專利名稱：以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法。
背景技術(shù)：
花生是世界重要的油料作物之一，我國(guó)的花生產(chǎn)量居世界首位。一些生物及非生物脅迫都會(huì)影響花生的產(chǎn)量，尤其是地下害蟲、真菌及細(xì)菌病害。盡管傳統(tǒng)的雜交育種可以得到一些抗蟲抗病的品系(Garcia et al.，2006)，但是花生栽培品種遺傳多樣性低 (Kochert et al.，1991)，雜交育種周期長(zhǎng)，育成的抗病性狀通常與其他非預(yù)期的性狀連鎖，因此，目前通過(guò)分子育種手段培育花生品種，改良花生品質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。再生體系的效率是基因轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵，植物再生體系就是利用細(xì)胞的全能性，通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，在外源激素的作用下經(jīng)過(guò)器官發(fā)生或胚體細(xì)胞高效、穩(wěn)定地得到再生植株。外植體的選擇要求有較強(qiáng)的再生能力、對(duì)抗生素敏感、適宜外源基因的導(dǎo)入及整合?；ㄉ慕M織培養(yǎng)開始于20世紀(jì)40年代，我國(guó)則起始于70年代， 但再生效率很低。建立一個(gè)高效的花生再生體系，對(duì)改良花生品質(zhì)、提高花生產(chǎn)量具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述領(lǐng)域中的缺陷，本發(fā)明提供一種以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法，該方法的芽誘導(dǎo)率能達(dá)到40%左右，芽伸長(zhǎng)率達(dá)79 %，繼代生長(zhǎng)良好，可成為基因轉(zhuǎn)化的良好的再生體系。以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法，包括如下步驟(1)選取幼嫩的葉片，剪去葉緣后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)出芽，TDZ的濃度為O-Imgr1 ；NAA的濃度為0. 5-angr1，所述TDZ的濃度不高于NAA的濃度，且NAA的濃度與TDZ的濃度差值不大于Imgr1 ；(2)將產(chǎn)生的不定芽繼代，轉(zhuǎn)移到含有6-BA和NAA的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)至 2cm ；6-BA 的濃度為 4-Smgr1，NAA 的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(3)將伸長(zhǎng)的不定芽轉(zhuǎn)到含有NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，NAA的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常規(guī)方法移植栽培。所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的TDZ的濃度為0. SmgF1 ；NAA的濃度為0. Smgr1，步驟(1)培養(yǎng)時(shí)間為五周。所述伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的6-BA的濃度為Smgl^NAA的濃度為0. Smgr1，步驟⑵培養(yǎng)時(shí)間為兩周。
所述生根培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述生根培養(yǎng)基的NAA的濃度為0. Smgr1，步驟(3)培養(yǎng)時(shí)間為兩周。所述幼葉為完整胚的子葉在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后長(zhǎng)出的幼嫩葉片。所述完整胚的子葉在培養(yǎng)前需對(duì)花生作無(wú)菌處理。所述無(wú)菌處理的方法為花生去殼，放置于75%乙醇中l(wèi)min，棄乙醇，0. 升汞中放置％iin，滅菌水洗3次，放置于無(wú)菌紙上至晾干。本發(fā)明采用幼葉作為花生再生體系的外植體，在含有TDZ和NAA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上促進(jìn)不定芽伸長(zhǎng)，再于含有NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，得到生根小苗，可以按常規(guī)方法移植栽培。本發(fā)明建立的再生體系， 其芽誘導(dǎo)率高達(dá)40%左右，芽伸長(zhǎng)率達(dá)79%。繼代生長(zhǎng)良好，可成為基因轉(zhuǎn)化的良好的再生體系。


圖1以幼葉為外植體的花生組織培養(yǎng)A 幼葉外植體B 不定芽C 誘導(dǎo)芽D 芽伸長(zhǎng)E 生根F 移栽及結(jié)實(shí)
具體實(shí)施例方式芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，TDZ (即噻苯隆)的濃度為O-Imgr1 ；NAA(即萘乙酸)的濃度為0. 5-2mgr1伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，6_BA(即6_芐氨基嘌呤)的濃度為4-Smgr1，NAA 的濃度為0. 5-lmgr1 ；生根培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，NAA的濃度為0. 5-lmgr1MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以市售，也可按配方自行配制?；ㄉ鸀槭惺鄣娜我黄贩N。實(shí)施例11.以幼葉為外植體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基及伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的確定1.花生去殼，放置于75%乙醇中l(wèi)min，棄乙醇，0. 1 %升汞中放置％iin，滅菌水洗 3次，放置與無(wú)菌紙上至吹干；2.用無(wú)菌的手術(shù)刀，將花生兩個(gè)子葉分開，含有完整胚的子葉放置在基本培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)；3.選取培養(yǎng)不同時(shí)間幼嫩的葉片，剪去葉緣后，正面朝上放置在含有TDZ、6_BA和 NAA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(表1)，光照培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基放置35個(gè)左右外植體；表1芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法，包括如下步驟(1)選取幼嫩的葉片，剪去葉緣后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)出芽，TDZ的濃度為O-Imgr1 ；NAA的濃度為0. 5-angr1，所述TDZ的濃度不高于NAA 的濃度，且NAA的濃度與TDZ的濃度差值不大于Imgr1 ；(2)將產(chǎn)生的不定芽繼代，轉(zhuǎn)移到含有6-BA和NAA的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)至 2cm ；6-BA 的濃度為 4-Smgr1，NAA 的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(3)將伸長(zhǎng)的不定芽轉(zhuǎn)到含有NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，NAA的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常規(guī)方法移植栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的TDZ的濃度為0.SmgF1 ；NAA的濃度為0. Smgr1，步驟(1)培養(yǎng)時(shí)間為五周。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的6-BA的濃度為Smgl—1，NAA的濃度為0. δπ^Γ1，步驟(2)培養(yǎng)時(shí)間為兩周。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述生根培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述生根培養(yǎng)基的NAA的濃度為0.Smgl—1，步驟(3)培養(yǎng)時(shí)間為兩周。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述幼葉為完整胚的子葉在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后長(zhǎng)出的幼嫩葉片。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述完整胚的子葉在培養(yǎng)前需對(duì)花生作無(wú)菌處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述無(wú)菌處理的方法為將花生去殼，放置于75%乙醇中l(wèi)min，棄乙醇，0. 升汞中放置％iin，滅菌水洗3次，放置于無(wú)菌紙上至晾干。
全文摘要
本發(fā)明涉及以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用幼葉作為花生再生體系的外植體，在含有TDZ和NAA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上促進(jìn)不定芽伸長(zhǎng)，再于含有NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，得到生根小苗，可以按常規(guī)方法移植栽培。本發(fā)明建立的再生體系，其芽誘導(dǎo)率高達(dá)40％左右，芽伸長(zhǎng)率達(dá)79％。繼代生長(zhǎng)良好，可成為基因轉(zhuǎn)化的良好的再生體系。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102257965SQ201110179839
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者宋福平, 張 杰, 束長(zhǎng)龍, 耿麗麗, 黃大昉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所