一種遼藁本愈傷組織的培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了遼藁本的組織培養(yǎng)方法，將新鮮遼藁本葉片，以MS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2,4?二氯苯氧乙酸、6?糖基氨基嘌呤、蔗糖、瓊脂、肌醇作為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。以總培養(yǎng)基計(jì)，MS，2,4?二氯苯氧乙酸、6?糖基氨基嘌呤、蔗糖、瓊脂、肌醇的重量組成比：1000g:0.2~0.5mg:0.04~0.08mg:6~9g：1.2~2g:0.01~0.03g。目前，有關(guān)遼藁本組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道未見(jiàn)報(bào)道，采用本發(fā)明得到的愈傷組織，在組合培養(yǎng)基上，不僅愈傷組織長(zhǎng)得快且大，而且外觀(guān)為嫩綠色，長(zhǎng)勢(shì)好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種遼藁本愈傷組織的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
:
[0001]本發(fā)明涉及遼藁本的愈傷組織的培養(yǎng)方法，屬于中藥的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]遼藁本(Ligusticum jeholense Nakai et Kitag)為傘形科藁本屬多年生草本植物，是《中華人民共和國(guó)藥典》收載的大宗常用中藥藁本的主要來(lái)源之一，主要分布于遼寧、吉林、山西及山東地區(qū)。遼藁本味辛、溫。具有祛風(fēng)，散寒，除濕，止疼作用。用于風(fēng)寒感冒，顛頂疼痛，風(fēng)濕痹痛?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有治療風(fēng)寒泄瀉、周身疼痛、疥癬、腹痛等疾病。
[0003]由于沒(méi)有規(guī)范化管理以及經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，多年來(lái)對(duì)野生資源不可持續(xù)的采挖，使遼藁本的產(chǎn)量不斷下降，野生藁本資源遭到嚴(yán)重破壞。野生遼藁本的引種和人工栽培實(shí)踐中，種群以無(wú)性更新為主。而以根莖進(jìn)行撫育和移栽工作進(jìn)展緩慢，為了保護(hù)這一野生資源，本發(fā)明對(duì)遼藁本進(jìn)行了愈傷組織培養(yǎng)的研究，提出科學(xué)有效地恢復(fù)和擴(kuò)大遼藁本種群的提供新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明的目的在于提供遼藁本愈傷組織培養(yǎng)在獲得遼藁本中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供遼藁本愈傷組織培養(yǎng)的方法。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)如下方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]取遼藁本嫩葉滅菌，以MS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2，4-二氯苯氧乙酸、6-糖基氨基嘌呤、蔗糖、瓊脂、肌醇作為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0008]所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基。
[0009]所述的MS培養(yǎng)基、2，4-二氯苯氧乙酸、6-糖基氨基嘌呤、蔗糖、瓊脂、肌醇的重量組成比為:100g: 0.2?0.5mg: 0.04?0.08mg: 6?9g:1.2?2g: 0.01 ?0.03g。
[0010]進(jìn)一步地，所述的2，4_二氯苯氧乙酸的重量為:MS:2，4_二氯苯氧乙酸=100g:
0.2?0.3mg0
[0011]所述的6-糖基氨基嘌呤的重量組成為:MS:6-糖基氨基嘌呤= 100g:0.04?0.06mgo
[0012]所述的蔗糖的重量組成為:MS:蔗糖=100g: 6?7.5g。
[0013]所述的瓊脂的重量組成為:MS:瓊脂= 100g: 1.2?1.5g。
[0014]所述的肌醇的重量組成為:MS:肌醇= 1000g:0.01?0.015g。
[0015]具體地，本發(fā)明的培養(yǎng)方法為:
[0016]將遼藁本的嫩葉進(jìn)行滅菌，剪成0.5X0.5cm的小塊，以100gMS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2.0?2.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸1mL?15mL，0.4?0.5mg/L 6-糖基氛基嘌吟10?15mL，30?35g/L鹿糖20?25mL，6?8g/L瓊脂20?25mL，0.I?0.15g/L肌醇10?15mL，調(diào)節(jié)PH=5.8?6.0的組合培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)40?50個(gè)嫩葉小塊，培養(yǎng)60?70天，即可。
[0017]本發(fā)明針對(duì)沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道遼藁本的愈傷組織培養(yǎng)，采用組合培養(yǎng)基，進(jìn)行遼藁本嫩葉的組織培養(yǎng)，從而得到外觀(guān)為嫩綠色，長(zhǎng)勢(shì)好的愈傷組織。
【具體實(shí)施方式】
:
[0018]實(shí)施例1:
[0019]①將采集的新鮮遼藁本的嫩葉去掉莖;放于磨口廣口瓶中用自來(lái)水沖洗2小時(shí)，再用70%酒精消毒30秒，無(wú)菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉洗3分鐘，無(wú)菌水洗6次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中用濾紙吸干表面水;將已經(jīng)滅菌的葉片切成0.5 X0.5cm的小塊，作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的材料；
[0020]②以100gMS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中添加2.0mg/L 2，4_二氯苯氧乙酸1mL?15mL，0.4mg/L 6-糖基氛基嘌吟1mL?15mL，30g/L鹿糖20mL?25mL，6g/L瓊脂20mL?25mL;
[0021]③調(diào)節(jié)組合培養(yǎng)基的P H=5.8?6.0;
[0022]④培養(yǎng)基接種培養(yǎng)50個(gè)葉片小塊，培養(yǎng)60?70天，結(jié)果愈傷組織外觀(guān)為黃褐色，組織生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)不好。
[0023]實(shí)施例2:
[0024]①將采集的新鮮遼藁本的嫩葉去掉莖;放于磨口廣口瓶中用自來(lái)水沖洗2小時(shí)，再用70%酒精消毒30秒，無(wú)菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉洗3分鐘，無(wú)菌水洗6次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中用濾紙吸干表面水;將已經(jīng)滅菌的嫩莖切成0.5cm的小塊，作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的材料；
[0025]②以100gMS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中添加0.4mg/L6_糖基氨基嘌吟10!111^?151111^，3(^/1^鹿糖201111^?251111^，68/1^瓊脂201111^?251111^;0.lg/Uj/UflO?15mL;
[0026]③調(diào)節(jié)組合培養(yǎng)基的PH=5.8?6.0;
[0027]④培養(yǎng)基接種培養(yǎng)50個(gè)葉片小塊，培養(yǎng)60?70天，結(jié)果愈傷組織外觀(guān)為黃褐色，組織生長(zhǎng)較少，長(zhǎng)勢(shì)不好。
[0028]實(shí)施例3:
[0029]①將采集的新鮮遼藁本嫩葉去掉莖;放于磨口廣口瓶中用自來(lái)水沖洗2小時(shí)，再用70%酒精消毒30秒，無(wú)菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉洗3分鐘，無(wú)菌水洗6次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中用濾紙吸干表面水;將已經(jīng)滅菌的葉片切成0.5X0.5cm的小塊，作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的材料；
[0030]②以100gMS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中添加2.0mg/L 2，4_二氯苯氧乙酸1mL?15mL，30g/L鹿糖20mL?25mL，6g/L瓊脂20mL?25mL，0.lg/Uj/UflO?15mL;
[0031]③調(diào)節(jié)組合培養(yǎng)基的PH=5.8?6.0;
[0032]④培養(yǎng)基接種培養(yǎng)50個(gè)葉片小塊，培養(yǎng)60?70天，結(jié)果愈傷組織外觀(guān)為黃褐色，組織生長(zhǎng)較少，長(zhǎng)勢(shì)不好。
[0033]實(shí)施例4:
[0034]①將采集的新鮮遼藁本嫩葉去掉莖;放于磨口廣口瓶中用自來(lái)水沖洗2小時(shí)，再用70%酒精消毒30秒，無(wú)菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉洗3分鐘，無(wú)菌水洗6次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中用濾紙吸干表面水;將已經(jīng)滅菌的葉片切成0.5X0.5cm的小塊，作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的材料；
[0035]②以100gMS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中添加2.0mg/L 2，4_二氯苯氧乙酸1mL?15mL，0.4mg/L 6-糖基氛基嘌吟1mL?15mL，30g/L鹿糖20mL?25mL，6g/L瓊脂 20mL ?25mL ,0.1 g/L 肌醇 10?15mL;
[0036]③調(diào)節(jié)組合培養(yǎng)基的ΡΗ=7.0?7.5;
[0037]④培養(yǎng)基接種培養(yǎng)50個(gè)葉片小塊，培養(yǎng)60?70天，結(jié)果愈傷組織外觀(guān)為褐色，組織生長(zhǎng)很緩慢幾乎不生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)非常不好。
[0038]實(shí)施例5:
[0039]①將采集的新鮮遼藁本嫩葉去掉莖;放于磨口廣口瓶中用自來(lái)水沖洗2小時(shí)，再用70%酒精消毒30秒，無(wú)菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉洗3分鐘，無(wú)菌水洗6次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中用濾紙吸干表面水;將已經(jīng)滅菌的葉片切成0.5X0.5cm的小塊，作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的材料；
[0040]②以100gMS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中添加2.0mg/L 2，4_二氯苯氧乙酸1mL?15mL，0.4mg/L 6-糖基氛基嘌吟1mL?15mL，30g/L鹿糖20mL?25mL，6g/L瓊脂 20mL ?25mL ,0.1 g/L 肌醇 10?15mL;
[0041 ] ③調(diào)節(jié)組合培養(yǎng)基的PH=5.8?6.0;
[0042]④培養(yǎng)基接種培養(yǎng)50個(gè)葉片小塊，培養(yǎng)60?70天，結(jié)果愈傷組織外觀(guān)為嫩綠色，長(zhǎng)得快且大，長(zhǎng)勢(shì)好。
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)論:各種激素及PH值對(duì)遼藁本的愈傷組織生長(zhǎng)影響較大，在各種激素適量及PH= 5.8?6.0時(shí)生長(zhǎng)效果最好;在組合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，嫩葉不僅愈傷組織長(zhǎng)得快且大，而且外觀(guān)為嫩綠色，長(zhǎng)勢(shì)好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.遼藁本愈傷組織培養(yǎng)在獲得遼藁本中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，取遼藁本嫩葉滅菌，以MS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2，4-二氯苯氧乙酸、6-糖基氨基嘌呤、蔗糖、瓊脂、肌醇作為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為: MS培養(yǎng)基。4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，以總培養(yǎng)基計(jì)，MS，2，4-二氯苯 氧乙酸、6-糖基氨基嘌呤、蔗糖、瓊脂、肌醇的重量組成比為:100g: 0.2-0.5mg: 0.04~0.08mg:6~9g:1.2~2g: 0.01~0.03go5.如權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，2，4-二氯苯氧乙酸的重量為: MS: 2，4-二氯苯氧乙酸=100g: 0.2-0.3mg。6.如權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，6-糖基氨基嘌呤的重量為: MS: 6-糖基氨基嘌呤=100g: 0.04?0.06mg。7.如權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，蔗糖的重量為:MS:蔗糖 =1000g:6~7.5go8.如權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，瓊脂的重量為:MS:瓊脂 =100g:1.2?1.5g09.如權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，肌醇的重量為:MS:肌醇 =1000g:0.01~0.015go10.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，將遼藁本的嫩葉進(jìn)行滅菌， 剪成0.5X0.5cm的小塊，以100gMS為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2.0?2.5mg/L 2,4_二氣苯氧乙酸1mL?15mL，0.4?0.5mg/L 6-糖基氛基嘌吟 10?15mL，30?35g/L蔗糖20?25mL，6?8g/L瓊脂20?25mL ,0.1-0.15g/L肌醇10?15mL，調(diào)節(jié)PH=5.8-6.0的組合培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)40?50個(gè)嫩葉小塊，培養(yǎng)60?70天，即可。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105900839SQ201610261764
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月25日
【發(fā)明人】賈凌云, 路金才, 李娜, 趙玥, 王晶, 李敬, 程珍
【申請(qǐng)人】沈陽(yáng)藥科大學(xué)