專利名稱：一種獲得胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高的高羊茅種子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲得胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高的高羊茅種子的方法。
背景技術(shù)：
建立高效簡便的再生體系對通過基因工程的方法獲得具有實際應(yīng)用價值的草坪草至關(guān)重要。從上個世紀70年代至今經(jīng)過幾十年的研究，大多數(shù)重要草坪草都建立了再生體系，并且也已經(jīng)建立了遺傳轉(zhuǎn)化體系，目前已經(jīng)朝著改良草坪草抗逆性、抗病蟲害等具有實際應(yīng)用價值的方向發(fā)展(Creemer MT, Loeffe JPM, Zaal MACM (1998). Isolation culture and regeneration of Lolium perenne and Lolium multif lorum protoplasts. Curr Plant Sci Biotech Agric，7 (I):53 54 ;Dalton SJ (1988). Plant regeneration from cell suspension protoplasts of Festuca arundinacea Schreb.， Lolium perenne L. and L. multiflorum. Plant Cell Tiss Orgj 12:137 140; Spangenberg G，Wang Z-Yj Nagel J et al (1994). Protoplast culture and generation of transgenic plants in red fescue (Festuca rubra L.). Plant Sci.，97:83 94 ; Takamizo T， Suginobu KIj Ohsugi R (1990). Plant regeneration from suspension culture-derived protoplasts of tall fescue (Festuca arundinacen Schreb.) of a single genotype [J]. Plant Scij 72(I):125 131 ;Wang Z-Yj Nagel J，Potrykus I (1993). Fertile plant regeneration from protoplasts of meadow fescue (Festuca pratensis Huds.). Plant Cell Reports, I(12) :95 100 ;Asano Y and Sugiura K (1990). Plant regeneration from suspension culture-derived protoplasts of Agrostis alba L. (redtop). Plant Scij 72(I):267 273 ;Terakawa T，SatoTj Koike M (1992). Plant regeneration from proto-plasts isolated from embryogenic suspension cultures of creeping bentgrass (Agrostis palustris Huds.). Plant Cell Reports, 11(I):457 461 ;Zhong H，Srinivasan C，Sticklen M B (1991). Plant regeneration via somatic embryogenesis in creeping bentgrass (Agrostis palustris Huds·)· Plant Cell Reports, 10(1): 453 456 ;)。目前在草坪草上獲得成功的再生體系主要有愈傷組織再生系統(tǒng)，懸浮細胞再生系統(tǒng)，原生質(zhì)體再生系統(tǒng)、直接分化再生系統(tǒng)等。雖然如高羊茅，黑麥草等幾大類草坪草都建立了比較有效的再生體系，但是也存在著諸多的問題。在草坪草的轉(zhuǎn)基因研究中，愈傷組織和胚性懸浮細胞是最常用的轉(zhuǎn)化受體。由于高羊茅等草坪草種子的高度異質(zhì)性，愈傷組織再生系統(tǒng)面臨的一個巨大問題就是胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低，出現(xiàn)具有強烈分化能力的愈傷組織塊極少，這給遺傳操作帶來了不可避免的重復(fù)工作和勞動量。胚性細胞懸浮再生系統(tǒng)雖然在一定的時間內(nèi)能夠大量獲得胚性愈傷組織，但是其實際操作繁瑣，并且前期需要極高的對胚性愈傷組織的鑒別力，同時胚性培養(yǎng)物隨著繼代次數(shù)的增多胚性迅速喪失，出現(xiàn)白化苗的概率增加。原生質(zhì)體是通過分離胚性細胞懸浮系而得到的，實際操作更加煩瑣，轉(zhuǎn)基因篩選困難，更不易獲得轉(zhuǎn)基因再生苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種獲得胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高的高羊茅種子的方法。本發(fā)明提出的獲得胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高的高羊茅種子的方法，是通過在改良的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選具強烈分化能力的胚性愈傷組織，并通過大田繁殖和自然授粉獲得這些胚性愈傷組織再生苗雜交的后代種子。分析發(fā)現(xiàn)，這些種子能夠被誘導(dǎo)出具強烈分化能力的胚性愈傷組織塊是未經(jīng)篩選高羊茅種子的5倍之多。表明通過篩選組培響應(yīng)性強的成熟胚有助于提高遺傳上異質(zhì)的高羊茅再生體系的效率。本方法對大多數(shù)高羊茅品種具有普遍的適應(yīng)性，并借此可建立高羊茅高效的再生體系，適宜于高羊茅的遺傳改良。本發(fā)明提出的獲得胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高的高羊茅種子的方法，具體步驟如下 以高羊茅成熟胚為外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上首先進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；挑選致密淡黃的具強烈分化能力的胚性愈傷組織在分化培養(yǎng)基上進行分化；然后將再生苗移栽至1/2 MS培養(yǎng)基上進行生根；然后將完整再生苗移栽至帶有土壤介質(zhì)的花盆生長；最后將適應(yīng)土壤生長的再生苗轉(zhuǎn)移至大田生長，間隔種植，自然授粉獲得種子。本發(fā)明中，所述高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括MS鹽+MS維生素，O. 5g/L水解酪蛋白，O. 15g/L L-谷氨酰胺，30g/L鹿糖，3g/L Gelrite,9. 5mg/L 2，4_D,O. 3mg/L 激動素，PH 值 5. 8-6. O0本發(fā)明中，所述高羊茅愈傷組織的分化培養(yǎng)基，包括MS鹽+MS維生素，30g/L蔗糖，3g/L Gelrite, O. 3mg/L 激動素，PH 值 5. 8-6. O。本發(fā)明中，誘導(dǎo)形成愈傷組織過程中所用改良的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了 2，4-D和細胞分裂素，所述2，4-D為9. 5mg/L ;所述細胞分裂素為O. 3mg/L激動素。本發(fā)明中，挑選的愈傷組織為淡黃致密的具強烈分化能力的胚性愈傷組織。本發(fā)明中，所述胚性愈傷組織的分化在含O. 3mg/L激動素的所述改良分化培養(yǎng)基上進行。上述培養(yǎng)基組分中，MS為MS培養(yǎng)基成分(Murashige & Skoog medium, 1962, Physiol. Plant 15:473-497 )，2，4-D 為 2，4-二氯苯氧乙酸。本發(fā)明提出的通過具強烈分化能力胚性愈傷組織再生苗雜交所獲得的種子提高遺傳上異質(zhì)的高羊茅再生體系的效率還未見有報道。由于冷季型草坪草遺傳上的高度異質(zhì)性，基因型差異一直是限制人們建立草坪草高效再生體系的重要因子，也是人們在基本解決草坪草愈傷組織誘導(dǎo)的外部條件之后一直沒有被有效解決的問題。研究表明，以高羊茅優(yōu)良基因型的種子成熟胚作為外植體能夠建立起高效的高羊茅愈傷組織再生系統(tǒng)，并且成熟胚相比于其他外植體取材更方便，因此不需要進行相應(yīng)的繼代培養(yǎng)擴繁胚性愈傷組織， 所獲得的胚性愈傷組織塊可以直接用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化，相對來說更簡單和方便。


圖I高羊茅無再生能力的愈傷組織(A)及具強烈分化能力的淡黃致密的胚性愈傷組織(B)。
圖2用于大田繁殖及自然授粉的胚性愈傷組織再生苗。圖3高羊茅胚性愈傷組織再生苗所結(jié)種子。圖4未篩選高羊茅種子(Barlexas)和篩選后高羊茅種子(R-Barlexas)種子發(fā)芽勢比較。其中，A,黑暗催芽5天后的Barlexas和R-Barlexas種子；B, A中所示Barlexas 和R-Barlexas種子發(fā)芽率；C，A中所示苗高在2. 5cm左右的種子占發(fā)芽種子數(shù)的比例
圖5典型的高羊茅胚性愈傷組織再生苗所結(jié)種子成熟胚與普通高羊茅種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織比較(白色箭頭為胚性愈傷組織)。圖6高羊茅胚性愈傷組織再生苗所結(jié)種子成熟胚與普通高羊茅種子成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)情況比較。圖7未篩選高羊茅種子(Barlexas)和篩選后高羊茅種子(R-Barlexas)的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率比較。其中，A，高羊茅典型的具高分化能力的胚性愈傷組織；B，A中胚性愈傷組織在分化培養(yǎng)基上的強烈分化；C，未篩選高羊茅種子和篩選后高羊茅種子如A中所示的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。
具體實施例方式實施例I、胚性愈傷組織再生苗后代種子的獲得。I. I 材料。采用美國百綠公司的高羊茅{Festuca arundinacea)商業(yè)栽培品種‘凌志’ (Bar I exas )成熟胚作為外植體，用于誘導(dǎo)愈傷組織。I. 2成熟胚表面滅菌
高羊茅干種子用無菌蒸餾水?dāng)嚢枨逑?0-45min，去除癟粒；75 %乙醇表面滅菌2min，
O.l%HgC12表面滅菌15min ;無菌水沖洗5-6次，以徹底去除HgC12，置于4°C吸脹72 h待用。I. 3胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，再生，幼苗移栽
胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(I) MS + 9. 5mg. I/1 2, 4-D(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid) + 0. 3mg. L-1 KT +0. 15g. L-1 L-谷氨酰胺 +0. 5g. L-1 水解酪蛋白 + 3g. L-1 Gelrite + 30g. Γ1 蔗糖，pH 5. 8。分化培養(yǎng)基(R) : MS + 0. 3mg. Γ1 KT+ 3g. Γ1 Gelrite + 30g. Γ1 蔗糖，pH 5. 8。生根培養(yǎng)基(Rt) : 1/2MS + 3g. L^1Gelrite + 30g. Γ1 蔗糖，pH 5. 8。無菌條件下用解剖刀取出高羊茅種子的成熟胚(解剖鏡下操作)，接種于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25°C黑暗培養(yǎng)8周。挑選淡黃，致密，生長狀態(tài)良好的胚性愈傷組織， 接種于分化培養(yǎng)基上，25°C光照(光照強度UOMffloPnr2·^)培養(yǎng)4周。當(dāng)再生綠苗長到 2-6cm左右時，挑取具有強烈再生能力的愈傷組織再生苗，將其轉(zhuǎn)移到1/2MS生根培養(yǎng)基上，25°C，光照強度光照條件下(16h光照/8h黑暗)進行生根培養(yǎng)。這些再生苗統(tǒng)一命名為R-Barlexas(Regenerative Barlexas)。待幼苗根長約3 cm時,將苗從 1/2MS生根培養(yǎng)基上移出并洗去附著于根部的培養(yǎng)基，栽于裝有黑土 蛭石珍珠巖=I 1
O.2的培養(yǎng)缽中(開始3-5天注意保濕)，移至25±2°C的培養(yǎng)室(16h光照/8h黑暗)生長。1.4再生苗種群的建立及后代的獲得
待再生幼苗長到30個分蘗左右時，將苗以5個分蘗為一組，無性繁殖一次；當(dāng)苗再次長到30個分蘗左右時，將苗移至大田生長，不同愈傷組織來源的再生苗間隔種植，以達到最佳授粉效果，來年秋初收取種子。實施例2、胚性愈傷組織再生苗后代種子及普通高羊茅種子愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的比較。2.1種子活力的比較。取表面滅菌后的高羊茅種子，無菌條件下接種于鋪有3層無菌紗布的Ilcm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿100粒，重復(fù)2次。加入10 ml無菌水充分濕潤，置于25°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)，黑暗濕潤發(fā)芽，以第5天的成苗率作為種子活力的檢測標準。種子發(fā)芽試驗是檢測種子活力最有效的方法之一。通過比較Barlexas和R-Barlexas種子5 d時的發(fā)芽率發(fā)現(xiàn),Barlexas和 R-Barlexas發(fā)芽率無明顯差異，發(fā)芽率高，均在90%以上。但R-Barlexas發(fā)芽均一度明顯高于Barlexas。5 d時,R-Barlexas苗高在2. 5cm左右的種子占發(fā)芽種子比例高達94%,而 Barlexas僅為22. 6%，苗高參差不齊。2.2愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的比較。種子滅菌方法按本章I. 2部分進行，成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織方法參照本章I. 3部分進行；每個培養(yǎng)皿各接16個成熟胚，總共各十個皿，25°C暗培養(yǎng)8周后，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷誘導(dǎo)率。該實驗在不同時間完全獨立重復(fù)一次。結(jié)果表明，R-Barlexas誘導(dǎo)出具強烈再生能力胚性愈傷組織的比率是Barlexas的5倍多，明顯高于Barlexas,如圖2 所示。R-Barlexas的愈傷組織誘導(dǎo)率也明顯高于Barlexas,而種子發(fā)芽率基本一致,表明胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織誘導(dǎo)率的差距并不是由于種子活力間的差距而引起的。在整個愈傷組織誘導(dǎo)過程中R-Barlexas的愈傷組織生長相對緩慢，出現(xiàn)致密，顏色偏淡黃色的胚性愈傷組織的頻率明顯高于Barlexas。
權(quán)利要求
1.一種獲得胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高的高羊茅種子的方法，其特征在于具體步驟為 以高羊茅成熟胚為外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上首先進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)； 挑選致密淡黃的具強烈分化能力的胚性愈傷組織在分化培養(yǎng)基上進行分化；然后將再生苗移栽至1/2 MS培養(yǎng)基上進行生根；然后將完整再生苗移栽至帶有土壤介質(zhì)的花盆生長； 最后將適應(yīng)土壤生長的再生苗轉(zhuǎn)移至大田生長，間隔種植，自然授粉獲得種子；其中所述高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括MS鹽+MS維生素，O. 5g/L水解酪蛋白，O.15g/L L-谷氨酰胺，30g/L 蔗糖，3g/L Gelrite, 9. 5mg/L 2，4_D，O. 3mg/L 激動素，PH 值5.8~6. O ；所述高羊茅愈傷組織的分化培養(yǎng)基，包括MS鹽+MS維生素，30g/L蔗糖，3g/L Gelrite, O. 3mg/L 激動素，PH 值 5. 8-6. O。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種獲得胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高的高羊茅種子的方法。該方法包括采用高羊茅的成熟胚為外植體，在改良的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成愈傷組織，隨后挑選淡黃致密的具強烈分化能力的胚性愈傷組織，并將其接種到改良的分化培養(yǎng)基上進行分化，待分化形成完整幼苗之后再將其轉(zhuǎn)移到1/2MS生根培養(yǎng)基上，等再生苗生出健壯根系之后將其轉(zhuǎn)移到帶有土壤介質(zhì)的花盆生長。然后將這些組培苗轉(zhuǎn)移到大田生長，并間隔種植，自然授粉，獲得其種子。結(jié)果表明，這些具強烈分化能力的胚性愈傷組織再生苗雜交所獲得的后代種子被誘導(dǎo)出淡黃致密胚性愈傷組織的頻率是未經(jīng)篩選高羊茅種子的5倍之多。
文檔編號A01H4/00GK102577957SQ201210043770
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月26日
發(fā)明者丁雨龍, 蒯本科, 魏強 申請人:南京林業(yè)大學(xué)