專利名稱：以去胚子葉為外植體花生再生體系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種花生再生體系的建立方法。
背景技術(shù)：
花生是世界重要的油料作物之一，我國的花生產(chǎn)量居世界首位。一些生物及非生物脅迫都會(huì)影響花生的產(chǎn)量，尤其是地下害蟲、真菌及細(xì)菌病害。盡管傳統(tǒng)的雜交育種可以得到一些抗蟲抗病的品系(Garcia et al.，2006)，但是花生栽培品種遺傳多樣性低 (Kochert et al.，1991)，雜交育種周期長，育成的抗病性狀通常與其他非預(yù)期的性狀連鎖，因此，目前通過分子育種手段培育花生品種，改良花生品質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。再生體系的效率是基因轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵，植物再生體系就是利用細(xì)胞的全能性，通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，在外源激素的作用下經(jīng)過器官發(fā)生或胚體細(xì)胞高效、穩(wěn)定地得到再生植株。外植體的選擇要求有較強(qiáng)的再生能力、對(duì)抗生素敏感、適宜外源基因的導(dǎo)入及整合?；ㄉ慕M織培養(yǎng)開始于20世紀(jì)40年代，我國則起始于70年代， 但再生效率較低。因此，建立一個(gè)高效的花生再生體系，對(duì)改良花生品質(zhì)、提高花生產(chǎn)量具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述領(lǐng)域中的缺陷，本發(fā)明提供一種以去胚子葉為外植體花生再生體系的建立方法，該方法的芽誘導(dǎo)率能達(dá)到48%左右，繼代生長良好，可成為基因轉(zhuǎn)化的良好的再生體系。以去胚子葉為外植體花生再生體系的建立方法，包括如下步驟(1)將去胚子葉正置于含有6-BA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)出不定芽，所述正置為將遠(yuǎn)離胚的位置接觸培養(yǎng)基，6-BA的濃度為SjOmgr1 ；(2)將帶有不定芽的去胚子葉，轉(zhuǎn)移到含有6-BA的伸長培養(yǎng)基上促進(jìn)不定芽伸長，6-BA的濃度為5-lOmgr1 ；(3)將伸長的不定芽去胚子葉轉(zhuǎn)到含有NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，NAA的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常規(guī)方法移植栽培。所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的6-BA的濃度為lSIOmgr1，步驟(1)培養(yǎng)時(shí)間為兩周。所述伸長培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述伸長培養(yǎng)基中的6-BA的濃度為Smgr1，步驟⑵培養(yǎng)時(shí)間為兩周。所述生根培養(yǎng)基為的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述生根培養(yǎng)基中的NAA的濃度為0. Smgr1，步驟(3)培養(yǎng)時(shí)間為一周。所述去胚子葉為分開的1/2子葉或是未分開的全子葉。所述去胚子葉取出前需對(duì)花生作無菌處理。
所述無菌處理的方法為花生去殼，放置于75%乙醇中l(wèi)min，棄乙醇，0. 升汞中放置％iin，滅菌水洗3次，放置于無菌紙上至晾干。本發(fā)明采用去胚子葉作為花生再生體系的外植體，在含有6-BA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出芽后，降低6-BA的濃度，在含有6-BA的伸長培養(yǎng)基上促進(jìn)不定芽伸長，再于含有 NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，得到生根小苗，可以按常規(guī)方法移植栽培。本發(fā)明建立的再生體系，其芽誘導(dǎo)率高達(dá)48 %左右。


圖1外植體制備放置方式，1.正置，2.倒置，圖2以1/2去胚子葉為外植體誘導(dǎo)芽，A 1/2去胚子葉B 1周在近胚處產(chǎn)生不定芽C 誘導(dǎo)芽(兩周)圖36-BA濃度對(duì)去胚子葉芽誘導(dǎo)率的影響(1/2子葉)，圖46-BA濃度對(duì)去胚子葉芽誘導(dǎo)率的影響(全子葉)，圖5以去胚子葉為外植體誘導(dǎo)芽的伸長、移栽及結(jié)實(shí)。
具體實(shí)施例方式芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的6_BA(即6_芐氨基嘌呤)伸長培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA生根培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA(即萘乙酸)花生是市售的任一品種。MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以市售，也可以自行配制。實(shí)施例11.以去胚子葉為外植體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定1.花生去殼，放置于75%乙醇中l(wèi)min，棄乙醇，0. 1 %升汞中放置％iin，滅菌水洗 3次，放置于無菌紙上至晾干；2.用無菌的手術(shù)刀，將花生兩個(gè)子葉分開，去除胚后，將子葉縱向切成兩部分，將 1/2子葉放置在含有不同濃度6-BA(0、5、10、15和ZOmgr1)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，放置方式分為兩種正置及倒置(正置，遠(yuǎn)離胚的位置接觸培養(yǎng)基；倒置，近胚的位置接觸培養(yǎng)基)，見圖1，或?qū)⑽辞蟹值淖尤~，正置放在含ZOmgrie-BA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基上大約放置35個(gè)外植體，獨(dú)立重復(fù)3次；
產(chǎn)生誘導(dǎo)芽的外植體數(shù)2.兩周后統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)率，牙誘導(dǎo)率=- ο
總外植體數(shù)2以去胚子葉為外植體的花生再生體系1.花生去殼，放置于75%乙醇中l(wèi)min，棄乙醇，0. 1 %升汞中放置％iin，滅菌水洗 3次，放置與無菌紙上至晾干；2.用無菌的手術(shù)刀，將花生兩個(gè)子葉分開，去除胚后，將子葉正置放在含有含 20mgr16-BA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，兩周后誘導(dǎo)的不定芽產(chǎn)生；3.將產(chǎn)生不定芽的外植體繼代，轉(zhuǎn)移到含有Smgll-BA的伸長培養(yǎng)基上，兩周左右，不定芽伸長；
4.將伸長的誘導(dǎo)芽轉(zhuǎn)到含有0. SmgF1NAA的生根培養(yǎng)基上，一周左右生根；將生根的小苗移栽，轉(zhuǎn)移到含有營養(yǎng)土和蛭石(體積比為2/1)的花盆中，移到溫
室培養(yǎng)。結(jié)果以1/2去胚子葉為外植體(圖2A)，正置于含有6-BA的培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)。1周后，在近胚處有不定芽產(chǎn)生(圖2B)。兩周左右，不定芽分化成明顯可見的小芽(圖2C)。在 5種不同濃度的6-BA上，除了不添加6-BA的培養(yǎng)基沒有誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，其他4種培養(yǎng)基均可以不同程度的誘導(dǎo)不定芽，不定芽的誘導(dǎo)率在4. 2% 16.0%之間(圖幻。在含有 lSmgH-BA的培養(yǎng)基上不定芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到16%。倒置不能誘導(dǎo)出芽?；谏厦娴慕Y(jié)果，又選用未切分的去胚子葉為外植體，正置于含有6-BA的培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)。兩周后，在外植體的近胚端產(chǎn)生誘導(dǎo)芽。在不同濃度的6-BA(5、10、15、20和 SOmgF1)培養(yǎng)基上，芽誘導(dǎo)率從11. 6%到44. 0% (圖4)，在含有ZOmgH-BA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效率最高，經(jīng)重復(fù)，最大的芽誘導(dǎo)率可以達(dá)到48. 3% (表1)。結(jié)果顯示，以未切分的去胚子葉為外植體在含有6-BA的培養(yǎng)基上產(chǎn)生誘導(dǎo)芽的效率明顯的高于以1/2去胚子葉為外植體高。表1最大芽誘導(dǎo)率的確定
權(quán)利要求
1.以去胚子葉為外植體花生再生體系的建立方法，包括如下步驟(1)將去胚子葉正置于含有6-BA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)出不定芽，所述正置為將遠(yuǎn)離胚的位置接觸培養(yǎng)基，6-BA的濃度為SjOmgr1 ；(2)將帶有不定芽的去胚子葉，轉(zhuǎn)移到含有6-BA的伸長培養(yǎng)基上促進(jìn)不定芽伸長， 6-BA 的濃度為 5-lOmgr1 ；(3)將伸長的不定芽去胚子葉轉(zhuǎn)到含有NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，NAA的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常規(guī)方法移植栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的6-BA的濃度為lSIOmgr1，步驟(1)培養(yǎng)時(shí)間為兩周。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述伸長培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述伸長培養(yǎng)基中的6-BA的濃度為Smgr1，步驟(2) 培養(yǎng)時(shí)間為兩周。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述生根培養(yǎng)基為的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述生根培養(yǎng)基中的NAA的濃度為O.Smgr1，步驟(3) 培養(yǎng)時(shí)間為一周。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述去胚子葉為未切分子葉或1/2子葉。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述去胚子葉取出前需對(duì)花生作無菌處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述無菌處理的方法為花生去殼，放置于75%乙醇中l(wèi)min，棄乙醇，0. 升汞中放置％iin，滅菌水洗3次，放置于無菌紙上至晾干。
全文摘要
本發(fā)明涉及“以去胚子葉為外植體花生再生體系的建立方法”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用去胚子葉作為花生再生體系的外植體，在含有6-BA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出芽后，降低6-BA的濃度，在含有6-BA的伸長培養(yǎng)基上促進(jìn)不定芽伸長，再于含有NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，得到生根小苗，可以按常規(guī)方法移植栽培。本發(fā)明建立的去胚子葉為外植體花生再生體系，最大的芽誘導(dǎo)率為48.3％。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102239807SQ20111017984
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者宋福平, 張 杰, 束長龍, 耿麗麗, 黃大昉 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所