一株出芽短梗霉菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株出芽短梗霉菌及其應(yīng)用，該菌株的分類命名為出芽短梗霉，Aureobasidium?pullulans，完整命名為出芽短梗霉PA-2，已于2013年10月28日保藏在中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8413。本發(fā)明提供的出芽短梗霉PA-2在小麥、油菜、豌豆田中，用于豬殃殃、藜、冬葵等闊葉雜草以及野燕麥等的生物除草，其能有效地控制和防治闊葉雜草及野燕麥。
【專利說明】一株出芽短梗霉菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一株出芽短梗霉菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)田雜草控制主要以化學(xué)除草劑為主體推動(dòng)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程。隨著化學(xué)除草劑的廣泛使用，產(chǎn)生的負(fù)面影響也日益明顯。如抗藥性雜草種群的增加，土壤板結(jié)和水體污染等，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此開發(fā)研制廣譜、高效、低毒新除草劑和發(fā)展生物除草技術(shù)已成為當(dāng)務(wù)之急。生物除草劑的出現(xiàn)順應(yīng)這一發(fā)展趨勢(shì)。迄今為止，研究者已對(duì)50多種雜草上的近100種具有除草潛力的病原真菌進(jìn)行了大量研究。其中，具有除草活性可望開發(fā)成除草劑的真菌主要集中在刺盤孢屬Colletotrichum、鐮孢屬Fusarium、鏈格孢屬Alternaria、葡萄孢屬Botrytis、尾孢屬Cercospora、柄銹菌屬Puccinia、葉黑粉菌屬Entyloma、殼二胞屬Ascochyta和核盤菌屬Sclerotinia等。目前,全世界已經(jīng)開發(fā)的生物除草劑產(chǎn)品有20余種，其中Biochon、StumpOut、Camperico、雙丙氨勝鈉、Myco — TechPaste和MB1-005已經(jīng)成為國際化的產(chǎn)品。[0003]除“魯保I號(hào)”外，我國生物除草劑產(chǎn)品登記的較少，但我國在生物除草劑候選生物篩選方面做了許多工作。近年來，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室以馬唐一畫眉草彎孢(Digitaria sanguinalis — Curvularia eragrostidis)、稗草一新月彎抱(Culvularialunata)、稗草一禾長螺抱菌(Helminthosporium gramineum f.sp.Echinochloa)和幡蟲率草平臍螺孢菌株(Bipolaris eleusines)、加拿大一枝黃花一小菌核菌(Solidagocanadensis — Sclerotium rolfsii)、空心蓮子草一假隔鏈格抱菌(Alternanteraphyloxeroides — Nimbya alternantherae)、紫莖澤蘭一鏈格抱菌(Eupatoriumadenophorum — Alternaria alternata)等菌草體系的研究取得了進(jìn)展，已經(jīng)形成了一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物除草劑技術(shù)成果。
[0004]微生物除草劑相比化學(xué)除草劑具有選擇性強(qiáng)、不傷害天敵、不易產(chǎn)生抗藥性、單位面積用量少、對(duì)人畜高度安全、對(duì)微生態(tài)環(huán)境影響小等諸多優(yōu)點(diǎn)。對(duì)微生物除草劑的評(píng)價(jià)，理論上主要依據(jù)兩條標(biāo)準(zhǔn)即有效性(藥效)和專一性(安全性)。雜草生防菌應(yīng)具備既對(duì)靶標(biāo)雜草具有強(qiáng)致病性又對(duì)作物相對(duì)安全兩大特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一株出芽短梗霉菌及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]一株出芽短梗霉菌,其分類命名為出芽短梗霉，Aureobasidium pullulans,完整命名為出芽短梗霉PA-2，已于2013年10月28日保藏在中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8413。
[0008]所述的出芽短梗霉菌的應(yīng)用，是將出芽短梗霉菌的發(fā)酵濾液噴施于小麥、油菜或豌豆的田間，應(yīng)用于田間除草。
[0009]所述的出芽短梗霉菌的應(yīng)用，其出芽短梗霉菌的發(fā)酵濾液的制備，是在培養(yǎng)7d后的菌落邊緣取菌絲塊接種到有200mLPD培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，每瓶接5塊，25°C 150r ? min-1培養(yǎng)14d，培養(yǎng)液真空抽濾，濾液再用0.45u m微孔濾膜過濾，得發(fā)酵濾液。
[0010]所述的出芽短梗霉菌的應(yīng)用，其發(fā)酵濾液的噴施量為200mL/4m2。
[0011]所述的草為豬殃殃、藜、冬葵和野燕麥。
[0012]本發(fā)明針對(duì)小麥、油菜、豌豆田的豬殃殃、藜、冬葵等闊葉雜草以及野燕麥等，篩選一種出芽短梗霉菌菌株，用于生物除草。本發(fā)明能有效安全地控制和防治闊葉雜草及野燕麥，成本低，無污染，低殘留對(duì)環(huán)境友好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為PA-2菌絲塊致病性測(cè)定(5d時(shí)的癥狀)；；A為葉子的正面，B為葉子的背面。
[0014]圖2為PA-2菌株發(fā)酵濾液的致病性測(cè)定；其中A:豬殃殃；B:藜；C:冬葵；D:酸模葉寥；E:野燕麥。
[0015]圖3為出芽短梗霉培養(yǎng)性狀；其中A:菌落形態(tài)(25°C PDA) ；B:念珠狀菌絲；C:厚垣孢子。
[0016]圖4為基于ITS rDNA序列BLAST結(jié)果構(gòu)建的菌株P(guān)A-2的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0018]實(shí)施例1
[0019]1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0020]1.1病樣的采集及病原菌的分離純化
[0021]從青海省平安縣采集發(fā)病的楊樹葉片，將樣品分裝于自封袋中，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)發(fā)病癥狀進(jìn)行記錄、采集照片，于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩７蛛x純化方法參照方中達(dá)(1998)在植病研究方法中有關(guān)病原真菌的分離方法，對(duì)楊樹葉片病害標(biāo)本進(jìn)行分離和培養(yǎng)。即剪取楊樹葉片病健交界處的組織，置于3%次氯酸鈉中表面消毒3min，然后在無菌水中漂洗3次，并用滅菌吸水紙吸干組織表面水分，置于PDA培養(yǎng)基平板上25°C恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。每一培養(yǎng)基平板上放置5個(gè)組織塊。培養(yǎng)4d待病組織表面出現(xiàn)菌絲，接種針挑取菌落邊緣的菌絲進(jìn)行病原菌的純化并編號(hào)。
[0022]1.2病原菌PA-2菌株對(duì)幾種雜草的致病性測(cè)定
[0023]1.2.1菌絲塊的致病性測(cè)定
[0024]采集野外健康的新鮮雜草幼葉，葉片用無菌水沖洗3次后自然涼干，然后放置于墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿(Φ=9cm)內(nèi)，在培養(yǎng)7d的菌落邊緣取菌絲塊(Φ=8mm)接到葉片正面，以接種無菌的PDA培養(yǎng)基塊為對(duì)照，置于(25±1) 1:光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，觀察葉片發(fā)病情況。
[0025]1.2.2代謝產(chǎn)物的致病性測(cè)定
[0026]在培養(yǎng)7d后的菌落邊緣取菌絲塊接種到培養(yǎng)液(200mL/瓶)，每瓶接5塊，25°C 150r ? miiT1培養(yǎng)14d，培養(yǎng)液真空抽濾，濾液再用微孔濾膜(0=0.45 u m)過濾獲得發(fā)酵濾液，手持小噴壺噴霧接種于7~10葉期健康雜草植株上，接種量為20mL/盆，接種后的雜草植株置于28°C、12h光暗交替的人工氣候箱中用塑料袋套袋保濕培養(yǎng)。每一處理重復(fù)4次，以只接種無菌I3D培養(yǎng)液的植株作為空白對(duì)照。7d后觀察接種雜草的發(fā)病情況。
[0027]1.3PA-2菌株對(duì)作物安全性初試
[0028]將PA-2菌株發(fā)酵濾液分別噴霧接種(20mL/盆)于3~4葉期的小麥(青春587)、油菜(青雜5號(hào))、蠶豆(青海9號(hào))、豌豆(草原224)、青稞(北青8號(hào))，培養(yǎng)方法同1.2.2。每處理重復(fù)4次，以只接種無菌TO培養(yǎng)液的植株作為空白對(duì)照。7d后調(diào)查發(fā)病情況。按以下標(biāo)準(zhǔn)記載發(fā)病程度:NS表示無癥狀(無病斑，植株正常生長)；LS表示有輕微反應(yīng)(葉片分布零星斑點(diǎn)，生長略受抑制)；MS表示中等感病(1/5~1/4的葉面積出現(xiàn)病斑，生長受抑制)；SS表示嚴(yán)重感病(1/4以上葉片面積出現(xiàn)病斑，生長受到嚴(yán)重抑制)。
[0029]1.4PA-2菌株的鑒定
[0030]1.4.1形態(tài)鑒定
[0031]將P A-2于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲、孢子形態(tài)。將直徑為8mm菌絲塊接種于培養(yǎng)基平皿(0=9cm)，25°C培養(yǎng)，定期觀察其菌落生長速度、產(chǎn)孢速度、產(chǎn)孢量、菌落形態(tài)及色澤變化。
[0032]1.4.2分子鑒定
[0033]DNA提取:選用通用引物PCR擴(kuò)增基因組DNA的ITS區(qū):由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成擴(kuò)增真菌核糖體基因的通用引物ITS4和ITS5。ITS4和ITS5序列分別為=ITShS' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ；ITS5:5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。
[0034]PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 ii L)如下:4u L dNTP Mixture (每種成分均為2.5mmol/L), ITS4 (20umol/L)和 ITS5 (20umol/L)各 1.0 y L，6.0 y L 的 IOXTaq reactionbuffer, 1.0 u L Taq DNA polymerase (2.5U/u L),模板 DNA 為 2 u L, 35.0 u L 無菌去離子水。PCR循環(huán)設(shè)置如下:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，51°C退火lmin，72°C延伸lmin,共設(shè)35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，于溴化乙錠溶液(0.5 V- g/mL)中染色15min,通過Bio-Rad Gel Doc2000成像系統(tǒng)顯示記錄電泳結(jié)果。收集PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果用chromas.exe軟件進(jìn)行序列修正后,從NCBI Blast檢索與目標(biāo)序列同源性高的DNA序列，與本試驗(yàn)所測(cè)序列分別進(jìn)行菌株種內(nèi)比對(duì)。利用MEGA5.0軟件近鄰歸群法(Neighbor-Joining,N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,各分支的置信度自舉檢測(cè)(bootstrap) 1000次。
[0035]2、結(jié)果
[0036]2.1出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)PA-2菌株的致病性測(cè)定
[0037]PA-2菌株菌絲塊接種雜草3d后，雜草葉片上可觀察到輕微病變，菌絲塊四周長出大量菌絲，逐漸開始向葉片侵染，圍繞菌絲塊四周形成一圈褐色斑紋；5d后，菌絲塊四周褐色斑紋逐漸擴(kuò)展，兩個(gè)斑紋連接成片。同時(shí)，菌絲穿透整個(gè)葉片，布滿葉背部，隨后擴(kuò)展至整個(gè)葉片，變黑腐爛。其中野燕麥接種部位葉片發(fā)黃，沿葉脈擴(kuò)展(圖1)。
[0038]菌絲塊致病性測(cè)定結(jié)果表明:PA_2菌株對(duì)一些雜草離體葉片均表現(xiàn)為強(qiáng)致病性，供試雜草為密花香薷、藜、冬葵、刺兒菜、豬殃殃、野燕麥等。[0039]噴施發(fā)酵濾液3d后，在雜草上出現(xiàn)受害癥狀，豬殃殃表現(xiàn)為葉片卷曲，藜出現(xiàn)萎蔫，冬葵葉片褪綠變黃，酸模葉寥葉片萎蔫，野燕麥葉片萎蔫、失綠；5d后，豬殃殃變現(xiàn)為莖葉枯死，藜2/3的植株枯死，冬葵全部枯死，酸模葉寥2/3葉片枯萎，野燕麥整株枯萎，像開水燙過似的。隨時(shí)間推移病害加重，最后整盆雜草枯死(如圖2)。
[0040]表1是PA-2菌株發(fā)酵濾液對(duì)不同雜草致病力比較。從表1可以看出:噴霧接種7d后，除酸模葉寥外，發(fā)病率均達(dá)88.9%以上，其中豬殃殃、冬葵發(fā)病率高達(dá)96% ;菌株發(fā)酵濾液對(duì)酸模葉寥的平均鮮重效為62.11%，對(duì)豬殃殃、藜、冬葵、野燕麥的平均鮮重效分別達(dá)到87.25%,78.46%,82.25%,80.27%，較酸模葉寥的平均鮮重效均呈顯著差異(P < 0.05)，各處理間亦呈顯著差異；病情指數(shù):冬葵最高，其次為豬殃殃，說明菌株發(fā)酵濾液對(duì)冬葵、豬殃殃最敏感。對(duì)五種雜草發(fā)病情況進(jìn)行后續(xù)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)接種雜草無復(fù)蘇現(xiàn)象，病情不斷加重，直至整盆雜草枯死。以田間常見的五種雜草為生測(cè)對(duì)象，試驗(yàn)結(jié)果表明:該菌株發(fā)酵濾液對(duì)豬殃殃、藜、冬葵、野燕麥具有較好的防除效果。
[0041]表1PA-2菌株發(fā)酵濾液對(duì)不同雜草致病力比較
【權(quán)利要求】
1.一株出芽短梗霉菌，其特征是，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8413。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的出芽短梗霉菌的應(yīng)用，其特征是，將出芽短梗霉菌的發(fā)酵濾液噴施于小麥、油菜或豌豆的田間，應(yīng)用于田間除草。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的出芽短梗霉菌的應(yīng)用，其特征是，出芽短梗霉菌的發(fā)酵濾液的制備，是在培養(yǎng)7d后的菌落邊緣取菌絲塊接種到有200mLPD培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，每瓶接5塊，250C 150r ^mirT1培養(yǎng)14d，培養(yǎng)液真空抽濾，濾液再用0.45 y m微孔濾膜過濾，得發(fā)酵濾液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的出芽短梗霉菌的應(yīng)用，其特征是，發(fā)酵濾液的噴施量為200mL/4m2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述 的出芽短梗霉菌的應(yīng)用，其特征是，所述的草為豬殃殃、藜、冬葵和野燕麥。
【文檔編號(hào)】A01P13/02GK103642700SQ201310645649
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】郭青云, 程亮, 朱海霞, 李瑋, 翁華, 魏有海, 郭良芝 申請(qǐng)人:青海省農(nóng)林科學(xué)院