專利名稱：出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈產(chǎn)酶制備阿魏酸和低聚糖的方法
出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈產(chǎn)酶制備阿魏酸和低聚糖的方
法
技術 領域本發(fā)明涉及海蓬子秸稈在制備生物活性物質中的應用。
背景技術：
據(jù)聯(lián)合國教科文組織(UNESCO)和世界糧農組織(FAO)的不完全統(tǒng)計，全世界現(xiàn)有鹽漬土 9. 55億hm2。根據(jù)中科院南京土壤所的最新研究，我國各種類型的鹽堿土總面積已達到9913萬hm2。與此同時，全球淡水資源短缺，淡水貯量僅占總貯水量的2. 5%，土壤鹽漬化與淡水嚴重不足已成為限制農業(yè)發(fā)展的世界性問題。為緩解人地矛盾，充分利用海水和鹽土資源，國際學術界和多國政府對耐鹽植物的開發(fā)和鹽土農業(yè)的發(fā)展給予了極大的重視。海蓬子(學名鹽角草，Salicorniabigelovii)是科學家們從世界各地、生長在不同環(huán)境中的2000 3000種耐鹽植物中篩選出的其中最優(yōu)秀的一種。目前，已在沙特阿拉伯、墨西哥、阿拉伯聯(lián)合酋長國、印度等國家?guī)讉€規(guī)模達250hm2的樣板種植場試驗成功。近年來，我國不僅在國家“863”規(guī)劃中有專題資助海蓬子方面的研究，各地實業(yè)機構和科研單位也相繼投入資金進行應用性開發(fā)。目前，我國遼寧、河北、山西、陜西、寧夏、甘肅、山東、江蘇、海南等省區(qū)都有海蓬子的生產(chǎn)。江蘇鹽城市的海蓬子生產(chǎn)已顯成效，該市自 2000年從美國引種種植后，經(jīng)過4年的系統(tǒng)選育、馴化，鹽城海蓬子已成為改良后擁有自主知識產(chǎn)權的創(chuàng)新品種，其出芽率已經(jīng)達95%，適宜在我國大部分沿海地區(qū)種植同時，該市的海蓬子生產(chǎn)已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，成立了享譽國內外的綠苑海蓬子有限公司，并開發(fā)出了海蓬子系列產(chǎn)品。試驗結果表明，海蓬子在大田中的生物產(chǎn)量已經(jīng)達到16500 19500kg/hm2，產(chǎn)種量達1800 2250kg/hm2，可生產(chǎn)食用油籽約2000kg/hm2。因此，大面積種植海蓬子、開發(fā)利用海蓬子具有很高的社會和經(jīng)濟效益。目前海蓬子秸稈的綜合利用率不到20%，產(chǎn)量巨大的細胞壁物質多被丟棄或作為飼料，經(jīng)濟價值不高。近年來，如何降解細胞壁，獲得包括低聚糖、阿魏酸、黃酮類物質在內的眾多生理活性物質，提高海蓬子副產(chǎn)物的經(jīng)濟價值，具有一定的研究價值。秸稈的主要成分都是細胞壁。細胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質素、蛋白質等組成。纖維素構成細胞壁的“骨架”，半纖維素、木質素、蛋白質、角質、色素等物質填充在“骨架”中。在構成纖維素、 半纖維素、果膠等物質的關鍵多糖(木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、聚半乳糖等)的側鏈殘基上，往往存在一種重要的生理活性物質——反式阿魏酸。在植物初生壁內，阿魏酸常與多糖相交聯(lián)形成一種復雜的“網(wǎng)絡結構”。在植物體中，這種交聯(lián)結構同時也可調控植物細胞的生長、延伸，成為植物抵御病原體侵襲的屏障。海蓬子秸稈中細胞壁多糖的含量在50%以上，如能采用適當方法降解，這些副產(chǎn)品都可以成為功能性食品原料低聚糖(主要是低聚木糖)和阿魏酸的重要來源。低聚木糖是目前已知的低聚糖中雙歧桿菌增殖效果最好的一個品種，除具有低聚糖所共有的不被消化特性、無齲齒性、促進人體對鈣的吸收等功能特性外，還具有良好的PH值及熱穩(wěn)定性。目前低聚木糖的生產(chǎn)方法主要包括①酸水解法；②熱水抽提(包括蒸汽爆破)法；③酶水解法；④微波降解法。酸水解法對設備的要求高，投資大，且反應會伴隨有害物的生成。熱水抽提法生產(chǎn)的低聚木糖結晶顏色深，在很大程度上限制了其應用。微波降解法是一種較新的低聚木糖生產(chǎn)方法。目前低聚木糖主要是利用阿拉伯木聚糖酶降解細胞壁物質獲得。酶法水解與其他方法相比具有作用條件溫和、原料來源廣泛，獲得的產(chǎn)品還常常連接了黃酮和酚酸等物質，生理活性比一般的低聚木糖高等優(yōu)點。但由于細胞壁材料中的反式阿魏酸將多糖和木質素交聯(lián)，直接使用酶法降解水解效率低。為了提高酶水解效率，生產(chǎn)中一般先采用堿處理胞壁材料，但會導致環(huán)境污染并丟失反式阿魏酸。因此采用能同時分泌降解糖苷鍵和酯鍵的微生物發(fā)酵海蓬子秸稈利用混合酶的協(xié)同作用從秸稈細胞壁中釋放出低聚糖和阿魏酸具有重要的應用前景。
阿魏酸的化學名稱為4-羥基-3-甲基-2-苯丙烯酸。它是植物界普遍存在的一種酚酸，在植物中常與細胞壁中的多糖、低聚糖、多胺、酯類和木質素交聯(lián)構成細胞壁的一部分，很少以游離狀態(tài)存在。其主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病。并具有抗菌消炎以及抗突變和防癌作用。反式阿魏酸在美國、日本已允許用作食品添加劑，目前在醫(yī)藥、食品和化妝品工業(yè)中廣泛應用。生產(chǎn)阿魏酸的方法有化學合成法和天然法?；瘜W合成法是以香蘭醛和丙二酸為原料，通過縮合反應而成。但該法反應時間長(3周)，溶劑用量大，產(chǎn)率也很低，且生產(chǎn)的為反式和順式阿魏酸的混合物?，F(xiàn)在工業(yè)中普遍采用堿法降解米糠中的谷維素制備阿魏酸。但該法受原料(含量較低)的限制，產(chǎn)量上不去，成本較高，因而國際市場上阿魏酸的價格居高不下。另外一種方法是堿解或酶解植物細胞壁中的多糖獲得反式阿魏酸。近年來，研究者在設法提高低聚木糖的酶水解產(chǎn)率的同時，也注意到了阿魏酸酯酶的作用。在植物細胞壁上，由于阿魏酸的交聯(lián)，至使胞壁多糖之間緊密結合，單一使用某種多糖水解酶，并不能很好的滲入多糖分子內部，導致水解率太低。如果能采用阿魏酸酯酶和多糖水解酶共同作用于細胞壁，同時打斷阿魏酸酯鍵和糖苷鍵，無疑將使低聚糖的水解產(chǎn)率大大提高，同時又可生產(chǎn)阿魏酸。本課題組致力于出芽短梗霉的特性和發(fā)酵應用研究多年積累了相關的研究成果。在出芽短梗霉的代謝研究過程中發(fā)現(xiàn)其可以在分泌木聚糖酶的同時釋放出阿魏酸酯酶且兩種酶可以協(xié)同作用于糖苷鍵和酯鍵從而將低聚木糖和阿魏酸從秸稈細胞壁上釋放出來。 ^^ β (Aureobacidium pullulans Pul-Iularia pullulans)
母有密切關系的真菌。出芽短梗霉發(fā)酵能產(chǎn)生胞外多聚糖、酶、抗菌素、單細胞蛋白等多種產(chǎn)物，這些物質用途非常廣泛，尤其是所產(chǎn)生的胞外多聚糖(短梗霉多糖或卜多糖或普魯蘭多糖)具有極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結性和易自然降解等許多獨特的理化和生物學特性，無毒無害，對人體無任何副作用。廣泛地用于醫(yī)藥制造，食品包裝，水果和海產(chǎn)品保鮮，化妝品工業(yè)，煙草制造工業(yè)和農業(yè)種子保護等眾多領域，是一種有極大開發(fā)價值和前景的多功能新型生物制品。國外對出芽短梗霉的研究較早，而且已有各種產(chǎn)品， 日本已經(jīng)允許其產(chǎn)品應用于食品添加劑，而我國對出芽短梗霉的研究還不多見。因而出芽短梗霉應用于海蓬子秸稈的發(fā)酵產(chǎn)生功能性物質阿魏酸和低聚糖具有菌種安全性的保障， 以及海蓬子副產(chǎn)物高效、高附加值綜合利用的多重意義。在采用雙酶法時，還應該考慮到雙酶的選擇，只有選擇合適的阿魏酸酯酶和木聚糖酶才能達到最大的協(xié)同效應。目前具有一定的阿魏酸酯酶活性，可用于水解細胞壁物質的商業(yè)用酶主要有諾維信公司生產(chǎn)的SP584、Novozym342、Vis-cozyme、Ultraflo L等幾種混合酶制劑。FAE-III與木聚糖酶協(xié)同作用于細胞壁，可以釋放最大量的阿魏酸，但目前 FAE-III都是各實驗室經(jīng)黑曲霉發(fā)酵自行生產(chǎn)，還沒有工業(yè)化產(chǎn)品。同樣用于雙酶法水解中的木聚糖酶的選取也十分重要。今后還可考察在雙酶法水解體系中添加果膠酶、纖維素酶等其他多糖酶，以達到更高的水解率。 對底物進行必要的預處理，包括粉碎、高壓、微波、超聲波處理等，可能會提高水解率，但目前對這方面所做的研究還不多。YU等人在采用雙酶法降解燕麥膠生產(chǎn)阿魏酸的研究中發(fā)現(xiàn)底物的預處理對阿魏酸的產(chǎn)率有顯著影響，過250目篩的底物水解率高于過100 目篩的底物。張璟采用雙酶法降解麥麩時研究發(fā)現(xiàn)微波、高溫高壓處理均可以顯著提高阿魏酸的產(chǎn)率。如前文所述，玉米麩中阿魏酸的含量較高，但水解率不高，解決這個問題的方法就是進行有效的預處理。Saulnier對玉米麩采用了瞬間爆破和高壓預處理，生產(chǎn)出70% 以上的阿魏酸。Estelle采用高壓預處理玉米麩，再用阿魏酸酯酶和木聚糖酶聯(lián)合作用，也達到了阿魏酸90. 3%的高釋放率。目前對如何從酶解液中分離阿魏酸的研究不多，但分離低聚糖的技術則較成熟。 分離阿魏酸主要采取的方法是吸附法。Couteau從活性炭、聚苯乙烯交聯(lián)樹脂、PVPP等吸附介質中進行了篩選，研究表明活性炭以其對阿魏酸高度的吸附能力(每IOOg吸附22g)、不結合單糖分子、容易洗脫等優(yōu)點成為了最好的吸附介質。在活性碳吸附結束后，可以用乙醇把吸附的阿魏酸洗脫下來。在之后的研究中，他進一步探討了活性炭吸附和洗脫過程中的主要參數(shù)吸附柱的高度、溶液流動速度、活性炭的吸附飽和程度、接觸時間、溫度等。提出當活性炭完全飽和之后，經(jīng)洗脫可以從酶解液中獲得最多的阿魏酸(50% )。如何有效地利用阿魏酸酯酶和多糖水解酶之間的協(xié)同效應，使這兩種酶有效地打斷植物細胞壁中阿魏酸與長鏈多糖之間形成的“復雜網(wǎng)絡”，提高水解的效率，得到生產(chǎn)低聚木糖和阿魏酸的新方法，或獲得功能性更強的復合型產(chǎn)品，已經(jīng)成為一個嶄新的研究課題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的利用出芽短梗霉能夠同時分泌木聚糖酶和阿魏酸酯酶雙酶的特性，協(xié)同降解海蓬子秸稈細胞壁，釋放出生物活性物質低聚木聚糖和阿魏酸，實現(xiàn)海蓬子秸稈高效、高附加值綜合利用的多重價值。本發(fā)明的技術方案將海蓬子秸稈進行相應的預處理后，包括自然曬干或烘干后， 經(jīng)粉碎篩分達到一定粒徑后，或經(jīng)擠壓膨化后，經(jīng)出芽短梗霉代謝后產(chǎn)生木聚糖酶和阿魏酸酯酶混合酶，酶解海蓬子秸稈細胞壁，形成含有生物活性物質低聚木聚糖和阿魏酸的混合發(fā)酵基，經(jīng)活性炭吸附、有機溶劑沉淀或膜過濾分離阿魏酸和低聚木聚糖。本發(fā)明的有益效果當今研究和開發(fā)利用生長于廣袤海岸荒漠和海灘上的鹽生植物，已成為當今世界農業(yè)的重大課題，在鹽堿地上耕作是一種新的思維方式。因為海蓬子生長在不毛之地的鹽堿地上，土地費用比較低。另外，它無蟲害，不需要用農藥，也不需要鋤草，海蓬子種植管理費用不高。然而海蓬子的產(chǎn)量卻很高，其廢棄副產(chǎn)物秸稈的利用率還不到20%，形成的經(jīng)濟附加值極低。海蓬子秸稈中細胞壁多糖的含量在50%以上，如能采用適當方法降解，這些副產(chǎn)品都可以成為功能性食品原料低聚糖(主要是低聚木糖)和阿魏酸的重要來源。出芽短梗霉具有同時分泌木聚糖酶和阿魏酸酯酶雙酶的特性，能夠協(xié)同作用于海蓬子秸稈中細胞壁多糖的降解，釋放出功能性食品原料低聚木聚糖和阿魏酸，從而實現(xiàn)海蓬子秸稈的高效、高附加值的綜合利用。


圖1實施 例4中出芽短梗霉發(fā)酵前后海蓬子秸稈纖維結構變化
Fig. 1 Change of Salicornia stalk fiber configuration before and after fermentation
注圖中A為發(fā)酵前海蓬子秸稈纖維結構；B為發(fā)酵后海蓬子秸稈纖維結構
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明，但實施例不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1出芽短梗霉代謝海蓬子秸稈產(chǎn)酶效果分析發(fā)酵培養(yǎng)基20 80g/L的海蓬子秸稈處理液，添加0. 05 0. 3%的KH2PO4和 0. 05 0. 4% 的 MgSO4 · 7H20 和 0. 005 ~ 0. 04% 的 Vbi ；海蓬子秸稈處理液制備工藝海蓬子秸稈烘干粉碎后過20 60目篩子篩分 (20 80g/L)—用1 5%硫酸溶液調pH至4. 5 6. 0 — 30 90°C保溫2h —膠體磨處理 5 25min ；采用高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度為121°C，時間15 20min。母種培養(yǎng)在溫度為25 30°C，搖床轉速80 160r/min，搖瓶裝液量為20 100mL/250mL三角瓶，接種出芽短梗霉的4塊直徑約為6mm的母種菌塊，培養(yǎng)5d ；發(fā)酵條件在溫度為25 30°C，搖床轉速80 160r/min，搖瓶裝液量為20 100mL/250mL三角瓶，出芽短梗霉接種量2 10%，培養(yǎng)4 10d。阿魏酸酯酶活性在Andersen等方法的基礎上加以調整。酶解底物為阿魏酸甲酯，阿魏酸甲酯水溶性較差，試驗中用甲醇溶解，溶液濃度為50mM。測定時，用pH6.0的 0. IM檸檬酸溶液將50mM的阿魏酸甲酯溶液稀釋10倍，取2mL稀釋后的阿魏酸甲酯溶液預熱至40°C，添加2mL粗酶液，于40°C保持4h，反應后于95°C保持IOmin以滅酶。冷卻后，于 IOOOOrpm下離心lOmin，上清液用0. 45 μ m濾膜過濾，用HPLC法測定酶解釋放的阿魏酸含量。酶活定義40°C下，單位時間(Imin)內ImL粗酶液水解阿魏酸甲酯釋放1 μ mol阿魏酸定義為1個酶活單位(U/mL)。木聚糖酶活性參照Dogaris等的方法，以木糖為標準；酶活定義lmL粗酶液單位時間(Imin)于40°C水解樺樹木聚糖生成1 μ mol木糖為1個酶活單位(U/mL)。表1出芽短梗霉生成木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性Table IXylanase and ferulic acid esterase activity of pullulan
木聚糖酶(mU/mL)阿魏酸酯酶(mU/mL)
菌株 --
_4d_7_d_4d_7d
出芽短梗霉 1800.02±3.12a 3306.11士8.32 a_52.04士0.23_153.85±0.05
表1為真菌出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈產(chǎn)木聚糖酶和阿魏酸酯酶的情況。木聚糖酶是水解海蓬子秸稈半纖維素主鏈生成低聚木糖的關鍵酶，阿魏酸酯酶具有水解低聚木糖中阿魏酸酯鍵釋放阿魏酸的作用，因而真菌出芽短梗霉是發(fā)酵海蓬子秸稈制備低聚木糖和阿魏酸的較佳菌株。實施例2出芽短梗霉代謝海蓬子秸稈產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基I 在海蓬子秸稈處理液中添加VbiO. 05 0. 4g/L、0. 50 4. Og/L MgSO4 · 7H20和磷酸二氫鉀。培養(yǎng)基II 在海蓬子秸稈處理液中添加VbiO. 05 0. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 50 5. Og/L 和酵母膏 0. 50 5. Og/L。發(fā)酵條件在溫度為25 30°C，搖床轉速80 160r/min，搖瓶裝液量為20 100mL/250mL三角瓶，出芽短梗霉接種量2 10%，培養(yǎng)4 10d。培養(yǎng)基對出芽短梗霉產(chǎn)酶影響由表2可知，茶薪菇在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵時，菌體產(chǎn)酶情況顯著不同。優(yōu)化的培養(yǎng)基組成中，出芽短梗霉生成的胞外木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性均顯著提高；與優(yōu)化前相比， 木聚糖酶酶活提高了 31%，阿魏酸酯酶活性增加量為20%。表2出芽短梗霉在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)酶情況Table 2Enzymes and activities of pullulan during fermentation in different media
權利要求
1.出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈產(chǎn)酶制備阿魏酸和低聚糖的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈，其特征是本發(fā)明所述的發(fā)酵方式，是指液態(tài)發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵。
3.根據(jù)權利要求2所述的海蓬子秸稈，其特征是海蓬子秸稈包括木質化的成熟秸稈， 未木質化的幼齡秸稈。
4.根據(jù)權利要求3所述的海蓬子秸稈，其特征是木質化的成熟秸稈經(jīng)烘干或自然曬干后，粉碎過20-60目篩子篩分后供出芽短梗霉發(fā)酵；或粉碎后經(jīng)20-40目篩子篩分后經(jīng)擠壓膨化后供出芽短梗霉代謝；或未木質化的幼齡秸稈經(jīng)打漿后被出芽短梗霉發(fā)酵。
5.根據(jù)權利要求1所述的出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈產(chǎn)酶制備阿魏酸和低聚糖的應用，其特征是出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈產(chǎn)生木聚糖酶和阿魏酸酯酶的混合酶，以此混合粗酶液酶解預處理過的海蓬子秸稈制備阿魏酸和低聚糖；或以分離純化后的酶制劑降解預處理過的海蓬子秸稈細胞壁制備阿魏酸和低聚糖；或以出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈將產(chǎn)酶與制備阿魏酸和低聚糖合二為一進行。
6.根據(jù)權利要求1所述的出芽短梗霉發(fā)酵海蓬子秸稈產(chǎn)酶制備阿魏酸和低聚糖的應用，其特征是通過有機溶劑提取法或膜過濾法或離子交換法來提取分離阿魏酸和低聚糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵海蓬子秸稈產(chǎn)酶制備阿魏酸和低聚糖的應用。本發(fā)明所述的微生物指出芽短梗霉，海蓬子秸稈經(jīng)干燥粉碎達一定粒徑后，經(jīng)出芽短梗霉的代謝作用后產(chǎn)生木聚糖酶和阿魏酸酯酶的混合酶制劑，在此混合酶的協(xié)同作用下降解海蓬子秸稈細胞壁，獲得包括阿魏酸、低聚糖在內的生理活性物質，其所具有的抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突變和防癌的作用，可以在醫(yī)藥、食品和化妝品工業(yè)中廣泛應用。可以顯著提高海蓬子副產(chǎn)物秸稈的經(jīng)濟價值。
文檔編號C12R1/645GK102181489SQ201110060110
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月14日 優(yōu)先權日2011年3月14日
發(fā)明者余曉紅, 劉珊珊, 張春銀, 肖玲, 許偉, 邵榮, 陳洪興, 顧振新 申請人:江蘇綠海有機食品發(fā)展有限公司, 鹽城工學院