專利名稱：生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及魚類餌料添加劑領域，具體涉及生物硒和谷胱甘肽在 作為魚飼料添加劑中的應用。
背景技術：
在海洋養(yǎng)殖中，赤潮毒素中的軟骨藻酸(domoicacid，DA)、腹瀉 性貝毒、麻痹性貝毒、神經性貝毒等在貝類中儲存積累不同，有很大 的危害性，其中軟骨藻酸的危害更廣，在魚類與貝類中均可富集，屬 記憶缺失性貝毒。到目前為止，世界各地均有DA檢出，由此導致的 人和動物的中毒事件層出不窮。另外，違禁漁藥中孔雀石綠對我國海 洋養(yǎng)殖水產品質量安全的潛在烕脅尤其嚴重，已多次造成重大經濟損 失，孔雀石綠能結合或插入DNA，促進腫瘤生長，具有明顯的高致 癌、高致畸和致突變作用。
而在淡水養(yǎng)殖中，由于水體富營養(yǎng)化導致有害藍藻水華頻頻發(fā) 生，并可能產生嚴重危害國民身體健康的藍藻毒素。其中銅綠微囊藻 M^rao^iy^n^/mwfl水華是世界各國淡水湖泊、池塘中分布廣、持 續(xù)時間長的一種可能產毒的藻類水華，其產生的毒素稱為微囊藻毒素 (microcystin，MC)。其中微囊藻毒素-LR是一種環(huán)狀七肽肝毒素，最 常見且毒性高。該毒素在肝臟特異聚積，造成細胞內一系列生理生化 反應的紊亂，最終導致肝細胞損傷，甚至發(fā)生急性死亡事件。微囊藻 毒素的促腫瘤作用也是通過這種方式實現的。長期飲用或食用含微囊藻毒素的水或水產品可能引發(fā)肝癌，特別是在存在肝炎病毒與黃曲霉 毒素的情況下，這種引發(fā)肝癌的可能性更高。因此，解決水體微囊藻 毒素的污染對我國國民身體健康尤為重要。
來自水體的微囊藻毒素污染主要有兩個污染源， 一個是來自污染 水體的飲用水， 一個是來自污染水體的水產品。對于飲用水微囊藻毒 素污染問題，自來水廠采用物理、化學方法，主要通過專門裝置去除 水中微囊藻毒素，但隨著水體富營養(yǎng)化進程加劇，自來水廠處理成本 迅速攀升而不堪重負；對于受污染池塘養(yǎng)殖的水產品如羅非魚等淡水 商品魚，根本不可能以流體形式的方法在水產品加工過程去除微囊藻 毒素。
另外，由于相關農藥的使用，使農藥等毒物在淡水養(yǎng)殖魚體內積 聚。長期食用含有這些藥物的水產品可致畸、致癌，也會對人類健康 造成嚴重威脅。藻毒素、違禁漁藥等毒害物質的污染對人類健康所造 成的威脅已引起世界各國公共衛(wèi)生系統的廣泛關注，長期食用含毒素 的水產品可引發(fā)肝癌等各種疾病。
如何去除水產品含有的毒素，甚至是否可能利用水產品自身的排 毒機制去除其攝取的毒素，都是目前非常緊迫的課題，在大量的研究 中，人們的目光投向了谷胱甘肽。
谷胱甘肽(glfftathione， GSH)是由Hopkins發(fā)現并命名，1929年 Hopkins及Kendall等各自獨立的發(fā)現其為含有甘氨酸的三肽。谷胱 甘肽化學名為N-(N-L-r-Glutamyl-L-cysteninyl)glycine，艮P N(N-L-r-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸。谷胱甘肽可分為還原型谷胱甘肽(reducedglutathione, GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidizided glutathione, GSSG)。
通常所說的谷胱甘肽是指還原型谷胱甘肽，是由r-谷氮酸、半胱氨酸、 甘氨酸組成的三肽。
谷胱甘肽是機體內的重要活性物質，它具有清除自由基、解毒、 促進鐵質吸收及維持紅細胞膜的完整性、維持DNA的生物合成、細 胞的正常生長及細胞免疫等多種生理功能。還原型谷胱甘肽(GSH)、 氧化型谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)和谷胱甘肽還 原酶(GSH-R)共同組成了谷胱甘肽氧化還原系統。該系統具有對抗氧 自由基、保護組織免受氧化損傷的作用，被稱為組織抗氧化系統。
谷胱甘肽廣泛分布于自然界的生物體中(Wierzbicka等，1989)，主 要存在于酵母、動物肝臟、肌肉、血液中，許多植物，如蔬菜、豆類、 谷物、薯類、菇類及細菌中也含有一定量的谷胱甘肽，在乳制品、熟 食品中含量較低。
目前，谷胱甘肽在畜禽生產中研究較多，已證實谷胱甘肽可以提 高豬卵母細胞成熟率及顯微受精胚的卵裂率，提高泌乳動物的泌乳性 能，解除黃曲霉毒素B1對雛雞的毒性。
在水產養(yǎng)殖相關領域方面，張甬元等發(fā)現谷胱甘肽可解除魚體微 囊藻毒素引起的中毒癥。焦采虹曾報道詞料中添加GSH可促進羅非 魚生長和影響氧化應激能力。Zambohino等報道谷胱甘肽能提高鱸魚 生長速度和成活率。趙紅霞等選用初始體質量約8.50 g的草魚 (CfcW0/7/W072g0^/2 在56 d的飼養(yǎng)期中分別投喂添加5種不
同劑量谷胱甘肽(GSH)(添加量分別為Omg/kg、 100mg/kg、 200 mg/kg、 300mg/kg和400mg/kg)的試驗飼料，觀察GSH對草魚生長、 生理指標和抗病力的影響。結果表明，詞料中添加GSH不僅能夠提 高草魚特定生長率、存活率和飼料效率，還可以提高草魚對嗜水氣單 胞菌的抵抗能力，其中200mg/kgGSH組草魚攻毒后存活率達到最 高。以特定生長率為判定指標，GSH在草魚飼料中的適宜添加量為 350 mg/kg。谷胱甘肽還曾作為強肝劑的一種成分用于水產佴料添加 劑。
然而谷胱甘肽的去毒作用很大程度上依賴于谷胱甘肽過氧化物 酶(GHS-Px)和谷胱甘肽S-轉移酶(soluble glutathione S-transferase， sGST), GHS-Px能催化還原型谷胱甘肽(GHS)變成氧化型谷胱甘 肽(GSSG)，同時使有毒的過氧化物還原和分解為無毒物質，此外， 還原型谷胱苷肽本身在可溶性谷胱甘肽S-轉移酶(soluble glutathione S-tramferase， sGST)催化下可與多種化學物質包括藻毒素、違禁漁藥、 致癌物以及氧化應激產生的各種毒性代謝物發(fā)生加合反應，降低毒物 毒性并將其直接經排泄系統排出體外。因此，提高GHS-Px和GST 的活性對于谷胱甘肽的解毒去毒功能有著重要的促進作用。
硒元素(Se)是GHS-Px活性中心的必須組成成分，研究表明機 體適當補充硒元素可顯著提高GHS-Px酶的活性，此外，Christensen 等給剛斷奶的大鼠分別詞以缺乏、足量或超劑量的含硒食物，測定其 肝、腎GST的活性及基因的表達，發(fā)現硒對GST的基因表達有影響， 并可能存在一種與硒的生理作用有關的GST基因調控機制。
硒是人體必需的微量元素，具有多種生物學功能。硒與多種酶的活性有關，另外硒可調節(jié)維生素A、 C、 E、 K的吸收和消耗，參與 泛醌的合成；促進或增加機體中免疫球蛋白的含量，從而起免疫佐劑 作用。
如果能將生物硒與谷胱甘肽共同作為餌料添加劑喂給魚類，將可 能大大提高魚類去毒基因表達，從而增強魚類對外界毒物的抵抗及分 解排泄能力。目前尚未有將硒與谷胱甘肽一起用作魚類餌料添加劑的 相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對水產品尤其是養(yǎng)殖魚類體內毒素，特別是 藻毒素富集嚴重而現有技術無法很好去除這些毒素，從而導致人類健 康嚴重受到威脅等問題，提供一種生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添 加劑中的應用，含有生物硒和谷胱甘肽的魚館添加劑可以促進魚類去 毒基因的表達，不需對養(yǎng)成的水產品進行任何專門處理，也不需任何 專門的加工裝置，魚類自身就能將攝取的毒素排泄出來，從而保證了 食用魚的安全性。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的 首先，本發(fā)明分析了魚體內去毒體系的作用原理毒素進入魚肝 細胞后，使細胞中產生大量活性氧分子，這些活性氧分子將脂質分子 氧化為過氧化脂質分子，以自由基鏈式反應的方式對肝臟造成嚴重損 傷。這時，在肝臟抗氧化脅迫與抑制過量ROS發(fā)生方面起重要作用
的GPX被誘導，過氧化脂質分子在谷胱甘肽過氧化物酶GPX的作用 下，被GSH還原生成GSSG和還原型脂質分子，而sGST則催化GSH與毒素結合，成為水溶性化合物排出體外，起到解毒作用。
目前，對于哺乳動物中外源物質促進GST基因表達的調控機理 研究已有相當的進展。當機體接觸外源化學物質產生過氧化壓力和親 電子壓力時，發(fā)現有超過100個基因會發(fā)生應激表達，他們的產物調 控多種細胞活動包括信號傳導、增殖和免疫防御反應等。我們對編 碼這些抗氧化酶的基因啟動子進行功能分析發(fā)現了一個順式轉錄調 控元件，此元件可以調控這些基因的基礎表達及介導異生素或抗氧化 劑刺激的誘導表達。這個元件被命名為抗氧化反應元件(ARE)或親電 子反應元件(EpRE)。
Rushmore等利用基因敲除技術證實，大鼠GSTl(Ya)亞基基因的 5'側翼區(qū)存在5個獨立的調控元件，但是有關魚類GST5'側翼區(qū)調 控元件的作用，目前遠不如哺乳類清楚。
Leaver對比目魚GSTA、 GSTA1、 GSTA2基因的啟動子區(qū)域序列 進行比較分析，發(fā)現比目魚GSTA啟動子區(qū)含4個ARE (或EpRE) 調控元件，GSTA1啟動子區(qū)含幾個可被過氧化物酶體增殖物識別的 序歹U PPRE (peroxisome proliferator response element)禾口 2個ERE (estrogen responSe elelment)調控元4牛，而GSTA2的調控區(qū)則不含 任何可識別的啟動子元件。對比目魚GSTA、 GSTA1及GSTA2啟動 子進行活性分析發(fā)現，比目魚GSTA啟動子活性最高，GSTA1次之， GSTA2最低，認為這可能跟這些基因啟動子區(qū)含不同的調控元件有 關。比目魚GTSA基因的表達調控模式，可能跟哺乳類alpha家族 sGST基因相類似，均由一系列親電子的外源性物質通過ARE誘導GST基因表達，提示GSTA在魚類及哺乳類的抗氧化應激方面可能 發(fā)揮著相似作用。
本發(fā)明考慮可以通過生物硒促進去毒基因的轉錄水平，增強魚類 去毒能力；而還原型谷胱苷肽本身在可溶性谷胱甘肽S-轉移酶 (soluble glutathione S-transferase, sGST)催化下可與多種化學物質包J舌 藻毒素、違禁漁藥、致癌物以及氧化應激產生的各種毒性代謝物發(fā)生 加合反應，降低毒物毒性并將其直接經排泄系統排出體外。
綜上所述，本發(fā)明將生物硒和谷胱甘肽用于魚類餌料添加劑中， 所制備的含生物硒和谷胱苷肽的魚飼料，其富硒酵母的含量為每公斤 干飼料含有富硒酵母0.5-1.0克，谷胱苷肽的含量為每公斤干詞料含 有谷胱甘肽0.8 1.2克。
硒元素的來源有許多種，與亞硒酸鈉等無機硒相比，生物硒具有 吸收利用率高,安全性強，無毒副作用，是人體的最佳硒。富硒酵母，屬 于生物硒，是目前常用的一種含硒添加劑，在國外已實現工工業(yè)化生 產和進入實用階段。生物硒的含硒量最高可達1000 ppm，但通常為 300ppm左右。其蛋白質含量為55.8%，維生素Bl為3.2ppm，維生 素B2為33.2 ppm，是一種功能性極佳的食品配料。經化學分析表明， 硒在富硒酵母中的存在形式與其在普通啤酒酵母中的天然存在形式 相似，其中有機硒含量占總硒量的95%以上，而有機硒中又有27% 的是以共價鍵形式結合到大分子(主要是蛋白質)上。硒蛋白中的含 硒分子結構主要以硒代胱氨酸為主，約占83%，而硒代蛋氨酸的含量 則較少。本發(fā)明采用富硒酵母作為生物硒的主要來源，富硒酵母可以選用市場上可購買得到的成品，根據其中所含硒的份量按比例混合入 魚飼料中。
谷胱苷肽選用AMRESCO公司的產品，其純度>98.0%。
魚飼料通常是指魚粉，也可以是價格低廉且含豐富的蛋白質如玉 米、大豆等制成的詞料。魚飼料通常分成蛋白質飼料和能量飼料。其 中蛋白質飼料是指干物質中粗蛋白含量>20%,粗纖維含量《18%的 一類飼料；能量飼料是指干物質中粗蛋白含量《20%，粗纖維含量《 18%的一類飼料。
考慮到飼料營養(yǎng)與容量的關系，既要保證魚類能攝入足夠的營 養(yǎng)，又要能使其產生飽感。所以蛋白質飼料和能量飼料是具備一定的 比例。為了有利于魚類生長，既要滿足魚類生長對蛋白質的需要，又 要使能量和蛋白質的比例適中，過高和過低的能量蛋白比都不利于魚 類生長。
與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明提供了一
種生物硒和谷胱苷肽在魚飼料添加劑中的應用，添加有生物硒和谷胱 甘肽的魚詞料能夠促進魚類去毒基因的表達，從而增強魚類抵抗外界
毒物的能力；2.根據本發(fā)明提供的一種生物硒和谷胱苷肽在魚詞料添 加劑中的應用，在淡水養(yǎng)殖經濟魚類在微囊藻等藍藻水華高發(fā)期、海 水養(yǎng)殖經濟魚類接觸赤潮發(fā)生或者接觸違禁漁藥時，給養(yǎng)殖的魚類喂 投含添加了高效安全生物硒和谷胱苷肽添加劑的魚飼料，有利于魚類 自身代謝排除微囊藻毒素以及藥物毒素，從而保證魚類食用的安全 性；3.利用本發(fā)明所提供的一種生物硒和谷胱苷肽在魚詞料添加劑中的應用，所制備的魚飼料，在水產養(yǎng)殖過程中喂投含給魚類，可以促 進魚類去毒基因表達特別是I、 II時相代謝去毒相關基因的表達，通 過魚自身的代謝體系就能夠將自身攝入及積累的毒素分解排泄出去， 不需對養(yǎng)成的水產品進行任何專門處理，也不需任何專門的加工裝 置，極大地降低了食用魚的后期處理成本，更加環(huán)保經濟。


圖1為雜交羅3貝魚(Oeoc/ ram" m'foft'c"ja 按每公斤飼 料中含富硒酵母0.5 g的量喂食后，其GSTA、 GPX基因mRNA表 達的RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為SE+PBS， 4為SE+MC-LR;
圖2為雜交羅非魚(OwocAr(9/m:y m7orici/ja ""re船)按每公斤飼 料中含富硒酵母l.O g的量喂食后，其GSTA、 GPX基因mRNA表 達的RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為SE+PBS， 4為SE+MC-LR;
圖3為尼羅羅非魚((9mx^ram^ m7加'c"s)按每公斤飼料中含 GSH0.8 g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達的 RT-PCR分析柱形其中1為PBS，2為MC-LR， 3為GSH+PBS，4為GSH+MC-LR;
圖4為尼羅羅非魚(OeoWAwm;s m'foric^)按每公斤飼料中含 GSH1.0g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達的 RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為GSH+PBS， 4為GSH+MC-LR;圖5為尼羅羅非魚((9m dzram^ m7oft'c""按每公斤飼料中含 GSH1.2g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達的 RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為GSH+PBS，4為GSH+MC-LR;
圖6為尼羅羅非魚(O^c/^rom^ m7ofl'c""按每公斤飼料中含富 硒酵母0.6g和GSH1.0g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表達的RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為SE+GSH+PBS ， 4為 SE+GSH+MC-LR;
圖7為鰱魚(/^7wp/i^zZ/m'c/^/0^ mo/^tc)按每公斤飼料中含富硒 酵母0.6 g和GSH 1.0 g的量喂食后，其GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表達的RT-PCR分析柱形其中1為PBS， 2為MC-LR， 3為SE+GSH+PBS， 4為 SE+GSH+MC-LR。
具體實施例方式
實施例l含生物硒和谷胱甘肽的魚飼料
含生物硒和谷胱甘肽的魚飼料的制備方法如下
(1)取購買自廣州市圣格王生物技術有限公司的富硒酵母，其含 量組份為(質量百分比)
水分 《10.0% 蛋白質(以N計)》40.0% 灰份 《10.0%硒(以Se計) 300-2000 mg/kg
(2) 取購買自AMRESCO公司的谷胱甘肽，該谷胱甘肽的純度 >98. 0%:
(3) 按每公斤干飼料含約0.5克富硒酵母，每公斤干飼料含約 0.8克谷胱苷肽的量，分別將富硒酵母和谷胱甘肽混合加入購買自廣 州市澳洋實業(yè)有限公司魚飼料中即得。
實施例2含生物硒和谷胱甘肽的魚詞料
含生物硒和谷胱甘肽的魚飼料的制備方法如下
(1)取購買自廣州市圣格王生物技術有限公司的富硒酵母，其含
量組份為(質量百分比)
水分 《10.0% 蛋白質(以N計)>40.0% 灰份 《10.0% 硒(以Se計) 300-2000 mg/kg
(2) 取購買自AMRESCO公司的谷胱甘肽，該谷胱甘肽的純度 〉98. 0%:
(3) 按每公斤干飼料含約1.0克富硒酵母，每公斤干飼料含約 1.2克谷胱苷肽的量，分別將富硒酵母和谷胱甘肽混合加入購買自廣 州市澳洋實業(yè)有限公司魚飼料中即得。
實施例3含生物硒和谷胱甘肽的魚詞料促進魚類去毒基因表達 的檢測
本實施例中，用半定量PCR方法比較不同品種、品系池塘養(yǎng)殖羅非魚肝臟與肌肉微囊藻毒素去毒酶基因的mRNA相對水平，以p-肌動蛋白為外參照(我們已克隆羅非魚P-肌動蛋白cDNA序列)，相 對比較羅非魚不同品種、品系肝臟與肌肉的微囊藻毒素去毒能力。具 體方法詳見文獻Liang, X. F.， Ogata， H. Y.， Oku， H.， Chen, J.， Hwang， F" 2003. Abundant and constant expression of uncoupling protein 2 in the liver of red Sea bream尸agmsComparative Biochemistry and Physiology A 136: 655-661.
本實施例中，按Liang et al. (2002)方法通過競爭PCR測定組實驗 魚肝臟與肌肉中微囊藻毒素去毒酶基因mRNA數量，確定羅非魚不 同品種、品系肝臟與肌肉的微囊藻毒素去毒能力。微囊藻毒素去毒酶 基因cDNA競爭模板(定量標準)的制備依照Cell et al. (1993)方法。 具體方法詳見文獻Liang, X.-F.， Ogata， H. Y., Oku， H., 2002. Effect of dietary fatty acids on lipoprotein lipaSe gene expression in the liver and visceral adipoSe tissue of fed and starved red Sea bream Pagrus major. Comp. Biochem. Physiol. A132: 913-919。
本實施例中，采用黃峙等已成功建立的方法制備生物硒，參照國 際標準確定飼料中適宜的生物硒添加量。生物硒制備具體方法詳見文 獻黃峙，鄭文杰，郭寶江,2002。鈍頂螺旋藻富硒培養(yǎng)條件的優(yōu)化。 生物工程學報，18(3): 373-376。
廣東羅非魚良種場提供不同品種、品系池塘養(yǎng)殖羅非魚、鰱魚、 草魚用于本項研究。
(一)含生物硒的魚飼料促進魚類去毒基因表達的檢測1、材料和方法 1.1 實驗魚
實驗雜交羅非魚(5~8 g)隨機分為兩組，每組30條， 一組喂食含 富硒酵母粉的飼料，每公斤飼料中富硒酵母含量分別為0.5g、 l.Og， 另一組喂食含普通酵母粉的飼料以作對照，每天喂食，喂食次數相同， 喂飽為止，喂食一個月以上。馴養(yǎng)期自然死亡率低于10%。魚類養(yǎng)殖 用水為曝氣除氯的自來水，水溫為24士2。C，飼養(yǎng)期間連續(xù)充氧。隨 后每組實驗魚各10尾隨機分成2組，每組5尾在自然光照周期下飼 養(yǎng)于室內，用于染毒試驗。經人工飼養(yǎng)排毒后的羅非魚染毒方式采用 腹腔注射，以磷酸緩沖液(PBS)為溶劑，MC-LR (微囊藻毒素)的注 射量為50嗎kg—ibwt，對照組直接注射PBS。 24h后冰凍麻醉，分離 肝臟組織。MC-LR為Alexis公司產品公司產品。
實驗魚小心分離出肝臟，肌肉組織從背部取材，迅速稱重后用于 提取總RNA。肝臟總RNA提取與純化使用S.N.A.P. Total RNA Isolation Kit (Invitrogen)， cDNA合成使用lst-strand cDNA Synthesis Kit (Clontech),以oligo(dT)20作為反轉錄引物?？俁NA提取與cDNA 合成均按試劑盒推薦的方法進行操作。
1.2雜交羅非魚肝臟GSTA、 GPX基因mRNA水平的測定
喂生物硒與對照羅非魚每組各10尾隨機分成2組，每組5尾， 用于染毒試驗。染毒方式采用腹腔注射，以磷酸緩沖液(PBS)為溶劑， MC-LR的注射量為50嗎kg—1 bwt，對照組直接注射PBS。 24 h后冰 凍麻醉，分離肝臟組織?？俁NA提取和cDNA第一鏈的合成同l.l。以P-肌動蛋白為外參照，采用RT-PCR方法比較雜交羅非魚肝臟 的GSTA、 GPX基因mRNA相對水平，根據羅非魚GSTA、 GPX基 因序列設計特異引物D-ONGST01F:5、- AggATCCCAAAgAACgAg-3、和D-ONGST02R:5、- CAgAAACCTgCTgATggC -3、，擴增1條332 bp的GSTA基因cDNA片段；ONGPXOF: 5、-CACCAAGAGAACT GCAAG -3、和ONGPXOR: 5-CACGTCATTCCTACACAC -3、擴增1 條280 bp的GPX基因cDNA片段。
根據已發(fā)表的羅非魚P-肌動蛋白(GenBank: AB037865)設計2 條特異引物D-ONACT01F:5、-CgTgACATCAAAgAgAAgC- 3、和D-ACT02R: 5、-TCTgCTggAAggTggACAg- 3\擴增羅非魚P-肌動蛋白 cDNA片段(436 bp)。
PCR反應條件為94。C預變性3 min， 94°C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30個循環(huán)，最后72'C延伸5 min。指數增長期內終止反 應。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像 系統及相關軟件(Alphalmaget， Alpha Inotech， USA)進行分析，結果 以GSTA、 GPX基因mRNA分別與p-肌動蛋白mRNA的RT-PCR產 物亮度之比(％)表示。
1.3統計分析
采用統計分析軟件SPSS 10.0對不同品系羅非魚肝臟GSTA、GPX 基因MC-LR誘導前后mRNA相對表達水平平均值差異進行統計分 析。若P〈0.05，平均值的差異即認為是顯著的。
2、結果2.1微囊藻毒素對喂生物硒與不喂生物硒雜交羅非魚肝臟
GSTA、 GPX基因mRNA表達的影響
以p-肌動蛋白為對照，測定微囊藻毒素對喂富硒酵母與不喂富硒 酵母羅非魚肝臟GSTA、 GPX基因mRNA表達的影響。如圖1所示， 按每公斤飼料中含富硒酵母0.5 g的量，不喂富硒酵母和喂富硒酵母 的雜交羅非魚(Oeoc/zram^ m'/oft'ci^O. )在MC-LR (50 jig kg隱l
body weight (bwt))腹腔注射24h后，其肝臟GSTA、 GPX基因mRNA 表達水平均沒有顯著差異。如圖2所示，按每公斤飼料中含富硒酵母 1.0 g的量，不喂生物硒與不喂生物硒雜交羅非魚在MC-LR (50昭 kg-1 bwt)腹腔注射24h后，其肝臟GSTA、 GPX基因mRNA表達 水平均有升高趨勢。
結果證明，在含富硒酵母0.5 1.0g/kg的干飼料添加濃度范圍內， 隨著濃度的增高，毒素誘導后去毒相關基因GSTA、 GPX的誘導表達 作用越明顯，對機體的保護作用越強。
(二)含谷胱甘肽的魚詞料促進魚類去毒基因表達的檢測
隨機挑選48尾尼羅羅非魚用于實驗(平均體重17g)，其中，36 尾作為添加劑組喂食含還原型谷胱甘肽飼料(分別0.8、 1.0、 1.2 g/kg)， 12尾作為普通組喂食普通飼料，各組均飽食10天后處理，隨后每組 實驗魚各12尾隨機分成2組，每組6尾在自然光照周期下飼養(yǎng)于室 內，用于染毒試驗。羅非魚染毒方式采用腹腔注射，以磷酸緩沖液(PBS) 為溶劑，MC-LR的注射量為50嗎kg—1 bwt，對照組直接注射PBS。 24 h后冰凍麻醉，分離肝臟組織。MC-LR為Alexis公司產品。以P-肌動蛋白為外參照，采用RT-PCR方法比較羅非魚肝臟的G STA、 GPX和GSTR基因mRNA相對水平，根據羅非魚GSTA、 GP X和GSTR基因序列設計特異引物D-ONGST01F: 5、-AGGATCCC AAAGAACGAG-3、和D-ONGST02R: 5-CAGAAACCTGCTGATGG C-3、擴增1條332 bp的sGSTA基因cDNA片段；ONGPXOF: 5、-C ACCAAGAGAACTGCAAG-3、和ONGPXOR: 5-CACGTCATTCCTA CACAC-3、擴增1條280 bp的GPX基因cDNA片段；D-ONGSTR01 F: 5-GAGCACAAGTCCAAAGAAG-3、和D-ONGSTR02R: 5-GCA GATTGTGATACTCTCC-3、擴增1條472 bp的sGSTA基因cDNA片 段。根據已發(fā)表的尼羅羅非魚P-肌動蛋白設計2條特異引物D-ONA CT01F: 5-CgTgACATCAAAgAgAAgC-3、和D-ACT02R: 5、-TCTgC TggAAggTggACAg-3、擴增羅非魚(3-肌動蛋白cDNA片段(436 bp)。
PCR反應條件為94。C預變性3 min， 94。C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30個循環(huán)，最后72'C延伸5 min。指數增長期內終止反 應。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像 系統及相關軟件(Alphalmaget， Alpha Inotech, USA)進行分析，結果 以GSTA、 GPX和GSTR基因mRNA分別與P-肌動蛋白mRNA的 RT-PCR產物亮度之比(％)表示。
以p-肌動蛋白為對照，測定微囊藻毒素對喂GSH與不喂GSH的 尼羅羅非魚肝臟GSTA、 GPX基因mRNA表達的影響。如圖3、 4所 示，當每公斤干飼料中含0.8 g、 1.0 g GSH的量時，不喂GSH和喂 GSH的尼羅羅非魚在MC-LR (50嗎kg"bwt)腹腔注射24h后，其肝臟GSTA 、 GSTR基因mRNA表達水平變化不明顯，GPX基因mRNA 表達水平有升高趨勢。如圖5所示，當每公斤干飼料中含1.2gGSH的 量時，不喂GSH和喂GSH的尼羅羅非魚在MC-LR (50嗎kg"bwt) 腹腔注射24h后，其肝臟GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達水平 均有升高趨勢。
結果證明，在含GSH0.8 1.2g/kg的干詞料添加濃度范圍內，隨 著濃度的增高，毒素誘導后去毒相關基因GSTA、 GSTR、 GPX的誘 導表達作用越明顯，對機體的保護作用越強。
(三)含生物硒和谷胱甘肽的魚飼料促進魚類去毒基因表達的檢測 尼羅羅非魚、鰱魚各24尾用于實驗，分別取12尾作為添加劑組 (每公斤飼料中同時喂食富硒酵母0.6g/kg和GSH 1.0g/kg)， 12尾 作為普通組喂食普通飼料，兩組均飽食10天后處理，隨后每組實驗 魚各12尾隨機分成2組，每組6尾在自然光照周期下飼養(yǎng)于室內， 用于染毒試驗。羅非魚染毒方式采用腹腔注射，以磷酸緩沖液(PBS) 為溶劑，MC-LR的注射量為50嗎kg—1 bwt，對照組直接注射PBS。 24h后冰凍麻醉，分離肝臟組織。MC-LR為Alexis公司產品。
以卩-肌動蛋白為外參照，采用RT-PCR方法比較尼羅羅非魚、鰱 魚肝臟的GSTA、 GPX和GSTR基因mRNA相對水平，根據尼羅羅 非魚、鰱魚GSTA、 GPX和GSTR基因序列設計特異引物 D-ONGST01F: 5 - AGGATCCCAAAGAACGAG-3、； D-ONGST02R: 5-CAG AAACCTGCTGATGGC-3、； scGSTA01F: 5-GACCTTAAAGAACGGGCT-3、；scGSTA02R: 5-GGAACTTGCTGATTCTTGG-3、分別擴增332、
334 bp的2條GSTA基因cDNA片段；
ONGPXOF: 5-CACCAAGAGAACTGCAAG -3、；
ONGPXOR: 5、-CACGTCATTCCTACACAC-3、；
scGPXOF: 5-GTGAACAGGAATGACATCG-3、；
scGPXOR: 5、-AGTGGACGGTCTATCTTGC-3、，分別擴增280、
192 bp的2條GPX基因cDNA片段；
D-ONGSTR01F: 5-GAGCACAAGTCCAAAGAAG-3、； D-ONGSTR02R: 5-GCAGATTGTGATACTCTCC-3、； scGSTR01F: 5-TGTGCAGAAGTGAAGGCT-3、； scGSTR02R: 5、-CATAATACTCCATCAGTCG-3、，分別擴增472、
457 bp的2條GSTR基因cDNA片段。
根據已發(fā)表的羅非魚、鰱魚(3-肌動蛋白設計條特異引物
D-ONACT01F:5，-CgTgACATCAAAgAgAAgC- 3，；
scACT01F:5，-CGTGACATCAAGGAGAAGC-3，；
D-ACT02R:5，-TCTgCTggAAggTggACAg-3，，均擴增羅非魚、鰱魚p-肌動蛋白cDNA片段(436 bp)。
PCR反應條件為94。C預變性3 min， 94°C 60s， 55°C 60s， 72 °C 60s，共30個循環(huán)，最后72'C延伸5 min。指數增長期內終止反 應。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像 系統及相關軟件(Alphalmaget, Alpha Inotech, USA)進行分析，結果 以GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA分別與p-肌動蛋白mRNA的RT-PCR產物亮度之比(％)表示。
以P-肌動蛋白為對照，測定微囊藻毒素對喂生物硒和GSH、不 喂食生物硒和GSH的羅非魚、鰱魚肝臟GSTA、 GSTR、 GPX基因 mRNA表達的影響。如圖6、 7所示，按每公斤飼料中喂生物硒0.6 g 禾口GSH1.0g的量，不喂添加劑和喂添加劑的羅非魚、鰱魚在MC-LR (50略kg—、wt)腹腔注射24h后，檢測其肝臟GSTA、 GSTR、 GPX基 因mRNA表達水平變化。研究發(fā)現，羅非魚喂食添加劑的各實驗組 GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表達水平比不喂食添加劑的各實驗 組高，喂食添加劑且未染毒實驗組比喂食添加劑且MC-LR毒素染毒 后的實驗組GSTA、 GSTR基因表達水平稍低，GPX基因表達水平升 高；鰱魚喂食添加劑的各實驗組GSTA、 GSTR、 GPX基因mRNA表 達水平比不喂食添加劑的各實驗組高，喂食添加劑且未染毒實驗組比 MC-LR毒素染毒后的實驗組GPX基因表達水平均升高，鰱魚GSTA 基因表達水平升高。結果證明喂食含有喂生物硒和GSH添加劑的魚 飼料可使魚類肝臟中去毒相關基因有不同程度的升高，從而保護機體 受外源毒素的損傷。生物灑和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應用序列表 SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大學
<120>生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應用
<130>
〈歸 14
<170> Patenl In version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212〉 DNA <213〉人工序列
<柳> 1
aggatcccaa agaacgag 18
<210> 2
〈211〉 18
<212> DNA <213〉人工序'列
<400> 2
cagaaacctg ctgatggc 18
<210> 3
〈211〉 18
<212〉 D貼
<213> 人工序列
<400> 3
caccaagaga actgcaag 18
<210> 4
<211> 18
<212> , <213>人工序列
<400> 4
cacgtcattc ctacacac
<210〉 5
<211> 19
<212> 鵬 <213>人工序列
<400〉 5
cgtgacatca aag縛aagc
<210〉 6
<211> 19
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 6
tctgctggaa ggt鵬cag
<210> 7
〈211> 19
<212> DM <213>人工序列
<400〉 7
gagc3C3agt cc;taag33g
權利要求
1、生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應用，其特征在于所述應用為在魚飼料中同時加入生物硒和谷胱甘肽。
2、 根據權利要求l所述的應用，其特征在于所述生物硒為富硒 酵母，其用量為每公斤干粉飼料中含有富硒酵母0.5 1，0克。
3、 根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述谷胱甘肽 的用量為每公斤干粉飼料中含有谷胱甘肽0.8~1.2克。
全文摘要
本發(fā)明公開一種生物硒和谷胱甘肽在作為魚飼料添加劑中的應用，其中生物硒的用量為每公斤干粉飼料中含有富硒酵母0.5～1.0克，谷胱甘肽的用量為每公斤干粉飼料中含有谷胱甘肽0.8～1.2克。根據本發(fā)明的應用所制備的添加有生物硒和谷胱甘肽的魚飼料，能夠促進魚類去毒基因的表達，特別是I、II時相代謝去毒相關基因的表達，不僅增強魚類抵抗外界毒物的能力，有利于魚類通過自身的代謝體系分解排除微囊藻毒素以及藥物毒素，從而保證魚類食用的安全性，不需對養(yǎng)成的水產品進行任何專門處理，也不需任何專門的加工裝置，極大地降低了食用魚的后期處理成本，更加環(huán)保經濟。
文檔編號A23K1/16GK101438768SQ20081002924
公開日2009年5月27日 申請日期2008年7月4日 優(yōu)先權日2008年7月4日
發(fā)明者珊 何, 劉秀霞, 李光照, 李觀貴, 群 林, 梁旭方, 琳 王, 程偉軒, 胡永樂, 陳小佳 申請人:暨南大學