專利名稱：松材線蟲的冷凍保存及解凍方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及線蟲的冷凍保存方法，尤其涉及松材線蟲的程序化冷凍保存及解凍方法，屬于松材線蟲的冷凍保存領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
松材線蟲(Bursaphelenchus xyfolus)是松材線蟲病的病原物，屬于側(cè)尾腺口綱， 墊刃目，滑刃超科，滑刃科，傘滑刃線蟲屬。松材線蟲病又名松材線蟲萎蔫病、松樹萎蔫病、 松樹枯萎病，是松屬樹種的一種毀滅性的病害，因其危害嚴重且防治非常困難而被世界上許多國家列為檢疫對象。松材線蟲危害黑松(Pinusthunbergii)、赤松(Pdensiflosa)、馬尾松(Rmasso苗ana)、濕地松(P. elliottii)等多種松樹，被稱為松樹的“癌癥”。目前該病已分布于美國、加拿大、墨西哥、日本、中國、韓國、朝鮮、法國、尼日利亞和葡萄牙等多個國家，其中，在日本、中國、韓國的危害尤為嚴重。中國自1982年在南京中山陵風(fēng)景區(qū)首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來，至今已在江蘇、安徽、浙江、山東、廣東、上海、云南、湖北、湖南、江西、 貴州、重慶、臺灣和香港等地發(fā)生。松樹是中國的主要造林樹種且其中許多種類是感病的，全中國一半以上省份的氣候適合松材線蟲病的發(fā)生，在中國大部分地區(qū)具備成災(zāi)和流行的基本條件，是中國林業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)的心腹大患。自發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來，國內(nèi)外就展開了大量研究，一直在不斷地探索其防治措施。松材線蟲的低溫冷凍保存能夠充分利用并收集各種來源的松材線蟲， 可為松材線蟲的致病機理和生物防治技術(shù)的研究和應(yīng)用提供大量實驗材料，并且不受時間和空間的限制。線蟲種質(zhì)資源的提供與保存作為整個研究中最為基礎(chǔ)的一個環(huán)節(jié)，將受到人們越來越多的重視。對于松材線蟲，實驗室傳統(tǒng)的保存方法是通過在真菌上的連續(xù)接種繁殖得以實現(xiàn)，缺點很多，保存時間短，操作起來不僅費時、費力、占空間，而且人為因素的影響很容易造成線蟲間的交叉污染，影響實驗研究。因此，對松材線蟲有效長期保存的研究已是迫在眉睫。上個世紀初，科學(xué)家基本上肯定了生物成分(如精子和一些生物化學(xué)物質(zhì))能夠在零下溫度貯存的事實。隨著科學(xué)的發(fā)展，低溫冷凍保存的方法逐漸走進人們的視線。隨著松材線蟲病的危害逐步擴大，亟需更加深入的研究其致病機理和防治措施，為此，病原物松材線蟲的采集與保存作為研究的基礎(chǔ)也越來越受到重視。實驗室傳統(tǒng)保存方法是將松材線蟲連同培養(yǎng)基置于(4_8°C )冰箱中保存，雖然比較有效，但因受到溫度和濕度的限制，不能滿足商業(yè)化制劑的要求和需要，很難進入商品化生產(chǎn)階段，也由于人力和物力上的巨大消耗，難于在實驗室作為種質(zhì)資源長期保存的方法。 受細胞凍存的啟發(fā)，低溫凍存也開始應(yīng)用于線蟲學(xué)方面。為了尋找線蟲低溫保存技術(shù)，各國學(xué)者從十九世紀二十年代就開始進行低溫保存技術(shù)的研究。九十年代以后，科學(xué)家們更注重冷凍技術(shù)的研究，根據(jù)冷凍保護液在凍結(jié)后是否形成冰晶，凍存方法可分為玻璃化和非玻璃化兩種。玻璃化冷凍應(yīng)用高濃度的冷凍保護劑溶液在超速冷凍過程中形成一種極其粘稠的固化狀態(tài)，從而避免細胞內(nèi)冰晶形成。重要的是，玻璃化過程完全避免了冷凍細胞的在解凍直至恢復(fù)細胞生物活性中冰晶的形成。Nakagata用玻璃化冷凍法冷凍小鼠成熟卵母細胞并取得成功后，玻璃化冷凍法被廣泛的用于各種生物材料的冷凍保存研究。宋錦章等以食蚊羅索線蟲(Romanomermis culicicorax)為材料研究了感染期幼蟲的液氮保存，該項研究分別以不同濃度的二甲基亞礬(MDOS)、經(jīng)乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮等為冷凍保護劑，結(jié)果表明用1%、2.5%或5%的 DMS0，食蚊羅索線蟲感染期幼蟲在液氮保存125天后大部分復(fù)蘇存活，但存活的幼蟲完全喪失了感染能力(宋錦章，彭玉芳，E.GPlatze ，宋毅，低溫貯存羅索線蟲寄生前期幼蟲效果觀察.中國生物防治.1997，13(1) :14-16)。Annemie等用15%甘油，35%甲醇并添加0. 5M 的葡萄糖作為玻璃化液來冷凍保存香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)，獲得了 11.5% 的存活率(AnlIemieE. , Salvador FV Tom Vff. , etal. , CryoPreservation of Radopholus similis, a tropical Plant-parasitic nematode. Cryobiology55(2007) 148-15)。非玻璃化法即緩凍法，又可以稱為程序化冷凍法或程序降溫法，就一個嚴格的程序化冷凍降溫程序而言，它包括從室溫降溫至植冰溫度的速率、植冰溫度、植冰后平衡時間、下降到投液氮時的溫度及降溫速率等環(huán)節(jié)，任何一個環(huán)節(jié)改變，其降溫程序就不同了。 程序化降溫法分為慢速冷凍法和快速冷凍法。慢(快)速冷凍法是通過冷凍程序儀來控制其降溫速率，一般以l°c /min左右的速率降至-7°c左右時，進行人工誘導(dǎo)結(jié)晶，再以 0. 1-1. O0C /min的速率降至-30—40°C (快速冷凍)或者_80°C (慢速冷凍)時，投入液氮中保存。關(guān)于線蟲的冷凍保存研究中，緩凍法目前多采用的是“兩步(或三步)降溫法”，它是指將置有生物材料的水溶液，分兩個步驟由室溫降至液氮溫度，第一步是先慢速冷卻至中間的某一溫度；第二步是將其直接置入液氮，其相應(yīng)的冷卻速率較高些。其機理為第一步冷卻的目的是在保證不形成胞內(nèi)冰、不產(chǎn)生共析現(xiàn)象、不使未凍水份額過低的前提下，逐漸降溫，提高未凍溶液中保護劑的濃度，使此步驟中保護劑的濃度能達到玻璃化溶液的要求；第二步冷卻的目的是利用較高的冷卻速率，使高濃度保護劑實現(xiàn)非晶態(tài)固化，達到低溫保存的目的。程序化冷凍因為所需保護劑濃度較低，毒性傷害小，對保護劑的要求較低，其決定效果主要就在于冷凍處理的程序。除此之外，其它與冷凍有關(guān)的預(yù)處理時間、被冷凍線蟲條件以及稀釋液等也是冷凍效果好壞的影響因素。程序降溫凍存法因為不必使用高濃度的保護劑，減少了保護劑的毒性傷害，從而提高了存活率；同時，精確的控溫程序可大量減少人工操作造成的失誤。程序降溫法是一種慢速降溫冷凍模式，不可避免的會產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶，使生物材料受到損傷。程序化冷凍時，如果操作不當(dāng)，很容易造成溶液溫度在短時間內(nèi)的升降，損傷生物細胞。合適的降溫程序，不形成對細胞足以造成傷害的大冰晶，細胞將不會受到致死性損害，存活率的降低也會得到控制。因此，程序化冷凍法的研究重點是設(shè)計一種完全符合生物材料特性的降溫程序，使其最大限度的避免大冰晶的形成，提高生物材料的存活率。隨著松材線蟲病的危害逐步擴大，亟需更加深入的研究其致病機理和防治措施， 為此，病原物松材線蟲的采集與保存作為研究的基礎(chǔ)也越來越受到重視。目前，國內(nèi)外關(guān)于松材線蟲致病機理、防治途徑以及傳播方式等方面的研究很多，但是在種質(zhì)資源的長期保存方面還未見報道，國外也僅有零星報道，但由于處理方法與實驗條件各不相同，不同文獻資料上的結(jié)果存在很大差異，即使是相同的處理方法，也得到不同的結(jié)論，所以，對松材線蟲的冷凍保存需要更為系統(tǒng)的研究以提高冷凍保存后的松材線蟲的存活率和繁殖能力

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種松材線蟲的程序化冷凍保存方法，該冷凍保存方法所保存的松材線蟲解凍復(fù)蘇后存活率高、繁殖能力強。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種松材線蟲的程序化冷凍保存及解凍方法，包括預(yù)處理松材線蟲懸液；將預(yù)處理后的松材線蟲懸液中加入冷凍保護劑，平衡；平衡處理后的松材線蟲懸液程序化降溫后冷凍保存；解凍復(fù)蘇。本發(fā)明根據(jù)過冷現(xiàn)象的原理，采用程序化冷凍法對松材線蟲進行冷凍，設(shè)計了多組程序化降溫程序(包括快速冷凍和慢速冷凍的相關(guān)降溫程序)，以篩選最合適的降溫程序。試驗結(jié)果表明，采用以下步驟進行程序化降溫能夠有效提高凍后線蟲的存活率和繁殖率(1)以1°C /min的降溫速率將松材線蟲懸液從4°C降溫至_6°C ； (2)再以20°C /min的降溫速率降溫至-40°C; (3)以10°C /min的升溫速率升溫至-20°C; (4)以1-0. 5°C /min的速率將松材線蟲懸液降溫至_45°C后迅速投入液氮中進行保存；其中，在上述步驟(4)中將松材線蟲懸液以1°C /min的速率從_20°C降溫至_45°C 然后迅速投入液氮更有利于提高凍后線蟲活率，解凍復(fù)蘇后線蟲存活率顯著高于其它降溫程序的存活率(P < 0. 05)。在程序化冷凍時，過冷現(xiàn)象很容易發(fā)生，如果溫度設(shè)計不當(dāng)，就會造成溶液溫度在短時間內(nèi)的升降，損傷線蟲細胞，造成死亡。目前，為了避免過冷現(xiàn)象的發(fā)生，通常是在-3°C _7°C下對保護液誘發(fā)結(jié)晶，即撒入晶核或進行震蕩。但是傳統(tǒng)的程序降溫儀植冰過程十分復(fù)雜，很難達到大規(guī)模制作的目的。在大多數(shù)情況下，細胞的過冷程度比周圍溶液更深，這就使細胞外溶液先結(jié)冰，細胞外液未凍結(jié)部分的溶液濃度升高，細胞外液的滲透壓增力口，從而使細胞內(nèi)水分滲出。如果降溫足夠慢的話，可以通過脫水來維持細胞內(nèi)外環(huán)境滲透壓平衡，使胞質(zhì)內(nèi)更多的水分有足夠的時間滲出，在細胞外凍結(jié)但是如果降溫過慢，細胞長時間處于高滲環(huán)境中，就會對細胞產(chǎn)生滲透休克；如果降溫過快，細胞內(nèi)水分又來不及滲出而在細胞內(nèi)形成冰晶，胞漿內(nèi)結(jié)冰過多會破壞細胞器，導(dǎo)致細胞死亡，而且冰晶使細胞質(zhì)濃縮，導(dǎo)致蛋白質(zhì)脫水變性破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生不可逆的變化而導(dǎo)致細胞的死亡。 實際上，在程序化冷凍過程中，細胞內(nèi)形成冰晶是不可避免的，關(guān)鍵是所形成冰晶的大小和數(shù)量。只要不形成對細胞足以造成傷害的大冰晶，而是維持在微晶狀態(tài)，細胞將不會受到致死性損害。因此，根據(jù)生物材料的具體情況，盡力調(diào)和滲透壓損傷和冰晶損傷這一矛盾，選擇最佳的降溫速率、適當(dāng)?shù)膬銮邦A(yù)處理和合適的冷凍保護劑組合是利用程序冷凍法獲得生物材料冷凍保存最佳效果的關(guān)鍵。預(yù)處理方式對松材線蟲的存活率影響很大，本發(fā)明為了摸索到最適宜的預(yù)處理方式以提高松材線蟲的存活率，本發(fā)明通過試驗對預(yù)處理方式(包括)進行了摸索和優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，經(jīng)過預(yù)處理能夠提高線蟲的冷凍存活率，其中，采用以下預(yù)處理措施能夠有效提高線蟲的存活率向松材線蟲懸液中加入甘油至甘油在松材線蟲懸液的終濃度為 5-10% (ν/ν)，放置1-3天；更優(yōu)選的，向松材線蟲懸液中加入甘油至甘油在松材線蟲懸液的終濃度為5% (ν/ν)，室溫(20-25°C )放置1天。冷凍保護劑的組成及其濃度是決定松材線蟲冷凍效果的關(guān)鍵因素之一。本發(fā)明以乙二醇(EG)和甘油(GL)作為冷凍保護劑的成分以考察它們作為冷凍保護劑的效果。根據(jù)試驗結(jié)果可見，隨著保護劑濃度的提高，單一 GL的冷凍效果始終顯著優(yōu)于EG以及由EG+GL 組成的混合液，其中，濃度為10% (ν/ν)的GL冷凍效果最佳，冷凍保存后的存活率達到 50. 9士3. 2%，略高于15% GL組的冷凍存活率(49. 6士3. 4% )，但二者多重比較無顯著性差異?？倽舛葹?% (ν/ν)的由EG+GL組成的混合液的冷凍效果最差，其線蟲凍后存活率僅為 20 1 士5. 4%。根據(jù)試驗可見采用10% -15% GL(ν/ν)再添加0. 25Μ蔗糖作為程序化冷凍保護劑的效果為最好。松材線蟲冷凍前經(jīng)過一個平衡處理的過程可使蟲體脫水以防止冷凍過程中冰晶的形成，減少冰晶損傷。在平衡處理過程中也要防止高滲透壓造成過度脫水而產(chǎn)生的溶液損傷。因此，線蟲凍前平衡時間的選擇既要保證脫水程度不至于形成冰晶，又不能長時間平衡造成溶液損傷和毒性傷害。本發(fā)明通過大量試驗發(fā)現(xiàn)，在對預(yù)處理后的松材線蟲懸液采用程序化降溫冷凍前，經(jīng)過不同時間來平衡的線蟲存活率差異顯著。其中，松材線蟲懸液在冷凍保護劑中4°C平衡l_3h后，尤其是平衡2-3h后再進行程序化降溫冷凍，解凍復(fù)蘇后的線蟲存活效果為最好。松材線蟲的冷凍保存的關(guān)鍵因素除了程序化冷凍速率和冷凍保護劑外，解凍方式和解凍溫度也直接影響著復(fù)蘇后的存活率。在許多情況下，細胞能在最佳冷卻速率降至一 196°C長期保存，但卻極可能在升溫過程中遭受損傷而死亡，能夠迅速越過危險溫區(qū)的解凍速率是影響線蟲存活的一個重要因素。解凍的過程就是冷凍材料和外界環(huán)境進行熱交換的過程，當(dāng)冷凍管內(nèi)材料吸收熱量達到冰點以上時，即由固相變?yōu)橐合?，在這個過程，蟲體細胞內(nèi)外伴隨有冰晶重新排列與再結(jié)晶。因此最大限度的縮短這段時間(危險溫區(qū)-10-60°C )，可以把冰晶大小降低到最小，從而減少冰晶對蟲體的機械損傷，提高存活率。為了摸索出最適宜的解凍方式以最大程度的提高存活率和繁殖能力，本發(fā)明研究了濕解凍和干解凍兩種方法，并選用了 20°C、30°C、4(TC、5(rC和60°C五種解凍溫度。結(jié)果表明， 兩種方法解凍后的線蟲存活率差異極顯著。干解凍后的線蟲存活率明顯極低，且不受解凍溫度變化的影響。而通過水浴解凍，線蟲存活率受解凍溫度的影響較大，解凍溫度為40°C 水浴時，線蟲的存活率最高，達到42. 2士7. 3% ;50°C水浴解凍的線蟲存活率低于40°C組，為 27. 2士8. 3%，二者多重比較不在同一水平；20°C和60°C之間差異不顯著，在水浴解凍中存活率最低，僅為10. 5士5. 2%和9. 8士2.7%，但仍然明顯高于干解凍方式。結(jié)果表明，干解凍法不適于松材線蟲低溫保存的解凍方法；采用40°C -50°C的溫度進行水浴解凍的效果較好，其中，采用40°C水浴解凍對松材線蟲的冷凍效果影響最好。松材線蟲經(jīng)過冷凍后能否再繁殖是檢驗冷凍成功的標(biāo)準之一。本試驗中經(jīng)過冷凍的線蟲大部份都能再繁殖生長，從試驗結(jié)果可以看出，再繁殖培養(yǎng)的線蟲冷凍效果沒有變化，與最初收集的線蟲差異不顯著，不同株系之間的冷凍效果也沒有顯著差異。不同種屬的松材線蟲采用本發(fā)明的冷凍保存方法均獲得了良好的存活率和繁殖率。本發(fā)明松材線蟲的程序化冷凍保存及解凍方法能顯著提高松材線蟲的存活率和繁殖能力，能適用于不同株系松材線蟲的冷凍保存。


圖1預(yù)處理方式對松材線蟲存活率的影響試驗結(jié)果。圖2平衡時間對松材線蟲冷凍效果的影響試驗結(jié)果。圖3不同降溫程序?qū)λ刹木€蟲冷凍效果的影響試驗結(jié)果。圖4不同保護劑對松材線蟲程序化冷凍效果的影響試驗結(jié)果。圖5解凍方式對松材線蟲存活率的影響。圖6玻璃化冷凍松材線蟲不同株系的冷凍效果。圖7程序化冷凍次數(shù)對松材線蟲冷凍效果的影響。圖8線蟲的凍后繁殖情況；a.線蟲懸液接種于長滿盤多毛孢的PDA平板，放入 25°C培養(yǎng)箱中(左為凍存后收集的線蟲，右為未經(jīng)冷凍的線蟲)；b. 3天后的繁殖情況； c. 一周后的繁殖情況；d. 10天后的繁殖情況；e.兩周后的繁殖情況。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。1、主要溶液的配制1. 1冷凍保護液GL, EG, DMSO用無菌水分別配制成40%濃度的溶液；再按1 1的比例兩兩混合配制成總濃度為40%的混合溶液；0. 5M和0. 25M的蔗糖與海藻糖溶液。各種溶液經(jīng)過滅菌后置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 2稀釋液林格氏液(氯化鈉8g/L，氯化鉀0. 2g/L，氯化鈣0. 2g/L，碳酸氫鈉0. 2g/L)，無菌水和0. IM蔗糖。高壓滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 3預(yù)處理液GL和EG用無菌水分別配制成濃度為10%、20%和30 %的溶液，高壓滅菌保存?zhèn)溆谩?. 4線蟲懸液采用貝爾曼漏斗法分離實驗室純培養(yǎng)保存的松材線蟲，將獲得的線蟲接種到長滿盤多毛孢的PDA平板上，25°C培養(yǎng)5-6d，線蟲大量繁殖，再用貝爾曼漏斗法分離線蟲，此時得到的線蟲中，幼蟲占絕大多數(shù)(70% -80% )0將收集到的線蟲懸液箱保存?zhèn)溆谩?、試驗方法2. 1線蟲懸液混均計數(shù)法將分離收集得到的松材線蟲(分別采自貴州大平子、四川廣安或湖北宜昌)懸液進行濃縮(約5000條/ml)，取裝有IOml線蟲懸液的指形管，蓋緊瓶蓋，上下?lián)u晃均勻，從中吸取IOOul移置在凹玻片上，在解剖鏡下計數(shù)液滴中的線蟲數(shù)量，重復(fù)5次，根據(jù)平均值計算出IOOul懸液中的線蟲數(shù)量，再乘以10倍即為該線蟲懸液的濃度。2. 2線蟲的冷凍
線蟲混合預(yù)處理液在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ld，再放入冷凍管中經(jīng)過冷凍保護液處理，通過不同的降溫方式，迅速投入液氮罐中，保存24h。2. 3線蟲的解凍與稀釋將冷凍管從液氮罐中迅速取出，移至恒溫水浴鍋中劇烈振蕩50-60S，待管中結(jié)冰完全融化立即加入稀釋液。2. 4線蟲的復(fù)蘇與鏡檢將稀釋后的線蟲懸液放入25°C恒溫箱中培養(yǎng)ld，解凍復(fù)蘇后的線蟲取50ul于凹玻片上靜置5min，通過解剖鏡的光熱以及挑針的物理刺激觀察線蟲的扭動彎曲情況(活力級別分為強、弱和死亡)，以解凍后線蟲能否活動作為存活與否的標(biāo)準來計算總體的存活率 (存活率計算公式存活率=存活后具活力的線蟲數(shù)/線蟲總數(shù)X 100% )。再通過觀察計算出幼蟲存活率，挑出全部成蟲于倒置顯微鏡下鑒別雌雄，并計算各自存活率。2. 5冷凍時間對線蟲的影響采用同樣的處理方式在液氮中冷凍保存一批線蟲，分別在ld、7d、30d、60d和90d 后取出樣品進行解凍，分別統(tǒng)計凍后線蟲的存活率，觀察線蟲經(jīng)過長期冷凍后的存活率變化。2. 6不同株系線蟲的冷凍效果采用同樣的冷凍和解凍方式，以貴州株系作為對照，冷凍保存線蟲的不同株系廣安和宜昌株系，同時將冷凍后繁殖培養(yǎng)的貴州株系再進行冷凍保存，解凍復(fù)蘇后分別統(tǒng)計線蟲的幼蟲、雌蟲和雄蟲的存活率。2. 7凍后線蟲的繁殖效果將沒有經(jīng)過冷凍的線蟲與凍后復(fù)蘇的線蟲接種于長滿盤多毛孢的PDA平板上，隔天進行觀察記錄，對比其繁殖情況。2. 8統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)均通過SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準差 (X 士 SD)來表示，每組試驗5個重復(fù)。試驗例1不同預(yù)處理方式對松材線蟲存活率的影響試驗分別采用乙二醇(EG)或甘油(GL)作為冷凍保護劑，用無菌水將其配制成低濃度的預(yù)處理液，然后將線蟲懸液與不同濃度的預(yù)處理液在指形管中等體積混合，混合后的濃度分別為5%、10%和15%，于25°C恒溫箱中培養(yǎng)Id。將經(jīng)過預(yù)處理和未經(jīng)處理的線蟲懸液與等體積40%的冷凍保護劑在2ml冷凍管中混合，采用上述試驗的平衡、冷凍、解凍和復(fù)蘇方式，統(tǒng)計存活率。以無菌水處理的線蟲作為空白對照。從試驗結(jié)果可見，預(yù)處理對松材線蟲的存活率影響很大(圖1)經(jīng)5%的EG或GL 處理Id的線蟲，其存活率僅略低于CK組，分別為87. 7士2. 8%和91. 0士 1. 8%，兩者多重比較處于同一水平。隨著預(yù)處理液濃度的增高，線蟲的存活率降低，當(dāng)EG濃度為15%時，線蟲存活率最低，為64. 4士3. 5% ；而在冷凍保護劑中平衡后，線蟲的存活率有明顯下降，經(jīng)5% GL預(yù)處理的線蟲在平衡后存活率最高，達到67. 1 士6. 4%，顯著高于CK組，15% EG組的存活率仍然最低，為54. 4 士 3. 3%，其余各試驗組之間差異不顯著。經(jīng)過液氮冷凍保存后，5% GL組的線蟲存活率仍然最高，為36. 5士4. 0%，顯著高于對照組和其它試驗組。試驗結(jié)果表明，經(jīng)過預(yù)處理能夠提高線蟲的冷凍存活率，其中，在5% GL中預(yù)處理Id的松材線蟲進行冷凍，凍后效果最好。試驗例2不同平衡時間對松材線蟲冷凍效果的影響試驗將5ml線蟲懸液與等體積40%冷凍保護劑GL混合于指形管中，4°C冰箱平衡，分別在lh、2h、3h、4h和5h后取400ul混合液移至2ml冷凍管中，冷凍和解凍復(fù)蘇步驟同上，統(tǒng)計線蟲存活率。以無菌水處理的線蟲作為空白對照。試驗結(jié)果見圖2。試驗結(jié)果顯示了平衡不同時間的松材線蟲存活率?？梢姡诶鋬銮?，經(jīng)過不同時間來平衡的線蟲存活率差異顯著，隨著平衡時間的增加而降低，平衡時間越短，線蟲的活率越高，lh-5h平衡后的線蟲存活率分別為71. 9士3. 0%、68. 5士2. 8%、 62. 0士4. 0%、58. 3士3. 5%和56. 2士2. 5% ；而冷凍后的線蟲存活率以試驗組2h和3h最高， 分別達到32. 1 士7. 9%和32. 6士6. 0%，與其他試驗組相比差異顯著，但二者間多重比較處于同一水平。由此表明，線蟲在平衡2-3h后進行冷凍，凍后效果最好。試驗例3降溫程序的設(shè)計與篩選本試驗根據(jù)慢速和快速降溫的原理，設(shè)計了 7組降溫程序，以低濃度的甘油 (10% ) +0. 25M蔗糖作為冷凍保護劑，按照所設(shè)計的7組降溫程序?qū)€蟲進行冷凍保存24h， 解凍復(fù)蘇后統(tǒng)計線蟲的存活率，對比篩選出最合適的降溫程序。7組降溫程序程序1 在4°C以1°C /min的速率直接降溫至_45°C，迅速投入液氮；程序2 在4°C以0. 5°C /min的速率直接降溫至_45°C，迅速投入液氮；程序3 在4 °C以1 °C /min的速率降溫至_6 °C，再以20 V /min的速率降溫至-30°C，在_30°C保持IOmin后以10°C /min的速率升溫至_20°C，最后以1°C /min的速率降溫至-45 °C，迅速投入液氮；程序4 在4 °C以1 °C /min的速率降溫至_6 °C，再以20 V /min的速率降溫至_40°C，在_40°C保持IOmin后以1°C /min的速率降溫至_45°C，迅速投入液氮；程序5 在4 °C以1 °C /min的速率降溫至_6 °C，再以20 V /min的速率降溫至_40°C，然后10°C /min的速率升溫至_20°C，最后以1°C /min的速率降溫至_45°C，迅速投入液氮；程序6 在4 °C以1 °C /min的速率降溫至_6 °C，再以20 V /min的速率降溫至_40°C，然后以10°C /min的速率升溫至_20°C，最后以0. 5°C /min的速率降溫至_45°C， 迅速投入液氮；程序7:在4°C以1°C /min的速率降溫至_6°C，再以10°C /min的速率降溫至-40°C，最后以1°C /min的速率降溫至_80°C，迅速投入液氮；由圖3可見，程序5的冷凍效果最佳，線蟲凍后活率達到45. 6士4. 7%;程序6的冷凍效果略低于程序5，線蟲凍后活率為39. 4士5. 1%，但與程序5多重比較處于同一水平；程序2的冷凍效果最差，線蟲存活率僅為12. 6士4. 0%，與程序3相比沒有明顯差異，但與其他程序組差異顯著。試驗結(jié)果表明，采用降溫程序5(在4°C以1°C /min的速率降溫至_6°C， 再以20°C /min的速率降溫至_40°C，然后以10°C /min的速率升溫至-20°C，最后以1°C / min的速率降溫至_45°C迅速投入液氮)進行程序化降溫的冷凍效果為最佳。試驗例4程序化冷凍保護劑的篩選本試驗選用毒性較弱、冷凍效果較好的GL、EG及二者的組合為冷凍保護劑。根據(jù)程序化冷凍的原理，采用較低濃度的保護劑并添加0. 25M的蔗糖對線蟲進行冷凍保存。試驗共10組，三種保護劑分別以5%、10%和15%的濃度進行冷凍，采用試驗例3所優(yōu)選出的降溫程序(程序5)，解凍復(fù)蘇后觀察統(tǒng)計線蟲的存活率。再以無菌水處理的線蟲作為空白對照。①EG+0. 25M 蔗糖②GL+0. 25M 蔗糖③EG+GL+0. 25M 蔗糖在篩選玻璃化冷凍保護劑的基礎(chǔ)上，僅用EG和GL作為保護劑進行研究，如圖4 所示，隨著保護劑濃度的提高，單一 GL的冷凍效果始終顯著優(yōu)于EG與EG+GL混合液，濃度為10%的GL冷凍效果最佳，存活率達到50. 9士3. 2%，略高于15% GL組的冷凍存活率 49. 6 士 3. 4 %，但二者多重比較無顯著性差異?？倽舛葹? %的EG+GL冷凍效果最差，其線蟲凍后存活率僅為20. 1 士5. 4%。試驗結(jié)果表明，混合保護劑的冷凍效果并沒有得到提升，最終發(fā)現(xiàn)10% -15% GL再添加0. 25M蔗糖作為程序化冷凍保護劑的效果為最好。試驗例5不同株系線蟲的冷凍效果在上述試驗例1-4的基礎(chǔ)上，本試驗以貴州大平子株系松材線蟲為材料，采用程序化法對其進行冷凍保存，復(fù)蘇統(tǒng)計時分別統(tǒng)計線蟲總體、幼蟲、雌蟲和雄蟲的存活率，對不同蟲齡線蟲的冷凍效果進行比較；再將凍后繁殖培養(yǎng)的線蟲分離收集，繼續(xù)通過兩種冷凍法進行冷凍保存，解凍復(fù)蘇后觀察統(tǒng)計線蟲的存活率，比較初次冷凍與二次冷凍的線蟲存活率；同時，將四川廣安和湖北宜昌株系的線蟲進行玻璃化冷凍，比較不同株系線蟲的冷凍效果。圖6顯示了程序化法對不同蟲齡線蟲的冷凍效果，其存活率的變化趨勢與玻璃化法的冷凍存活率變化相似，幼蟲的存活率最高，達到53. 6士4. 3%，總體的存活率略低，為 49. 7士3. 7%，但二者差異不顯著，雄蟲和雌蟲的存活率則顯著較低，分別為37. 2士4. 6和 38. 8士7. 5;與玻璃化法的冷凍結(jié)果相比，程序化冷凍后的幼蟲存活率較高，但多重比較處于同一水平，而雄蟲和雌蟲的存活率則顯著高于玻璃化冷凍結(jié)果。圖5和6還顯示了經(jīng)過初次冷凍后再培養(yǎng)收集的線蟲進行冷凍的效果，可見玻璃化法和程序化法二次冷凍的效果與初次冷凍相比無顯著性差異，幼蟲的存活率分別為 48. 7士 11. 7%、50. 7士7. 6%與52. 7士5. 7%、53. 6士4. 3%。結(jié)果表明，程序化冷凍松材線蟲幼蟲的冷凍效果最好，且結(jié)果穩(wěn)定；二次冷凍的效果與初次冷凍相比沒有顯著差異，線蟲凍后能夠進行再繁殖，且不影響后代的冷凍效果。試驗例6不同解凍方式和解凍溫度對松材線蟲冷凍效果的影響試驗在上述試驗例1-4的基礎(chǔ)上，本試驗共分5組，以不同的解凍溫度和方式對冷凍 24h的線蟲進行解凍。分別為20°C ,3040°C，50°C和60°C的水浴解凍和烘箱干熱解凍。 兩種方式的解凍時間均以冷凍管中的冰晶完全融化為準，解凍復(fù)蘇后觀察統(tǒng)計線蟲的存活率。從試驗結(jié)果來看，解凍方式不同，對線蟲凍后存活率的影響也大有不同，如圖7所示。從圖7中可以看出，干解凍后的線蟲存活率明顯極低，且不受解凍溫度變化的影響。而通過水浴解凍，線蟲存活率受解凍溫度的影響較大，解凍溫度為40°C水浴時，線蟲的存活率最高，達到42. 2士7. 3% ；50°C水浴解凍的線蟲存活率低于40°C組，為27. 2士8. 3%，二者多重比較不在同一水平；20°C和60°C之間差異不顯著，在水浴解凍中存活率最低，僅為 10. 5士5. 2%和9. 8士2. 7%，但仍然明顯高于干解凍方式。結(jié)果表明，干解凍法不適于松材線蟲低溫保存的解凍方法；40°C水浴解凍對松材線蟲的冷凍效果影響最好。試驗例7冷凍后的繁殖情況試驗取解凍復(fù)蘇后的存活的線蟲制成濃度為500條/ml的線蟲懸液，每個多毛孢平板上接種400ul，即每個平板接種200條，取相同濃度的未經(jīng)冷凍保存的線蟲懸液作為對照。2 周收集分離多毛孢上的線蟲，計數(shù)。由于冷凍保存后的線蟲進入新陳代謝降至最低點的休眠狀態(tài)，復(fù)蘇后，生長繁殖速度比未經(jīng)冷凍的線蟲慢。因此IOd時，對照中的多毛孢已經(jīng)全部被線蟲吃完，而冷凍處理過的皿中，多毛孢只吃掉1/2，14d后冷凍處理過的皿中多毛孢全部吃完(圖8)。表1線蟲的凍后繁殖情況
權(quán)利要求
1.一種松材線蟲(Bursaphelenchus xyfolus)的程序化冷凍保存及解凍方法，包括以下步驟(1)預(yù)處理松材線蟲懸液；(2)預(yù)處理后的松材線蟲懸液中加入冷凍保護劑，平衡處理；(3)平衡處理后的松材線蟲懸液程序化降溫后冷凍保存；(4)解凍復(fù)蘇；其特征在于， 所述的程序化降溫的程序如下以1°C /min的降溫速率將平衡處理后的松材線蟲懸液從 4°C降溫至_6°C ；再以20°C /min的降溫速率降溫至-40°C ；以10°C /min的升溫速率升溫至-20°C;最后以1-0. 5°C /min的降溫速率將松材線蟲懸液從_20°C降溫至_45°C后迅速投入液氮中進行冷凍保存。
2.按照權(quán)利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特征在于所述的程序化降溫的程序如下以1°C /min的降溫速率將平衡處理后的松材線蟲懸液從4°C降溫至_6°C ； 再以20°C /min的降溫速率降溫至-40°C ；以10°C /min的升溫速率升溫至-20°C ；最后以 I0C /min的降溫速率將松材線蟲懸液從-20°C降溫至_45°C后迅速投入液氮中進行冷凍保存。
3.按照權(quán)利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特征在于按ν/ν計，步驟 (1)中所述的預(yù)處理是向松材線蟲懸液中加入甘油至甘油的終濃度為5-10%，放置1-3天。
4.按照權(quán)利要求3所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特征在于，步驟(1)中所述的預(yù)處理是向松材線蟲懸液中加入甘油至甘油的終濃度為5%，放置1天。
5.按照權(quán)利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特征在于，步驟(2)中所述冷凍保護劑在松材線蟲懸液中的組成成分及終濃度為按ν/ν計，10%-15%甘油+ 0. 25Μ蔗糖。
6.按照權(quán)利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特征在于步驟(2)中所述的平衡時間為l_3h。
7.按照權(quán)利要求6所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特征在于步驟(2)中所述的平衡時間為2-3h。
8.按照權(quán)利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特征在于步驟(4)中所述的解凍復(fù)蘇是在40°C -50°C的溫度進行水浴解凍。
9.按照權(quán)利要求8所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特征在于步驟(4)中所述的解凍復(fù)蘇是在40°C的溫度進行水浴解凍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種松材線蟲的冷凍保存及解凍方法，屬于線蟲的冷凍保存領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括以下步驟(1)預(yù)處理松材線蟲懸液；(2)預(yù)處理后的松材線蟲懸液中加入冷凍保護劑，平衡處理；(3)平衡處理后的松材線蟲懸液程序化降溫后冷凍保存；(4)解凍復(fù)蘇；所述的程序化降溫的程序如下以1℃/min的降溫速率將松材線蟲懸液從4℃降溫至-6℃；再以20℃/min的降溫速率降溫至-40℃;以10℃/min的升溫速率升溫至-20℃；最后以1-0.5℃/min的速率將松材線蟲懸液降溫至-45℃后投入液氮中保存。本發(fā)明冷凍保存及解凍方法能顯著提高松材線蟲的存活率和繁殖能力，能適用于不同株系松材線蟲的冷凍保存。
文檔編號A01N1/02GK102428909SQ20111028263
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者朱天輝, 樸春根, 李永, 李沁, 林彩麗, 汪來發(fā), 王曦茁, 田國忠, 郭民偉 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所