏈球菌耐藥菌株高達(dá)96％以上，目前已成為世界性的公共問(wèn)題。
1983年美國(guó)成功研制出23價(jià)多糖疫苗，但該疫苗在2歲以下嬰幼兒中誘導(dǎo)的保護(hù)性低，無(wú)免疫記憶反應(yīng)。以化學(xué)方法將蛋白載體共價(jià)結(jié)合到肺炎鏈球菌莢膜多糖上，制備成肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗，將多糖由T細(xì)胞非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原。接種多糖-蛋白結(jié)合疫苗后，可使2歲以下嬰幼兒產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而獲得免疫保護(hù)。初步的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗在嬰幼兒中的安全性和免疫原性良好，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗多糖抗體高于多糖疫苗，并可誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng)，所以肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的研制具有重要的社會(huì)意義和價(jià)值。
多糖結(jié)合疫苗中的游離多糖含量超過(guò)規(guī)定的限度會(huì)對(duì)疫苗臨床使用的效果產(chǎn)生不利的影響，因此多糖蛋白結(jié)合物中游離多糖含量測(cè)定是多糖結(jié)合疫苗質(zhì)量控制中的關(guān)鍵指標(biāo)之一，也是反映結(jié)合疫苗質(zhì)量的優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一。
因?yàn)椴煌?xì)菌莢膜多糖以及不同多糖結(jié)合物性質(zhì)差異較大，所以多糖結(jié)合疫苗中的游離多糖測(cè)定是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，目前尚無(wú)多糖結(jié)合物中游離多糖含量測(cè)定的通用方法。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法進(jìn)行細(xì)菌多糖結(jié)合物中游離多糖測(cè)定，一種采用高效凝膠過(guò)濾，一種采用高效陰離子交換色譜。高效凝膠過(guò)濾法基于分子大小差異來(lái)區(qū)分結(jié)合多糖與游離多糖，易受到分子大小相近雜質(zhì)的影響，測(cè)定結(jié)果誤差較大；高效陰離子交換色譜基于分子帶電荷性質(zhì)的差異而區(qū)分結(jié)合多糖與游離多糖，也易受到與多糖帶電荷性質(zhì)相似的雜質(zhì)的影響，此外肺炎鏈球菌多糖在紫外區(qū)域沒(méi)有強(qiáng)的光吸收，無(wú)法在配置紫外檢測(cè)器的高效液相系統(tǒng)上測(cè)定肺炎鏈球菌多糖結(jié)合物的游離多糖含量。目前尚無(wú)利用乙醇沉淀法、超濾法、蒽酮法測(cè)定肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖含量的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有方法無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物游離多糖含量的不足，該方法可以準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單地測(cè)定肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖的含量。
本發(fā)明的技術(shù)方案及步驟(1)取待測(cè)肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物為樣1；待測(cè)肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3；(2)另取肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中；向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃70～90小時(shí)；于5℃、4500～6500rpm離心60～90分鐘，棄上清液；(3)向每離心管加入0.75ml 0～60％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入相同乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、4500～6500rpm離心40～60分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液；(4)將結(jié)合物上清液用3～100kD超濾杯超濾，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；將對(duì)應(yīng)衍生物上清液用3～100K超濾杯超濾，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4；(5)用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；(6)根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率應(yīng)在80-120％；(7)根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，式中P為回收率。
其中的肺炎鏈球菌可以為以下任一種1型、2型、3型、4型、5型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型、33F型；所用的超濾杯截留分子量可以為5～50kD。
本發(fā)明的有益效果是利用肺炎鏈球菌莢膜多糖與肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物在乙醇、強(qiáng)電解質(zhì)存在條件下結(jié)合多糖與游離多糖的不同沉降特性，將游離多糖與結(jié)合多糖分離，然后通過(guò)超濾杯超濾去除干擾蒽酮法測(cè)定的鹽和乙醇，然后通過(guò)蒽酮法測(cè)定各樣品的多糖濃度，進(jìn)而計(jì)算出游離多糖的百分含量。本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確測(cè)定肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖含量的方法，從而評(píng)價(jià)制品質(zhì)量。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取肺炎鏈球菌1型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌1型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌1型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌1型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃70小時(shí)；于5℃、4500rpm離心60分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml注射用水(即含乙醇0％)，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后加入注射用水2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、4500rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用3kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用3kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝29.37μg/ml，A2＝5.54μg/ml，A3＝36.53μg/ml，A4＝53.03μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為96.78％。
根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌1型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為12.99％。
實(shí)施例2取肺炎鏈球菌2型莢膜多糖結(jié)合物為樣1，取待測(cè)肺炎鏈球菌2型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌2型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌2型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃90小時(shí)；于5℃、6500rpm離心90分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 60％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入60％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、6500rpm離心60分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用100kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用100kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4。A1＝18.54μg/ml，A2＝4.92μg/ml，A3＝27.62μg/ml，A4＝40.82μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為98.53％。
根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌2型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為17.95％。
實(shí)施例3取肺炎鏈球菌3型莢膜多糖結(jié)合物為樣1，取待測(cè)肺炎鏈球菌3型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌3型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌3型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃90小時(shí)；于5℃、5500rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 40％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入40％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5500rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用5kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用5kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4。A1＝28.35μg/ml，A2＝5.78μg/ml，A3＝26.72μg/ml，A4＝40.21μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為100.32％。
根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌3型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為13.55％。
實(shí)施例4取肺炎鏈球菌4型莢膜多糖結(jié)合物為樣1，取待測(cè)肺炎鏈球菌4型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌4型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌4型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃90小時(shí)；于5℃、6500rpm離心90分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 60％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入60％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、6500rpm離心60分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4。A1＝18.89μg/ml，A2＝5.05μg/ml，A3＝28.62μg/ml，A4＝41.41μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率P
P=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為96.46％。
根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌4型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為18.48％。
實(shí)施例5取肺炎鏈球菌5型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌5型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌5型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌5型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃80小時(shí)；于5℃、5500rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 45％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入45％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5500rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝32.37μg/ml，A2＝7.54μg/ml，A3＝24.53μg/ml，A4＝37.03μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為100.64％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌5型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為15.43％。
實(shí)施例6取肺炎鏈球菌6B型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌6B型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌6B型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌6B型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃85小時(shí)；于5℃、5000rpm離心60分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用30kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用30kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝42.26μg/ml，A2＝11.42μg/ml，A3＝26.53μg/ml，A4＝38.73μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，計(jì)算回收率為97.32％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌6B型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為18.51％。
實(shí)施例7取肺炎鏈球菌7F型莢膜多糖結(jié)合物為樣1，取待測(cè)肺炎鏈球菌7F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌7F型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌7F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃90小時(shí)；于5℃、6500rpm離心90分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 45％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入45％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、6500rpm離心60分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4。A1＝21.89μg/ml，A2＝7.36μg/ml，A3＝28.12μg/ml，A4＝41.25μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為97.80％。
根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌7F型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為22.92％。
實(shí)施例8取肺炎鏈球菌8型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌8型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌8型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌8型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃80小時(shí)；于5℃、5500rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 55％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入55％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5500rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝30.57μg/ml，A2＝6.54μg/ml，A3＝26.53μg/ml，A4＝39.03μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為98.08％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌8型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為14.54％。
實(shí)施例9
取肺炎鏈球菌9N型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌9N型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌9N型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌9N型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃85小時(shí)；于5℃、5000rpm離心60分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用30kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用30kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝40.26μg/ml，A2＝9.42μg/ml，A3＝25.53μg/ml，A4＝37.23μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，計(jì)算回收率為97.22％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌9N型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為16.04％。
實(shí)施例10取肺炎鏈球菌9V型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌9V型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌9V型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌9V型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃80小時(shí)；于5℃、5000rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝28.02μg/ml，A2＝2.47μg/ml，A3＝31.20μg/ml，A4＝46.08μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為98.5％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌9V型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為6.0％。
實(shí)施例11取肺炎鏈球菌10A型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌10A型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌10A型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌10A型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃80小時(shí)；于5℃、5500rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 55％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入55％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5500rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝32.57μg/ml，A2＝7.34μg/ml，A3＝28.53μg/ml，A4＝42.23μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為98.68％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量H
H=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌10A型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為15.23％。
實(shí)施例12取肺炎鏈球菌11A型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌11A型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌11A型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌11A型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃85小時(shí)；于5℃、5000rpm離心60分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用30kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用30kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝38.52μg/ml，A2＝6.42μg/ml，A3＝26.53μg/ml，A4＝38.76μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，計(jì)算回收率為97.40％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌11A型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為11.41％。
實(shí)施例13取肺炎鏈球菌12F型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌12F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌12F型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌12F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃80小時(shí)；于5℃、5000rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝29.52μg/ml，A2＝5.48μg/ml，A3＝32.20μg/ml，A4＝47.38μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為98.10％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌12F型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為12.62％。
實(shí)施例14取肺炎鏈球菌14型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌14型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌14型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌14型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃75小時(shí)；于5℃、5000rpm離心80分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 55％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入55％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝26.65μg/ml，A2＝5.62μg/ml，A3＝23.61μg/ml，A4＝34.33μg/ml
根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為96.94％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，計(jì)算出肺炎鏈球菌14型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為14.5％。
實(shí)施例15取肺炎鏈球菌15B型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌15B型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌15B型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌15B型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃80小時(shí)；于5℃、5000rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用50kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝28.52μg/ml，A2＝5.48μg/ml，.A3＝31.20μg/ml，A4＝46.38μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為99.10％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌15B型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為12.93％。
實(shí)施例16取肺炎鏈球菌17F型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌17F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌17F型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌17F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃75小時(shí)；于5℃、5000rpm離心80分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 55％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入55％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝27.35μg/ml，A2＝6.52μg/ml，A3＝24.61μg/ml，A4＝36.33μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為98.42％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，計(jì)算出肺炎鏈球菌17F型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為16.15％。
實(shí)施例17取肺炎鏈球菌18C型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌18C型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌18C型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌18C型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃80小時(shí)；于5℃、5000rpm離心60分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用30kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用30kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝28.65μg/ml，A2＝4.32μg/ml，A3＝30.42μg/ml，A4＝45.92μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為100.64％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，計(jì)算出肺炎鏈球菌18C型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為9.98％。
實(shí)施例18取肺炎鏈球菌19A型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌19A型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌19A型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌19A型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃80小時(shí)；于5℃、5500rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 45％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入45％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝24.85μg/ml，A2＝3.82μg/ml，A3＝32.42μg/ml，A4＝46.82μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為96.28％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，計(jì)算出肺炎鏈球菌19A型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為10.64％。
實(shí)施例19取肺炎鏈球菌19F型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌19F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌19F型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌19F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃70小時(shí)；于5℃、5000rpm離心60分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 60％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入60％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心40分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝31.65μg/ml，A2＝5.12μg/ml，A3＝28.62μg/ml，A4＝40.92μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為95.32％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌19F型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為11.31％。
實(shí)施例20取肺炎鏈球菌20型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌20型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌20型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌20型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃70小時(shí)；于5℃、5000rpm離心80分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 40％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入40％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用5kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用5kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝19.77μg/ml，A2＝2.54μg/ml，A3＝29.53μg/ml，A4＝41.03μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為92.6％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌20型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為9.2％。
實(shí)施例21取肺炎鏈球菌22F型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌22F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌22F型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌22F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃70小時(shí)；于5℃、5000rpm離心80分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用5kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用5kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝29.57μg/ml，A2＝6.24μg/ml，A3＝28.53μg/ml，A4＝42.03μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為98.21％；
根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌22F型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為14.32％。
實(shí)施例22取肺炎鏈球菌23F型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌23F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌23F型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌23F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃70小時(shí)；于5℃、5000rpm離心80分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml注射用水(含乙醇0％)，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入注射用水2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用5kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用5kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝31.71μg/ml，A2＝7.27μg/ml，A3＝27.36μg/ml，A4＝38.50μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為93.8％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌23F型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為16.3％。
實(shí)施例23取肺炎鏈球菌33F型莢膜多糖結(jié)合物為樣1；取待測(cè)肺炎鏈球菌33F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3。
另取肺炎鏈球菌33F型莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌33F型莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中。向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃75小時(shí)；于5℃、5000rpm離心70分鐘，棄上清液。
向每離心管中加入0.75ml 50％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入50％乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、5000rpm離心50分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液。
結(jié)合物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；對(duì)應(yīng)衍生物上清液用10kD超濾杯用注射用水超濾3次，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4。
用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；A1＝23.45μg/ml，A2＝4.31μg/ml，A3＝26.78μg/ml，A4＝39.69μg/ml根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率為98.8％；根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，肺炎鏈球菌33F型莢膜多糖結(jié)合物原液中游離多糖含量為12.4％.
權(quán)利要求
1.一種肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測(cè)定方法，其步驟是(1)取待測(cè)肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物為樣1；待測(cè)肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液為樣3；(2)另取肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物4.5ml，置于50ml離心管中；取肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物對(duì)應(yīng)的衍生物溶液4.5ml，置于另一50ml離心管中；向每離心管加入5mol/L氯化鈉溶液1.125ml，振蕩混勻，再加入無(wú)水乙醇22.5ml，振蕩混勻，置-20℃70～90小時(shí)；于5℃、4500～6500rpm離心60～90分鐘，棄上清液；(3)向每離心管加入0.75ml 0～60％乙醇溶液，振蕩混合，室溫靜置1小時(shí)；然后再加入相同乙醇溶液2.25ml，振蕩混合，室溫靜置2小時(shí)；于15℃、4500～6500rpm離心40～60分鐘，每離心管單獨(dú)收集上清液；(4)將結(jié)合物上清液用3～100kD超濾杯超濾，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣2；將對(duì)應(yīng)衍生物上清液用3～100K超濾杯超濾，收集超濾后液、超濾杯清洗液，并補(bǔ)加注射用水至3ml即為樣4；(5)用蒽酮法測(cè)定樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為A1、A2、A3、A4；(6)根據(jù)公式計(jì)算回收率PP=A4A3×1.5×100%]]>，回收率應(yīng)在80-120％；(7)根據(jù)公式計(jì)算游離多糖含量HH=A2A1×1.5÷P×100%]]>，式中P為回收率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測(cè)定方法，其特征為所述的肺炎鏈球菌為以下任意一種1型、2型、3型、4型、5型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型、33F型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測(cè)定方法，其特征為所述超濾杯截留分子量為5～50kD。
全文摘要
本發(fā)明一種肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測(cè)定方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其步驟為取肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物為樣1，另取等量肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物，加入無(wú)水乙醇和氯化鈉，置－20℃70～90小時(shí)，離心去上清液；用適當(dāng)溶劑充分洗滌沉淀，離心收集上清液，上清液經(jīng)超濾脫鹽和乙醇后為樣2；以蒽酮法測(cè)定樣1、樣2的多糖含量，計(jì)算出肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中的游離多糖含量。本發(fā)明可準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地測(cè)定出肺炎鏈球菌莢膜多糖結(jié)合物中游離多糖的含量。
文檔編號(hào)G06F19/00GK1963500SQ20061004887
公開日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日
發(fā)明者黃鎮(zhèn), 吳凱 申請(qǐng)人:云南沃森生物技術(shù)有限公司