專利名稱：枯草芽孢桿菌hl-1及其在土壤解磷方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用，具體涉及一種枯草芽孢桿菌{Bacillus subtilis) HL-I及其在分解土壤難溶性磷和改善土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)氮的固定、光合作用、能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物大分子合成和呼吸作用都有著重要影響。世界上有57億hm2 土壤缺磷，大多數(shù)土壤中磷濃度從在0. ΓΙΟ μ mol/L,而在理想狀態(tài)下，禾本科植物生長(zhǎng)所需的磷濃度為 1-5 μ mol/L,高需磷植物如西紅柿、豌豆則為5飛0 μ mol/L。在磷沒達(dá)到理想狀態(tài)下，植物將減產(chǎn)5 15%。傳統(tǒng)化學(xué)肥料的使用在一定程度上能減輕土壤中磷的缺乏，但作為中國磷肥的主要品種過磷酸鈣和磷銨等，無論在北方石灰性土壤還是南方酸性土壤，因土壤強(qiáng)烈的固磷作用，當(dāng)季利用率不足20%，造成資源浪費(fèi)。我國有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95% 以上的磷為難溶形態(tài)，植物難以吸收利用。并且磷肥施入土壤后極易被化學(xué)固定，形成溶解性極低的磷酸鈣、鐵、鋁等化合物，植物利用率僅為5 25%。即使經(jīng)過多年不斷的施用磷肥也沒有明顯的改善。增施磷肥是一種“高投入，低產(chǎn)出”的途徑。同時(shí)，我國的磷肥資源匱乏， 生產(chǎn)能力難以滿足需求。土壤中的磷元素并不缺乏，經(jīng)過常年施用化肥的積累，磷元素在土壤中的含量很高，但植物無法吸收利用這些磷，如能提高土壤中磷的利用率將為中國農(nóng)業(yè)帶來巨大變化。因此，提高磷肥利用效率，增強(qiáng)土壤磷素的活化與利用成為科學(xué)研究的重要任務(wù)。解磷微生物是土壤中能夠?qū)o效磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的有效磷的一類特殊微生物功能群體，能改進(jìn)磷肥固定、提高磷肥利用率和溶解土壤難溶磷，在自然及農(nóng)業(yè)生態(tài)的磷素生物地化循環(huán)中起到了關(guān)鍵作用，已經(jīng)被世界公認(rèn)為是一種廉價(jià)高效的環(huán)保型土壤磷活化生物措施。它們通過酸解、螯合、置換及分泌磷酸酶等方式將無效磷轉(zhuǎn)化為能被植物利用的有效磷(主要是hpo42_和形式)。大量研究表明，施用含有解磷菌的微生物肥料對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)、改善土壤結(jié)構(gòu)效果顯著。利用溶磷微生物對(duì)提高磷肥的有效性和土壤難溶磷的利用率、減少磷肥投入、發(fā)揮我國有限磷礦的增產(chǎn)作用和農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展意義重大。 鑒于不同種類的溶磷菌或不同菌株之間的溶磷能力有較大差異，高效溶磷菌的篩選工作尤為重要。目前用于制作生物肥料的解磷菌劑普遍使用蛭石、草炭、珍珠巖和沸石粉等作為吸附載體，這些物質(zhì)皆為不可再生資源，如能尋求一種可再生資源，使其可以部分或完全代替目前常用的不可再生資源，不僅起到節(jié)約資源的作用，并能促進(jìn)農(nóng)業(yè)廢棄物的循環(huán)利用， 從而達(dá)到農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的目的。番石榴渣是番石榴加工過程的副產(chǎn)品，纖維含量高，作為吸附劑在去除廢水中染料和去除重金屬污染方面取得了顯著效果和應(yīng)用前景。番石榴渣外觀與微生物菌劑載體泥炭類似，質(zhì)地較輕顯褐棕色，番石榴渣含水量約4 5%，具有比泥炭 (含水量30%左右)含水量低的優(yōu)點(diǎn)。然而，使用可再生資源——番石榴渣作為生物肥吸附劑材料，代替常用的不可再生資源，制成具有高效解磷效果的菌劑，未曾見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種枯草芽孢桿菌。本發(fā)明的另一目的是提供上述菌株的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL-l，簡(jiǎn)稱HL-I菌。該菌株的分類命名為 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，已于2011年8月M日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5175，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。該菌株篩選自廣東省廣州市火爐山土壤中，為革蘭氏陽性菌，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h，在顯微鏡下觀察菌體以單個(gè)或成對(duì)排列，芽孢數(shù)量極少(3飛％)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)Mh，菌體以單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列，芽孢中生或近中生，芽孢數(shù) 80、0%，芽孢形成后菌體不膨大，菌體為桿狀，無莢膜，有運(yùn)動(dòng)性，需氧。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后形成的菌落為圓形，微黃色，表面粗糙不透明，邊緣不整齊。經(jīng)過序列測(cè)定，該枯草芽孢桿菌HL-I的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所不。由上述枯草芽孢桿菌HL-I制成的菌劑。枯草芽孢桿菌HL-I菌劑的制備方法，是將活化的菌株接種到種子培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度30°C、轉(zhuǎn)速113rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)24h后，得到一級(jí)種子液，然后按10 15%接種量轉(zhuǎn)接到種子罐培養(yǎng)，用二級(jí)種子培養(yǎng)基在30°C、通氣量1000L/h、轉(zhuǎn)速70rpm條件下培養(yǎng)Mh， 得到二級(jí)種子液，將二級(jí)種子液按1(Γ15%接種量接種到發(fā)酵罐，在發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)酵罐深層培養(yǎng)(即擴(kuò)大培養(yǎng))，培養(yǎng)條件為30°C、通氣量10000L/h、轉(zhuǎn)速70rpm，培養(yǎng)Mh。培養(yǎng)后的發(fā)酵液與硅藻土和番石榴渣混合，發(fā)酵液硅藻土 番石榴渣的質(zhì)量比為0.6:1:1 ；攪拌均勻后，粉碎，制備成所述菌劑。其中每IL種子培養(yǎng)基含有牛肉膏5g、蛋白胨5g、氯化鈉5g，余下為水，pH值 7. Γ7. 4 ；種子培養(yǎng)基經(jīng)過115 121°〇滅菌20min，備用。每IL 二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基含有豆粕粉30g、麥麩粉10g、硝酸銨1. 5g、 酵母膏3g、氯化鈉2. 5g、硫酸鎂0. 2g、磷酸氫二鉀0. 3g和硫酸錳0. 05g,余下為水，pH值 7.廣7. 4?？莶菅挎邨U菌HL-I菌劑的具體制備步驟如下 (1) 一級(jí)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基成分牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，蒸餾水1L，pH值7.廣7. 4。 培養(yǎng)基115 121°C滅菌20min，接入活化后的HL-I菌，搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)條件30°C，轉(zhuǎn)速 113rpm，時(shí)間 24h。(2) 二級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)
二級(jí)種子培養(yǎng)基成分豆粕粉30g，麥麩粉10g，硝酸銨1. 5g，酵母膏3g，氯化鈉2. 5g， 硫酸鎂0. 2g，磷酸氫二鉀0. 3g，硫酸錳0. 05g，水1L，調(diào)節(jié)pH值為7.廣7.4，121°C滅菌 20min,待降溫至30°C，接入一級(jí)種子液，接種比例為1:10 (10L 二級(jí)種子培養(yǎng)基接種IL 一級(jí)種子液)。設(shè)置發(fā)酵溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為70rpm，通氣量為10000L/h，罐壓保持在 0. 02 0. 03MPao(3)發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基成分同二級(jí)種子培養(yǎng)基。30°C時(shí)，接入二級(jí)種子液，接種比例為1:10。設(shè)置發(fā)酵溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為70rpm，通氣量為10000L/h，罐壓保持在0. 02 0. 03MPa。(4)吸附載體的添加
將步驟(3)培養(yǎng)后的菌液、硅藻土、番石榴渣按質(zhì)量比0.6:1:1在攪拌機(jī)內(nèi)混合均勻， 粉碎后制成菌劑。(5)菌劑的包裝和貯存
稱取菌劑分裝于鋁質(zhì)袋中，密封，存放于通風(fēng)干燥處。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌HL-I在分解難溶性磷、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或增加土壤微生物群落多樣性和增加微生物豐度中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，篩選出枯草芽孢桿菌ifeciBm subtilis HL-1。該菌株不僅可以提高土壤中難溶磷的有效性和磷肥利用率，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高土壤微生物多樣性，對(duì)減少化肥施用，改善土壤微生態(tài)和促進(jìn)土壤可持續(xù)利用具有重要的意義。以豆柏麥麩等為主要成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，具有制備工藝簡(jiǎn)單，效果好，成本低等優(yōu)點(diǎn)，并使用可再生資源——番石榴渣作為吸附載體，具有節(jié)約資源、變廢為寶、促進(jìn)農(nóng)業(yè)廢棄物的循環(huán)利用等優(yōu)點(diǎn)。


圖1. HL-I菌革蘭氏染色顯微照片；
圖2. HL-I菌芽孢染色顯微照片，圖中藍(lán)色部分為芽孢；
圖3.不同菌株在磷酸鈣培養(yǎng)基下產(chǎn)水溶性磷含量的對(duì)比圖，橫坐標(biāo)為菌株編號(hào)，縱坐標(biāo)為水溶性磷濃度；
圖4.不同菌株在磷酸鈣培養(yǎng)基下產(chǎn)微生物磷含量的對(duì)比圖，橫坐標(biāo)為菌株編號(hào)，縱坐標(biāo)為微生物磷濃度；
圖5.為HL-I菌促進(jìn)玉米生長(zhǎng)田間效果對(duì)比圖6.不同菌株處理土壤微生物群落代謝活性AWCD值變化的曲線圖，其中HL-I為HL-I 菌，CK為對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1枯草芽孢桿菌HL-I的分離、純化和鑒定 (1)分離
配制難溶無機(jī)磷培養(yǎng)基葡萄糖10. Og,硫酸銨0. 5g，氯化鈉0. 3g，氯化鉀0. 3g，七水硫酸亞鐵0. 03g,四水硫酸錳0. 03g，酵母膏0. 4g，磷酸鈣5g，蒸餾水1L，pH值7. 0 7· 5。以廣東省廣州市天河區(qū)火爐山上采集的土壤為篩選土樣，采用平板涂布法準(zhǔn)確稱取待測(cè)土樣10. 0g，放入裝有90mL無菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，搖床振蕩30min， 使微生物充分分散，靜置2(T30s，取上清液進(jìn)行10倍遞減稀釋，采用10，105稀釋度，用移液槍分別移取稀釋液0. lmL，涂布在難溶無機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，28°C倒置培養(yǎng)7d，逐日觀察溶磷圈，記錄溶磷菌菌落(d)和溶磷圈直徑(D)。篩選出有解磷圈的細(xì)菌菌株編號(hào)為a_4， a-7, a-15，和b-17，其中a-15的解磷效果最強(qiáng)。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定和生理生化鑒定后，確定a-15菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)。(2)純化
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，氯化鈉5. 0g，瓊脂18. 0g，蒸餾水lL，pH值 7. 0 7· 2。將篩選出的菌株利用平板劃線法純化后，保存于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，本發(fā)明中簡(jiǎn)稱HL-I菌。實(shí)施例2特性鑒定 (1)菌體形態(tài)特征
革蘭氏陽性菌，有芽孢，芽孢形成后菌體不膨大。菌體為桿狀，無莢膜，有運(yùn)動(dòng)性，需氧。 革蘭氏染色效果見圖1，菌體被染成藍(lán)紫色，芽孢未著色。芽孢染色效果見圖2，菌體呈黃棕色，芽孢為淺藍(lán)色。(2)菌落形態(tài)特征
在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落為圓形，微黃色，表面粗糙不透明，邊緣不整齊。(3)生理生化特性
根據(jù)Biolog微生物鑒定儀，分析此菌株在好氧條件下對(duì)31種不同碳源的利用情況，結(jié)果見表1。表1 HL-I菌對(duì)31種不同碳源的利用情況
特性結(jié)果特性結(jié)果水+甲基D-葡萄糖苷+D-半乳糖內(nèi)酯+D-半乳糖內(nèi)酯+丙酮酸甲脂+D-木糖+D-半乳糖醛酸+L-天冬酰胺酸+吐溫40+I-赤藻糖醇+羥苯甲酸—L-苯基丙氨酸+吐溫80—D-甘露醇4-羥基苯甲酸+L-絲氨酸+a-環(huán)式糊精+N-乙?；?D-葡萄胺+y-羥基丁酸+L-蘇氨酸+肝糖+D-葡萄胺酸+衣康酸+甘氨酰-L-谷氨酸+D-纖維二糖+葡萄糖-ι-磷酸鹽+a-丁酮酸+苯乙基胺+a-D-乳糖+D, L-a-甘油+D-蘋果酸+腐胺+
注+表示為陽性或可以利用；一表示為陰性或不能利用 (4)分子生物學(xué)特性
采用試劑盒法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物F63 (CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC, SEQ ID N0:2)和 R1087 (CTC GTTGCG GGA CTT ACC CC, SEQ ID N0:3)，PCR 擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA，在IOOObp附近出現(xiàn)明顯的條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行序列測(cè)定，將獲得的DNA序列輸入GenBank，以Blast程序?qū)?shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析，結(jié)
6果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株的16S rDNA序列和與GenBank中枯草芽孢桿菌具有較高的同源性，其相似度為99%。結(jié)合上述的平板菌落特征、Biolog微平板培養(yǎng)結(jié)果、16S rDNA序列的結(jié)果以及參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Mcillus sub tills ), 'bp'Bacillus subtil is HL—1。實(shí)施例3 HL-I菌在不同碳源環(huán)境下的生長(zhǎng)特性
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化鈉5g，水1000ml，pH為7. Γ7. 4。分別以玉米粉、麥麩、葡萄糖、花生麩、蔗糖、米糠和植物淀粉7種物質(zhì)作為碳源， 濃度均為20g/L，替代牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的牛肉膏，其它成分不變。將上述7種培養(yǎng)基煮沸l(wèi)Omin，自然降溫至室溫，用lmol/L的NaOH或者HCl調(diào)節(jié)pH值為7.廣7. 5，制備成發(fā)酵培養(yǎng)基。在250mL三角瓶中分裝各組培養(yǎng)基45mL，滅菌，各組培養(yǎng)基做三次重復(fù)。按照 10%的接種量將HL-I菌接種到上述滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度33°C，轉(zhuǎn)速113rpm條件下培養(yǎng)Mh，用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定各組培養(yǎng)基中的活菌數(shù)。結(jié)果表明(表2):HL-1菌在以麥麩為碳源的環(huán)境下，其生長(zhǎng)特性最佳，活菌數(shù)為5. 44士0. 22X 108cfu/mL。
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌HL-1，于2011年8月M日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 5175。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌HL-I，其特征在于其16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID N0:1 所示。
3.由權(quán)利要求1或2所述枯草芽孢桿菌HL-I制備成的菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于是由枯草芽孢桿菌HL-1、硅藻土和番石榴渣組成。
5.權(quán)利要求4所述菌劑的制備方法，其特征在于是將活化的菌株按1(Γ15%接種量接種到種子培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度30°C、轉(zhuǎn)速113rpm條件下，搖床培養(yǎng)Mh，得到一級(jí)種子液，然后按1(Γ15%接種量轉(zhuǎn)接到種子罐培養(yǎng)，用二級(jí)種子培養(yǎng)基在30°C、通氣量1000L/h、轉(zhuǎn)速 70rpm條件下培養(yǎng)Mh，得到二級(jí)種子液，將二級(jí)種子液按1(Γ 5%接種量接種到發(fā)酵罐，在發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，在30°C、通氣量10000L/h、轉(zhuǎn)速70rpm條件下培養(yǎng)Mh，培養(yǎng)后的發(fā)酵液加入硅藻土和番石榴渣，攪拌均勻，粉碎，制備成所述菌劑；其中每IL 一級(jí)種子培養(yǎng)基含有牛肉膏5g、蛋白胨5g、氯化鈉5g，余下為水，pH值 7. Γ7. 4 ；每IL 二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基含有豆粕粉30g、麥麩粉10g、硝酸銨1. 5g、酵母膏 3g、氯化鈉2. 5g、硫酸鎂0. 2g、磷酸氫二鉀0. 3g和硫酸錳0. 05g，余下為水，pH值7. Γ7. 4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于培養(yǎng)后的發(fā)酵液硅藻土番石榴渣的質(zhì)量比為0.6:1:1。
7.權(quán)利要求1或2所述枯草芽孢桿菌HL-I在分解難溶性磷中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述枯草芽孢桿菌HL-I在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述枯草芽孢桿菌HL-I在增加土壤微生物群落多樣性和增加微生物豐度中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌HL-1及其在土壤解磷方面的應(yīng)用。該菌株于2011年8月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)CGMCC No.5175，其16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。該枯草芽孢桿菌HL-1發(fā)酵液可以添加硅藻土和番石榴渣吸附劑材料制備成菌劑。該菌株能夠提高土壤磷的有效性和磷肥利用率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高土壤微生物多樣性，對(duì)減少化肥施用，改善土壤微生態(tài)和促進(jìn)土壤可持續(xù)利用具有重要的意義，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C05F11/08GK102399713SQ20111028265
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者孔德穎, 孫禮勇, 李永濤, 王亞君, 蔡燕飛, 趙肅清, 陳昊, 黃娟 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)