本發(fā)明涉及生物分子特別是RNA的穩(wěn)定化，包括用于穩(wěn)定RNA的方法、用于穩(wěn)定RNA的組合物和試劑盒和含有經(jīng)穩(wěn)定化RNA的組合物。還涉及細胞、組織、血液、外泌體和其他生物樣品的固定和穩(wěn)定化。

背景技術(shù)：
從生物樣品提取完整生物分子是許多實驗室和臨床診斷步驟的關(guān)鍵部分。諸如核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)的不穩(wěn)定性是公知的，并且其完整性取決于許多參數(shù)，例如樣品在從其最初環(huán)境取出之前的物理條件，樣品是如何快速地從其來源取出，樣品冷卻速率、樣品貯存溫度和生物分子純化方法。眾所周知的是，生物樣品純化之前和期間對生物樣品進行處理可以引起樣品分析物的完好性和完整性方面的非常重要的變化。例如眾所周知的是，尤其是RNA是極其易變的分子，如果不正確地處理，其在數(shù)分鐘內(nèi)會完全不可逆地受損。雖然RNA可能是較為易變的生物分子之一，包括翻譯后修飾在內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、對于代謝分析而言關(guān)鍵的小于2000道爾頓的小分子和DNA也進行實質(zhì)性的降解過程。雖然內(nèi)源性細胞酶是大多數(shù)降解性過程的原因，分析物總是傾向于在貯存或處理的過程中同時水解，并且該過程很大地取決于諸如溫度、含水量、pH、光和穩(wěn)定性等貯存條件以及分析物分子的分子量，而且還可以取決于所用試劑的品質(zhì)。成功貯存的最常見的簡單方法之一是降低生物樣品的溫度。通常將樣品貯存在低于室溫(20℃～24℃)的溫度；蛋白質(zhì)溶液貯存在4℃或-20℃，核酸在干冰或液氮中貯存在-20℃或-80℃的冰箱中?？梢蕴砑又T如疊氮化鈉等抗微生物劑以控制微生物生長。眾所周知的是，RNA對于被酶降解、自發(fā)性水解、二價金屬陽離子催化的水解、堿敏感性和FFPE(福爾馬林固定的石蠟包埋的)樣品中的交聯(lián)特別敏感。諸如鉛、鎂和錳等許多金屬溶液對RNA極具破壞性，并且確實不僅對于核酶而且對于諸如DNA酶I、綠豆核酸酶和S1核酸酶等核酸酶活性是關(guān)鍵的。鐵(2+)已經(jīng)作為芬頓反應(yīng)的一部分參與核苷堿基的氧化，產(chǎn)生翻譯上受損的rRNA和mRNA(Honda等人，(2005)J.Biol.Chem.280,20978-20986)，例如將鳥嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧-鳥嘌呤。已經(jīng)綜述了金屬離子在磷酸二酯鍵的酶促和非酶促切割中的其他可能的催化作用(Yarus,M.(1993)FASEBJ.7,31-39)。實際上經(jīng)常將諸如EDTA和EGTA等螯合劑添加至RNA或RNA裂解液以用于通過除去金屬離子來減少RNA降解的目的。核糖核酸酶(RNA酶)是一大組與包括微生物、人類皮膚、灰塵以及細胞和組織的內(nèi)含物等許多來源相關(guān)的普遍存在的酶。在冷凍-解凍過程中他們也易于從細胞內(nèi)囊泡釋放。已知包括胰腺在內(nèi)的一些組織特別富含RNA酶A。RNA酶A是已知最穩(wěn)定的酶之一，在例如離液鹽(chaotropicsalt)變性后容易恢復(fù)其酶促活性，使得其極其難以破壞。需要高濃度的離液劑(例如胍(4M～6M))來破壞RNA酶活性(Thompson.J.和Gillespie.D.AnalBiochem.(1987)163:281-91)。存在數(shù)種方法來抑制RNA酶活性，例如使用：(i)核糖核酸酶肽抑制劑(“RNasin”)，其是一種昂貴的試劑，僅以少量獲得，并且對RNA酶A、B和C具有特異性；(ii)諸如二硫蘇糖醇和β-巰基乙醇等還原劑，其破壞RNA酶中的二硫鍵，但是該效果是有限的和臨時的并且具毒性和不穩(wěn)定；(iii)諸如蛋白酶K等消化RNA酶的蛋白酶，但是蛋白酶在試劑盒中的轉(zhuǎn)運及其通常緩慢的作用使得分析物生物分子降解；(iv)將溫度降低至低于酶的活性溫度；常見的是將組織和細胞樣品貯存在-80℃或在液氮中；(v)抗-RNA酶抗體；(vi)使用諸如丙酮等溶劑或諸如硫酸銨等親液鹽(kosmotropicsalt)將包含RNA酶、DNA和RNA的細胞蛋白沉淀，硫酸銨的一種市售制品稱為RNAlaterTM(Sigma-Aldrich，美國；LifeTechnologies，美國；Qiagen,德國)；(vii)使全血中的核酸穩(wěn)定化的洗滌劑，例如見于PAXgeneTMDNA和RNA提取試劑盒(PreAnalytix,德國)中的洗滌劑；(viii)離液鹽；(ix)醇，例如見于PAXgeneTM組織穩(wěn)定劑(PreAnalytix,德國)中的醇。RNAIsolationandAnalysis,Jones編(1994)第2章中提出了各種此類離液混合物。樣品貯存的主要目標是將對分析物生物分子的任何改變最小化(所述改變可以是由于預(yù)分析步驟和樣品純化而引入)，從而使分析結(jié)果盡可能近地與生物分子的原始體內(nèi)復(fù)雜性和多樣性相似，由此提高檢驗精度、敏感性和特異性。雖然存在可用于減少預(yù)分析變化的各種方法和產(chǎn)品，其都有各種缺點，使得其使用存在問題或者是次優(yōu)的。有效地穩(wěn)定一類生物分子的方法通常對于穩(wěn)定其他是無效的，對于每種生物分子分析物技術(shù)人員必須選擇特定的試劑和方法。例如，PAXgeneTM體系(PreAnalytix)(美國專利6,602,718和6,617,170)可用于核酸，而不是蛋白質(zhì)，并且需要冗長的純化步驟以及多種洗滌緩沖液，同時蛋白酶抑制劑的混合物有助于防止蛋白質(zhì)降解而不是核酸。PAXgeneTM組織穩(wěn)定試劑盒需要對組織進行兩個單獨的處理，并且包括有毒和易燃的化學(xué)品。組織的RNAlaterTM處理減少了其在免疫組織化學(xué)、組織學(xué)的有用性，并且增加了組織硬度，而且沒有完全保護RNA，雖然其已經(jīng)被采納為RNA保護的金標準品。在提取樣品的時間或地點純化RNA不總是可行的，所述樣品例如來自醫(yī)院手術(shù)室的活組織檢驗或來自醫(yī)生辦公室的血液樣品。在這些情況下，在提取RNA之前樣品必須非常仔細地貯存，RNA的提取可能短至30分鐘進行，但是更常見的是僅僅在通過醫(yī)院病理實驗室處理后數(shù)小時或數(shù)天發(fā)生。通常對預(yù)分析步驟的時間和溫度的記錄較差，導(dǎo)致對樣品品質(zhì)的認知模糊。結(jié)果，需要針對每種組織和RNA的最終用途開發(fā)單獨的樣品貯存條件。如已提及，這通常包括使用專用的穩(wěn)定液(例如RNAlater或PAXgene)或者立即將樣品冷凍在液氮中。至少在PAXgene穩(wěn)定劑的情況下，穩(wěn)定劑的不完全去除會在純化過程中對RNA產(chǎn)率產(chǎn)生負面影響(PAXgeneBloodRNAKitHandbook,2005年6月)。組織貯存可以通過使用固定劑的組織固化實現(xiàn)?！肮潭?fixation)”是指增加機械強度、硬化、防腐和增加諸如新鮮細胞、活組織檢查或組織等受處理組織樣品的穩(wěn)定性，并且將樣品保持在與處天然狀態(tài)的原位的原始新鮮樣品盡可能相似的狀態(tài)。固定經(jīng)常用于病理學(xué)、組織學(xué)、組織化學(xué)、細胞化學(xué)、解剖學(xué)研究和研究細胞，并且通常先于例如貯存、包埋、染色、免疫組織化學(xué)和/或免疫細胞化學(xué)等另外的步驟。固定方法理想地抑制諸如核酸酶和蛋白酶等酶，停止微生物在樣品上的生長，并保持總體組織形態(tài)以及細胞超微結(jié)構(gòu)如高爾基體、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體和胞質(zhì)膜。作為一個實例，保持正確的細胞形態(tài)對于病理學(xué)家診斷患者中癌的存在、類型和等級而言是重要的，但是為了正確地這樣做，必須也能夠?qū)悠氛_地染色或用抗體標記以用于免疫組織化學(xué)。通常樣品用1％～5％的福爾馬林(甲醛)、多聚甲醛或戊二醛的緩沖水溶液在室溫處理1～24小時，以使蛋白質(zhì)與其他細胞成分交聯(lián)，然后在組織切片后，用蘇木精和曙紅染色劑(H&E)染色。雖然也可使用戊二醛，其向組織的滲透速率慢于甲醛(當相對于組織體積添加18～20體積時，其以約1mm/小時滲透)。雖然RNA也可以此方式保存，但是通常在福爾馬林固定過程中或固定后變得高度降解，使得基因表達高度成問題和失真。一個具體問題在于，RNA分析物與諸如蛋白質(zhì)等其他生物分子交聯(lián)，因此隨后在分析之前需要將它們釋放，該方法通常非?？量糖倚枰L期處于升高的溫度，這導(dǎo)致顯著的RNA降解。固定的另一問題在于將諸如RNA和蛋白質(zhì)等可溶性分析物保持在細胞中，因此他們可以通過例如原位雜交或免疫組織化學(xué)而完整化。特別地，福爾馬林固定的另一問題在于細胞蛋白質(zhì)的共價修飾導(dǎo)致抗原性免疫識別的損失，這使得免疫組織化學(xué)技術(shù)難以或不可能依賴于抗體。作為一個另外實例，福爾馬林固定的組織例行地包埋在石蠟中，以使組織塊被薄切片并進行顯微鏡檢查(FFPE)。其他常見組織固定法包括使用甲醇、乙醇或丙酮，其導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀而不是交聯(lián)。特別需要在固定組織、保持良好的RNA品質(zhì)的同時能夠進行免疫組織化學(xué)染色的方法。眾所周知的是，常用的固定劑例如甲醛、多聚甲醛、戊二醛和甲醇是高度有毒的潛在致癌原，同時乙醇和丙酮是高度易燃的。理想的固定劑應(yīng)該作用于廣泛的包括神經(jīng)、淋巴和脂肪在內(nèi)的各種組織，保存大片組織，并且與免疫組織化學(xué)、組織化學(xué)和原位雜交以及其他專門性技術(shù)相容。其還應(yīng)該與自動化組織固定方法相容。關(guān)于詳細策略的綜述已經(jīng)由Bancroft(2008)‘TheoryandPracticeofHistologicalTechniques’和Stanta(2011)‘GuidelinesforMolecularAnalysisinArchiveTissues’公開，而將組織固定和染色的代表性實例可見于Ross和Pawlina(2011)‘HistologyATextandAtlas’。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
在一個方面，本發(fā)明提供深共熔溶劑抑制生物分子的降解的應(yīng)用。已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以使用深共熔溶劑(DES)使生物樣品中的如RNA、DNA和蛋白質(zhì)等生物分子穩(wěn)定化。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以使用DES混合物來固定和保持諸如組織塊、癌活組織檢查和全血等生物樣品中的細胞形態(tài)。本發(fā)明描述了用于使用DES混合物穩(wěn)定和保持生物分子、全細胞、組織和生物樣品。樣品或組織可以包含實體組織或非實體組織。發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，許多DES混合物能夠穩(wěn)定和保持RNA、諸如蛋白質(zhì)和DNA等其他生物分子、細胞和組織結(jié)構(gòu)。使用在諸如氯化膽堿(6M)或尿素(5M)等水性溶液中的單獨的個體DES組分不提供RNA穩(wěn)定化或細胞固定，僅當所述組分組合在DES(如氯化膽堿:尿素)中時，他們才進行保持和穩(wěn)定化(表1)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，僅舉例而言，氯化膽堿與三氟乙酰胺的混合物對于穩(wěn)定細胞中的RNA同時保持細胞形態(tài)特別有效。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)氯化膽堿與山梨糖醇的混合物對于穩(wěn)定全組織中的RNA特別有效。不過，DES組分的極其大量的其他組合和比例也可用于實踐本發(fā)明。已經(jīng)報道了通過天然離子液體和天然DES分離混合物中的組分(WO2011/155829)，但是DES對穩(wěn)定生物分子或細胞的效果尚未報道。實際上在US2009/0117628A1中已經(jīng)指出，可以在DES中進行酶促反應(yīng)，并且各種酶反應(yīng)在各種DES中具有活性，表明核酸酶和蛋白酶以及其他分解代謝酶會同樣地具有活性。令人驚奇地是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，RNA和其他生物分子在DES混合物中得到穩(wěn)定，并且細胞形態(tài)被固定，證明細胞骨架也被固定。DES是當組合在一起時具有共熔點的兩種以上組分的混合物，共熔點是固化或凝固的溫度(Fp)。組合組分的共熔點通常大大低于任一個或者以任何其他比例混合的個體組分，并且在單一溫度發(fā)生而且個體組分不會在固化時發(fā)生分離。DES的性質(zhì)已經(jīng)描述于以下文獻中：A.P.Abbott,G.Capper,D.L.Davies,R.K.Rasheed,V.Tambyrajah,Chem.Commun.7(2003)70–71.；A.P.Abbott,D.Boothby,G.Capper,D.L.Davies,R.K.Rasheed,J.Am.Chem.Soc.126(2004)9142–9147；[7]G.Imperato,E.Eibler,J.Niedermaier,B.Konig,Chem.Commun.9(2005)1170–1172.；S.Gore,S.Baskaran,B.Koenig,GreenChem.13(2011)1009–1013.；J.T.Gorke,F.Srienc,R.J.Kazlauskas,Chem.Commun.10(2008)1235–1237.；A.P.Abbott,J.Collins,I.Dalrymple,R.C.Harris,R.Mistry,F.Qiu,J.Scheirer,W.R.Wise,Aust.J.Chem.62(2009)341–347.；Y.H.Choi,J.vanSpronsen,Y.Dai,M.Verberne,F.Hollmann,I.W.C.E.Arends,G.J.Witkamp,R.Verpoorte,PlantPhysiol.156(2011)1701–1705；且在ZhangQ,DeOliveiraVigierK,RoyerS,F.ChemSocRev.2012Nov7；41(21):7108-46中進行了綜述。工業(yè)上DES已經(jīng)用于電化學(xué)電鍍、采礦應(yīng)用和鉆探潤滑劑(US2009/0247432)、工業(yè)酶應(yīng)用(US2009/0117628A1)、制備無機化合物(D.Freudenmann,S.Wolf,M.Wolff和C.Feldmann,Angew.Chem.,Int.Ed.,(2011),50,11050–11060)或有機化合物(S.Gore,S.Baskaran和B.Koenig,GreenChem.,(2011),13,1009–1013)、生物提取(WO2011/155829)、在電化學(xué)中作為電解質(zhì)用于染料敏化的太陽能電池和金屬電拋光(H.-R.Jhong,D.Shan-Hill,C.-C.Wan,Y.-Y.Wang和T.-C.Wei,Electrochem.Commun.,(2009),11,209–211)、電沉積(E.Gomez,P.Cojocaru,L.Magagnin和E.Valles,J.ElectroanalyticalChem.,(2011),658,18–24)、生物柴油的純化(K.Shahbaz,F.S.Mjalli,M.A.Hashim和I.M.AlNashef,EnergyFuels,(2011),25,2671–2678)、藥物的增溶(H.G.Morrison,C.C.Sun和S.Neervannan,Int.J.Pharm.,(2009),378,136–139)、金屬氧化物的增溶(A.P.Abbott,D.Boothby,G.Capper,D.L.Davies和R.K.Rasheed,J.Am.Chem.Soc.,(2004),126,9142–9147)和CO2的增溶(X.Li,M.Hou,B.Han,X.Wang和L.Zou,J.Chem.Eng.Data,(2008),53,548–550)。VanSpronsen等人在WO2011/155829中提出將天然來源的DES(例如氨基酸、糖和羧酸的各種組合)用于提取，但是沒有提到他們在穩(wěn)定或固定細胞和組織方面的應(yīng)用。所描述的DES用于提取目的而不是穩(wěn)定和固定。DES不被認為是離子液體，原因在于：(i)他們不完全由離子物質(zhì)組成，和(ii)他們也可由非離子物質(zhì)獲得，(iii)他們是混合物而不是化合物。與傳統(tǒng)離子液體相比，源自例如氯化膽堿的DES具有數(shù)個優(yōu)點，例如：(1)低成本，(2)對水是化學(xué)惰性的，(3)容易通過簡單混合兩種以上組分制備，(4)大多數(shù)是生物降解性和非毒性的，(5)即使加熱時也是低揮發(fā)性的，和(6)不易燃。所有DES都在低于150℃是液體，許多在室溫～70℃是液體，少數(shù)突出的實例在0℃為液體。DES往往通過將鹵化季銨鹽與諸如ZnCl2等金屬鹽或諸如尿素等氫鍵供體混合而獲得，所述金屬鹽或氫鍵供體具有與季銨鹽的鹵素陰離子形成絡(luò)合物的能力。不過已經(jīng)發(fā)現(xiàn)例外，例如，在甜菜堿:三氟乙酰胺等DES中不存在鹵素陰離子。如本文所用，除非另外規(guī)定，術(shù)語“甜菜堿(betaine)”是指N,N,N-三甲基甘氨酸。本文討論的深共熔溶劑可以包括具有季銨基團的組分。具有季銨基團的組分可以是進一步包含羧酸根基團的兩性離子組分。優(yōu)選的兩性離子組分是甜菜堿(N,N,N-三甲基甘氨酸)。作為選擇，包含季銨基團的組分可以是具有合適的抗衡離子的鹽的形式?？购怆x子合適地是鹵素離子，優(yōu)選是氯離子、溴離子或碘離子，最優(yōu)選氯離子。其他合適的抗衡離子包括硝酸根和四氟硼酸根等。當所述組分為鹽的形式時，抗衡離子優(yōu)選不包含羧酸根基團。在另一方面，本發(fā)明提供使含RNA樣品中的RNA穩(wěn)定化的方法，所述方法包括使所述樣品與含DES的混合物接觸以形成穩(wěn)定的含RNA組合物。在另一方面，本發(fā)明提供使含DNA樣品中的DNA穩(wěn)定化的方法，所述方法包括使所述樣品與含DES的混合物接觸以形成穩(wěn)定的含DNA組合物。在另一方面，本發(fā)明提供使含肽樣品中的蛋白質(zhì)(包括磷蛋白)穩(wěn)定化的方法，所述方法包括使所述樣品與含DES的混合物接觸以形成穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)組合物。在另一方面，本發(fā)明提供固定細胞的天然形態(tài)和固定細菌、真菌、動物或植物樣品(例如大腸桿菌、酵母、線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠、擬南芥、水稻、小麥、玉米、煙草和/或馬鈴薯)中的RNA、DNA和/蛋白質(zhì)的方法。在另一方面，本發(fā)明提供固定和穩(wěn)定含細胞樣品中的細胞的天然形態(tài)的方法，所述樣品例如器官、組織，活組織檢查、循環(huán)腫瘤細胞(CTC)、血液樣品、血漿樣品、血清樣品、組織培養(yǎng)細胞、唾液、尿、腦脊液、醫(yī)學(xué)樣品、卵、胚胎、或成體組織、或者FFPE樣品，所述方法包括使所述含細胞樣品與含DES的混合物接觸以形成細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的固定物和穩(wěn)定物，其與細胞計數(shù)、CTC檢測、免疫組織化學(xué)、組織化學(xué)、染色和著色、流式細胞術(shù)、質(zhì)譜法、原位雜交、激光捕獲顯微切片和對例如RNA、DNA和/或蛋白質(zhì)等的分子分析相容。在另一方面，本發(fā)明提供固定和穩(wěn)定含細胞樣品中的細胞的天然形態(tài)的方法，由此可以通過使用著色劑、抗體或適體確定蛋白含量和蛋白細胞定位，所述方法包括使所述含細胞樣品與含DES的混合物接觸以形成細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的固定物和穩(wěn)定物，同時或隨后使所述樣品與著色劑、抗體或適體接觸。在另一方面，本發(fā)明提供用于固定和穩(wěn)定含細胞樣品中的細胞天然形態(tài)的方法，由此可以通過使用經(jīng)標記或未標記的探針確定RNA含量和其細胞定位，所述探針例如寡核苷酸、引物、PNA、LNA、DNA、bDNA或RNA序列、天然或合成互補核酸序列，所述方法包括使含細胞樣品與含DES的混合物接觸以形成細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的固定物或穩(wěn)定物，并且同時或隨后使所述樣品與天然或合成雜交序列接觸以用于分子分析。在另一方面，本發(fā)明提供用于使生物樣品中的RNA、DNA和/或蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個含DES混合物的容器。所述試劑盒還包含用于使所述樣品與DES混合物接觸的說明書，由此所述生物樣品中的RNA、DNA和/或蛋白質(zhì)針對降解而穩(wěn)定。在另一方面，本發(fā)明提供用于使生物樣品中的細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個含DES混合物的容器。所述試劑盒還包含用于使所述樣品與DES混合物接觸的說明書，由此所述DES混合物充當細胞結(jié)構(gòu)的固定劑和/或穩(wěn)定劑，所述細胞結(jié)構(gòu)用于顯微鏡和/或組織學(xué)研究，例如染色和著色、ISH和/或IHC。在另一方面，本發(fā)明提供用于固定生物樣品中的細胞和組織結(jié)構(gòu)與形態(tài)的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個含DES固定和/或穩(wěn)定性混合物的容器，并且可選地是其中所述容器是可滲透的，并且最大高度為10mm，所述樣品浸入該容器并且被固定和/或穩(wěn)定化。可滲透容器的壁可以是濾網(wǎng)(sieve)或格柵，或者設(shè)置有狹縫，該狹縫允許DES混合物進入和接近細胞或組織樣品，和/或隨后接觸液體石蠟。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物與添加劑的組合的充當生物分子的固定劑和穩(wěn)定劑的應(yīng)用，所述生物分子包括RNA、DNA和/或蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)穩(wěn)定化的含RNA組合物，所述組合物包含RNA和DES混合物。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)穩(wěn)定化的含DNA組合物，所述組合物包含DNA和DES混合物。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)穩(wěn)定化的含蛋白質(zhì)組合物，所述組合物包含蛋白質(zhì)和DES混合物。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為細胞結(jié)構(gòu)和/或組織的組織學(xué)和/或形態(tài)學(xué)的穩(wěn)定劑以及RNA、DNA和/或蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為細胞結(jié)構(gòu)和/或組織的組織學(xué)和/或形態(tài)學(xué)的穩(wěn)定劑在隨后包埋到石蠟和切片機切片以及可選的染色、原位雜交和/或免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為細胞結(jié)構(gòu)和/或組織的組織學(xué)和/或形態(tài)學(xué)的穩(wěn)定劑在隨后冷凍冰凍切片(frozencryostatsectioning)以及可選的染色、原位雜交和/或免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為細胞結(jié)構(gòu)和/或組織的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)的穩(wěn)定劑在隨后激光捕獲顯微切割(LCM)以及可選的回收蛋白質(zhì)、DNA和RNA中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為用于后續(xù)診斷分析的血漿、血清和血液(其包括循環(huán)腫瘤細胞和/或血液白細胞和/或全血)中的生物分子和/或細胞的穩(wěn)定劑的應(yīng)用，所述診斷分析包括細胞捕獲、計數(shù)和/或分型、染色和/或著色、質(zhì)譜、原位雜交和/或免疫組織化學(xué)?？蛇x地，可以進行蛋白質(zhì)、DNA和RNA的回收。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為外泌體、其他類型的囊泡、微囊泡、亞細胞體和顆粒(例如，膠束；脂質(zhì)體；內(nèi)體；細胞碎片；細胞膜；細胞核；如胞吞室、高爾基、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或線粒體等細胞質(zhì)成分)的穩(wěn)定劑的應(yīng)用。其還涉及對源自血液、血清、血漿、尿、腦脊液和其他體液的外泌體內(nèi)含有的RNA、DNA和/或蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化，以便用于貯存、運輸和處理從而用于診斷測試，例如提取、分析和/或鑒定外泌體或其他細胞外微囊泡內(nèi)含有的miRNA或mRNA。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為預(yù)純化顆粒和分子的穩(wěn)定劑的應(yīng)用，所述預(yù)純化顆粒和分子例如病毒顆粒、噬菌體、RNA、DNA、諸如酶和抗體等蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和脂肪和/或碳水化合物。此處將預(yù)純化定義為樣品由大于80％的目標顆?；蚍肿咏M成。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為用于后續(xù)病原體診斷分析(包括細菌和/或病毒診斷)的血漿、血清、血沉棕黃層和/或血液中的生物分子、細菌、真菌和/或其他病原體(例如，利什曼原蟲屬(Leishmania)、錐蟲屬(Trypanosoma)和/或瘧原蟲屬(Plasmodium))的穩(wěn)定劑的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供DES混合物作為用于后續(xù)病毒診斷分析的諸如痰、拭液、血漿、血清、血沉棕黃層和/或血液等生物樣品中的病毒、病毒顆粒、病毒核酸和/或蛋白質(zhì)(例如流感病毒、HPV、HIV、HBV、HCV、口蹄疫病毒、流感病毒、SARS和/或西尼羅河病毒)的穩(wěn)定劑的的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供適用于細胞或組織固定和/或適用于抑制生物分子的降解的設(shè)備，所述設(shè)備包括：由第一深共熔溶劑形成的第一深共熔溶劑層；和在所述第一深共熔溶劑層中的用于接收包含所述生物分子的樣品的凹槽(recess)，其中所述第一深共熔溶劑是固體或凝膠。所述設(shè)備可以還包含由第二深共熔溶劑形成的第二深共熔溶劑層，其中所述第二深共熔溶劑層包封所述凹槽；并且其中所述第二深共熔溶劑是固體或凝膠。所述第一深共熔溶劑和/或第二深共熔溶劑是如本文所定義的深共熔溶劑，并優(yōu)選包含選自3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-二氟-2-苯基乙酰胺、尿素和硫脲的組分。所述第一深共熔溶劑和/或第二深共熔溶劑還可以包含選自氯化膽堿、碘化丁酰膽堿和N,N,N-三甲基甘氨酸的組分。本發(fā)明的適用于細胞或組織固定和/或適用于抑制生物分子的降解的設(shè)備包含由第一深共熔溶劑形成的第一深共熔溶劑層。所述第一深共熔溶劑是固體或凝膠。合適的是，選擇深共熔溶劑的組分以使深共熔溶劑在期望的使用條件(例如約25℃的溫度和約1個大氣壓的壓力)下是固體。作為選擇或另外地，所述深共熔溶劑可以與在期望使用條件下為固體或凝膠的基質(zhì)材料共混。具體而言，用作第一深共熔溶劑的優(yōu)選深共熔溶劑包括：氯化膽堿:3,3,3-三氟丙酰胺(可選的是摩爾比為約1:2)；氯化膽堿:2,2-二氟-2-苯基乙酰胺(可選的是摩爾比為約1:1)；氯化膽堿:海藻糖(可選的是摩爾比為約1:1)；碘化丁酰膽堿:尿素(可選的是摩爾比為約1:2)。如果所述設(shè)備包含第二深共熔溶劑，所述第一深共熔溶劑和第二深共熔溶劑可以相同或不同。優(yōu)選的是，第二深共熔溶劑選自：氯化膽堿:3,3,3-三氟丙酰胺(可選的是摩爾比為約1:2)；氯化膽堿:2,2-二氟-2-苯基乙酰胺(可選的是摩爾比為約1:1)；氯化膽堿:海藻糖(可選的是摩爾比為約1:1)；碘化丁酰膽堿:尿素(可選的是摩爾比為約1:2)。在另一方面，本發(fā)明提供其中深共熔溶劑是本文所定義的深共熔溶劑的試劑盒。本發(fā)明不特別限制在任何類型的生物分子的穩(wěn)定化，但是通常較為顯著的是RNA的品質(zhì)和完整性的改善，因為RNA是細胞中最脆弱的分子之一，這歸因于其長度和對環(huán)境攻擊的化學(xué)敏感性。通常憑經(jīng)驗而言，可以認為如果細胞rRNA分子是完好的則mRNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和小代謝物也會是完好的，但是如果rRNA被降解，則取決于各生物分子的具體化學(xué)敏感性，其他生物分子可能也被降解或者可能不被降解。存在一些例外，例如如果組織或細胞特別富含諸如RNA酶、DNA酶、脂酶、酯酶、蛋白酶或磷酸酶等特定酶，其會引起一類特定生物分子的特異性降解或修飾。所提及的RNA可以發(fā)現(xiàn)于樣品、源自樣品或與樣品結(jié)合，所述樣品例如為病毒、細胞、循環(huán)腫瘤細胞、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液、血清、血漿、血液、外泌體、諸如FFPE塊或切片等其他微泡保存的樣品、活組織檢查、固體或液體的組織或其他生物樣品。也可以是含核苷或核苷酸的分子，例如cAMP、ATP、GTP、脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的單體、二聚體和寡聚體、脫氧核糖寡核苷酸和核糖寡核苷酸、質(zhì)粒DNA、基因組DNA、線粒體DNA、RNA(諸如微RNA(miRNA)、piRNA、siRNA、tRNA、類病毒、循環(huán)RNA、循環(huán)單鏈或雙鏈的非編碼RNA、hnRNA、mRNA、rRNA(如5S、5.8S、16S、18S、23S和28SrRNA物質(zhì))以及源自例如HCV、西尼羅河病病毒、口蹄疫病毒、流感病毒、SARS或HIVRNA的病毒RNA和/或細胞外RNA(exRNA))。其也可以是源自合成有機步驟(如寡聚物合成儀)的分子、RNA和DNA的混合物、RNA和DNA的嵌合物、如體外RNA轉(zhuǎn)錄等酶促反應(yīng)的產(chǎn)物、擴增的RNA(aRNA)、核酶、適體、PCR擴增、滾環(huán)擴增(RCA)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、內(nèi)部對照標準物或?qū)φ誖NA。會受益于本發(fā)明的RNA分析法包括mRNA模板的體外或體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯、RNA依賴性RNA聚合、DNA依賴性RNA聚合、RNA剪接分析、RNA折疊分析、適體和核酶生產(chǎn)、光密度(OD)測定、RNA:蛋白質(zhì)相互作用研究、RNA電泳和沉降(包括分子量標準物)、RNA生物綴合、RNA連接、RNA折疊研究、RNA足跡分析、RNANMR結(jié)構(gòu)研究、RNA寡核苷酸合成、RNA原位、原位雜交(ISH)、熒光原位雜交(FISH)、RNA測序、逆轉(zhuǎn)錄(RT)、RT-PCR、RT-qPCR、核酸酶保護分析、雜交技術(shù)(例如包括RNA印跡)bDNA和微陣列(包括探針制備)、熒光核酸標記、NASBA、RNAi、miRNA技術(shù)(例如提取和定量)以及要求對RNA進行品質(zhì)控制和/或定量或定性測定的那些方法。不穩(wěn)定性是指RNA的分子量的改變或RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，此類不穩(wěn)定性與分析物分子的處理、貯存、運輸和/或?qū)嶋H分析相關(guān)。生物分子不穩(wěn)定性經(jīng)常取決于天然存在的代謝酶、特別是RNA酶的活性，RNA酶可以顯著改變RNA的分子量或涉及分子量小得多的原始分析物分子的變體。此類RNA酶的來源可以為生物樣品自身，例如他們可以在樣品處理后逐漸地釋放，或者由于對組織進行不良處理而大量釋放，例如對其進行了冷凍-解凍，該過程通常導(dǎo)致含有蛋白酶和核酸酶的細胞內(nèi)囊泡的破裂，所述蛋白酶和核酸酶隨后流入細胞質(zhì)從而導(dǎo)致分析物的非常高速率的降解。作為選擇，降解性酶可以來自樣品環(huán)境的外部污染，例如微生物污染或樣品的腐敗。分析物不穩(wěn)定性通常與分析過程的敏感性或性能降低相關(guān)，無論分析物是蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)還是代謝物?！敖到狻笔侵缸鳛樯锓肿雍?或分析物不穩(wěn)定性的后果所發(fā)生的物理或化學(xué)變化。作為與核酸相關(guān)的降解的一些實例，降解可以是指核苷堿基的脫氨基(例如胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶)、諸如鳥嘌呤等核苷堿基的氧化、甲基-胞嘧啶的甲基的失去、例如脫嘌呤過程中一個或多個核苷堿基的失去、磷酸二酯鍵的切割(導(dǎo)致鏈切割)以及從大體積的核酸分子失去一個或多個核苷酸。其不僅僅指分子的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)的變化?！巴暾浴笔侵阜肿拥耐暾?，因此與降解相反?！皩嵸|(zhì)上降解”是指所含的至少一半分析物分子被切割或者分子量減少5％以上的樣品。確定降解的方法是公知的，并且取決于分析物分子(參見Sambrook等,(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版)，ColdSpringHarborUniversityPress,NY)。分子量以及因此核酸的降解程度的確定通常使用變性或天然凝膠電泳進行，并且可以包括使用經(jīng)標記的雜交探針進行的DNA或RNA印跡。RNA定量可以包括使用RNA芯片和AgilentBioanalyser2100TM系統(tǒng)進行分析并計算“RNA完整數(shù)”(RIN)。核酸降解也可以使用例如LightcyclerTM(Roche)和合適的擴增探針通過用于DNA的Q-PCR和用于RNA的RT-qPCR方便地定量。在使用寡dT引物進行逆轉(zhuǎn)錄后，計算(通常是β-肌動蛋白的)mRNA的3’/5’末端的RT-qPCR擴增比，也常用于評估RNA降解。其他方法包括細胞或組織的全部mRNA含量的RNAseq，或者使用進行分析之后比較表示mRNA的3’至5’位點的寡核苷酸的相對雜交信號。長度小于100個核苷酸的較小單鏈或雙鏈核酸(例如寡核苷酸和miRNA)，通過質(zhì)譜法(例如MALDI-TOFMS)最準確地定量，該技術(shù)的額外優(yōu)點是還能夠確定不顯著改變分析物的分子量的降解事件(例如核苷堿基的脫嘌呤或脫氨基)。大多數(shù)miRNA分析通過專用RT-qPCR進行。雖然用于確定RNA的降解程度的方法精密，顯然一些mRNA序列比其他序列對降解要更敏感的多，并且由于18和28SrRNA對降解相對穩(wěn)定，他們僅僅是mRNA降解程度的不良替代標志物。如上所解釋的，準確地分析mRNA降解目前使用RT-qPCR最好地進行。對于評價作為RNA純化的結(jié)果的RNA降解方法的詳細描述，請參見Muyal等,(2009)Diag.Path.4:9。RNA或DNA的“純樣品”是指其中OD260/280比為1.7以上的核酸水溶液。雖然通常而言不穩(wěn)定性和降解與被研究分子(“分析物”)的總分子量減少相關(guān)，與之相反地，其也可以與貯存過程中逐漸聚集的復(fù)合物的分子量增加相關(guān)。后者的一個實例是在全組織貯存過程中蛋白質(zhì)復(fù)合或聚集至核酸上，或者將樣品例如用福爾馬林固定的石蠟包埋組織(”FFPE”)處理過程中分子的化學(xué)交聯(lián)?！胺€(wěn)定”是指與對照相比分析物分子的降解量總體減少的狀況。所述對照可以是不應(yīng)用本發(fā)明所用的條件，例如不使用任何穩(wěn)定劑(圖11)貯存，但是RNA的降解速率通常過高以致于不能作為有用的比較，因此較佳的對照是根據(jù)制造商說明使用的市售RNAlater(貨號76106,Qiagen,德國)。對照可以是一塊切除的組織(例如生物活組織)、血液或血清樣品，或者是在RNAlater中于例如4℃、20℃或37℃貯存1～16小時或1～45天的貯存的一塊組織。組織破壞是指大組織樣品分成顆粒的過程，所述顆粒足夠小以能夠隨后通過添加離液劑溶液(chaotropesolution)被裂解。破壞將樣品分成塊，所述塊小至足以能夠充分地釋放分析物以用于隨后的RNA提取和純化?？梢赃M行“RNA酶失活”步驟以使RNA酶充分地失活，并允許隨后用DES混合物穩(wěn)定化而不會顯著地降解RNA。對于使RNA酶失活，本領(lǐng)域已知許多方法，例如用諸如胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶或蛋白酶K等蛋白酶酶促降解；用β-巰基乙醇(Chirgwin等，"IsolationofBiologicallyActiveRibonucleicAcidfromSourcesEnrichedinRibonuclease,"Biochemistry,18:5294-5299,1979)、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚醇、谷胱甘肽或TCEP來減少二硫鍵；添加RNasin蛋白(LifeTechnologies,美國)、RNAsecureTM(LifeTechnologies,美國)；用諸如鹽酸胍、異硫氰酸胍(Chomczynski和Sacchi,"SingleStepMethodofRNAIsolationbyAcidGuanidineIsothiocyanate-Phenol-ChloroformExtraction,"Anal.Biochem.,162:156-159,1987；Sambrook等，"MolecularCloning,ALaboratoryManual,"pp.7.16-7.52,1989)、尿素、甲酰胺、甲醛或碘乙酸鈉等離液劑處理；用諸如Tween-20、TritonX-100、NP-40、SLS或SDS、EDTA、EGTA、檸檬酸鈉處理；熱或酸變性；用氧釩核糖核苷復(fù)合物(Berger和Birkenmeier,1979)抑制或用戊二醛交聯(lián)。如本文一個實施例中所提出，在DES混合物處理之前，首先處理組織樣品以使RNA酶活性減少至其未處理活性的至少50％、75％或更優(yōu)選100％。處理前的殘留RNA酶活性可以使用RNaseAlertTM試劑盒(LifeTechnologies,美國)監(jiān)測。用于使組織中的RNA酶失活的方法在美國專利第6,777,210號和美國專利申請公開第2009/0286304號中提出。舉例而言，但并非限制，DES通過將一種或多種組分與一種或多種也能形成DES的其他組分混合或者混合和加熱而制造，所述一種或多種組分可以選自下述組：硝酸膽堿、四氟硼酸膽堿、氫氧化膽堿、酒石酸氫膽堿、檸檬酸二氫膽堿、對甲苯磺酸膽堿、碳酸氫膽堿、氯化膽堿、溴化膽堿、碘化膽堿、氟化膽堿、氯化氯代膽堿、溴化溴代膽堿、碘化碘代膽堿、氫氧化乙酰膽堿、酒石酸氫乙酰膽堿、檸檬酸二氫乙酰膽堿、對甲苯磺酸乙酰膽堿、碳酸氫乙酰膽堿、氯化乙酰膽堿、溴化乙酰膽堿、碘化乙酰膽堿、氟化乙酰膽堿、氯化氯乙酰膽堿、溴化溴乙酰膽堿、碘化碘乙酰膽堿、氫氧化丁酰膽堿、酒石酸氫丁酰膽堿、檸檬酸二氫丁酰膽堿、對甲苯磺酸丁酰膽堿、碳酸氫丁酰膽堿、氯化丁酰膽堿、溴化丁酰膽堿、碘化丁酰膽堿、氟化丁酰膽堿、氯化氯丁酰膽堿、溴化溴丁酰膽堿、碘化碘丁酰膽堿、氯化乙酰硫代膽堿、L-肉毒堿、D-肉毒堿、甜菜堿、肌氨酸、N-氧化三甲基胺、鹽酸甜菜堿、十六烷基甜菜堿、十六烷基三甲基氟化銨、十六烷基三甲基氯化銨、十六烷基三甲基溴化銨、月桂基甜菜堿、N,N-二亞甲基乙醇氯化銨、N,N-二乙基乙醇氯化銨、氯化β-甲基膽堿、氯化磷酸膽堿、檸檬酸膽堿、氯化苯甲酰膽堿、月桂基磺基甜菜堿、苯甲基三甲基氯化銨、甲基三苯基氯化鏻、甲基三苯基溴化鏻、甲基三苯基碘化鏻、甲基三苯基氟化鏻、N,N-二亞乙基乙醇氯化銨、乙基氯化銨、四甲基氯化銨、四甲基溴化銨、四甲基碘化銨、四甲基氟化銨、四乙基氯化銨、四乙基溴化銨、四乙基碘化銨、四乙基氟化銨、四丁基氯化銨、四丁基溴化銨、四丁基碘化銨、四丁基氟化銨、(2-氯乙基)三甲基氯化銨、氯化鋱(III)、氯化鋅(Ⅱ)、溴化鋅(Ⅱ)、氯化鋯(III)、氯化鐵(III)、氯化錫(Ⅱ)、氯化銅(II)、氯化鎂(Ⅱ)；所述一種或多種其他組分包括例如(但并非限制)選自下述組的化學(xué)品：尿素、甲酰胺、硫脲、1-甲基脲、1,1-二甲基脲、1,3-二甲基脲、碳酰肼、四甲基脲、1,3-雙(羥基甲基)脲、苯甲酰胺、吉拉爾特試劑(GirardsReagent)T、乳酰胺、乙酰胺、氟乙酰胺、二氟乙酰胺、三氟乙酰胺、氯氟乙酰胺、氯二氟乙酰胺、氯乙酰胺、二氯乙酰胺、二氯氟乙酰胺、三氯乙酰胺、溴乙酰胺、二溴乙酰胺、三溴乙酰胺、溴氟乙酰胺、溴二氟乙酰胺、溴氯氟乙酰胺、碘乙酰胺、二碘乙酰胺、三碘乙酰胺、2-甲基-2,2-二氟乙酰胺、2-甲基-2-氟乙酰胺、2,2-二甲基-2-氟乙酰胺、2-乙基-2,2-二氟乙酰胺、2-乙基-2-氟乙酰胺、2,2-二乙基-2-氟乙酰胺、2-丙基-2,2-二氟乙酰胺、2-丙基-2-氟乙酰胺、2,2-丙基-2-氟乙酰胺、2-氟丙酰胺、3-氟丙酰胺、2,2-二氟丙酰胺、2,3-二氟丙酰胺、3,3-二氟丙酰胺、3,3,3-三氟丙酰胺、2-氟-3,3,3-三氟丙酰胺、2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、五氟丙酰胺、六氟丁酰胺、三甲基乙酰胺、1-(三氟乙?；?咪唑、N,O-雙(三氟乙酰基)羥胺、雙三氟乙酰胺、N-甲基-氟乙酰胺、N-甲基-二氟乙酰胺、N-甲基-三氟乙酰胺、N-甲基-氯氟乙酰胺、N-甲基-氯二氟乙酰胺、N-甲基-氯乙酰胺、N-甲基-二氯乙酰胺、DN-甲基-二氯氟乙酰胺、N-甲基-三氯乙酰胺、N-甲基-溴乙酰胺、N-甲基-二溴乙酰胺、N-甲基-三溴乙酰胺、N-甲基-溴氟乙酰胺、N-甲基-溴二氟乙酰胺、N-甲基-溴氯氟乙酰胺、N-甲基-碘乙酰胺、N-甲基-二碘乙酰胺、N-甲基-三碘乙酰胺、N-甲基-2-甲基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-甲基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-二甲基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-乙基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-乙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-二乙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-丙基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-丙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-丙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-氟丙酰胺、N-甲基-3-氟丙酰胺、N-甲基-2,2-二氟丙酰胺、N-甲基-2,3-二氟丙酰胺、N-甲基-3,3-二氟丙酰胺、N-甲基-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-氟-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2,2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2,2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-五氟丙酰胺、N-甲基-六氟丁酰胺、N,N-二甲基-2,2,2-三氟乙酰胺、N-乙基-2,2,2-三氟乙酰胺、N,N-二乙基-2,2,2-三氟乙酰胺、N-(羥基甲基)三氟乙酰胺、三氟乙酸乙酯、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚醇、β-巰基乙醇、青霉胺、硫普羅寧(Tiopronin)、丙烯酰胺、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、甲醛、戊二醛、?；撬?、烏頭酸、己二酸、苯甲酸、檸檬酸、丙二酸、蘋果酸、DL-馬來酸、草酸、苯乙酸、苯丙酸、琥珀酸、乙酰丙酸、酒石酸、沒食子酸、對甲苯磺酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、乙二醇、三乙二醇、甘油、間苯二酚、苯酚、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇、1,12-十二烷二醇、間甲酚、咪唑、1-甲基咪唑、4-甲基咪唑、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、N-苯甲基吡咯烷酮、2-咪唑啉酮、四氫-2-嘧啶酮、胍、鹽酸胍、異氰酸胍、硫酸胍、乙酸銨、碳酸氫銨、氯化銨、檸檬酸氫二銨、甲酸銨、碘化銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、氨基磺酸銨、硫酸銨、酒石酸氫二銨、異硫氰酸銨、苯甲酸銨、溴化銨、氟化銨、硫酸氫銨、三氟乙酸銨、硫代硫酸銨、阿東糖醇(Adonitol)、核糖醇、鼠李糖、海藻糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖醇、山梨糖、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、甘露糖醇、阿拉伯糖、半乳糖、棉子糖、肌醇、赤蘚糖醇或木糖。應(yīng)該意識到，本文公開的一些化合物可以是可電離的，即一些化合物可以是弱酸、弱堿或兩性電解質(zhì)?？山怆x化合物的游離形式的代表旨在涵蓋相應(yīng)的電離形式。例如，羧酸基團的代表涵蓋相應(yīng)的羧酸根基團。應(yīng)該注意，諸如氯化鋅等某些化合物可以不僅與氯化膽堿還與尿素形成DES；氯化膽堿和氯化鋅出現(xiàn)在上述同一組分組中，因此某些DES混合物可以由同一組內(nèi)的化學(xué)品形成。還應(yīng)該注意，以上列表是非排他性的，并且除了DES組分之間常存在氫鍵外(但并非必須)，DES組分不特別限于任何類型的分子或性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明使用的深共熔溶劑優(yōu)選基本上不含有機酸。具體而言，根據(jù)本發(fā)明使用的深共熔溶劑優(yōu)選基本上不含選自以下的有機酸：蘋果酸、馬來酸、檸檬酸、乳酸、丙酮酸、富馬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、烏頭酸、酒石酸、抗壞血酸、丙二酸、草酸、葡糖醛酸、神經(jīng)氨酸和唾液酸。作為選擇或另外地，式II和III中所示的R6、R7和R8經(jīng)選擇以使所得化合物不包含羧酸基團。在優(yōu)選設(shè)定中，當R6是OH時，R7不是羰基。在另一優(yōu)選設(shè)定中，當R7是–Z-C(O)R8時，R8不是OH。根據(jù)本發(fā)明使用的深共熔溶劑優(yōu)選基本上不含金屬鹽。在一個設(shè)定中，深共熔溶劑基本上不含除了鋅或鋯的鹽之外的金屬鹽。深共熔溶劑優(yōu)選基本上不含NaH2PO4、Na2HPO4、NaHSO3、Na2SO4、MgCl2、CaCl2、KCl、NaCl和KI。如果深共熔溶劑包含糖或糖醇，則深共熔溶劑特別優(yōu)選不包含金屬鹽。根據(jù)本發(fā)明使用的深共熔溶劑優(yōu)選基本上不含選自以下的糖或糖醇：蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖、阿拉伯糖、核糖、核酮糖、半乳糖、鼠李糖、棉子糖、木糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、赤蘚醇和阿東糖醇。如果深共熔溶劑包含金屬鹽，則深共熔溶劑特別優(yōu)選不包含糖或糖醇。還應(yīng)該注意，DES混合物中的DES組分沒有特定的最大數(shù)目，例如可以將2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種組分以通常為整數(shù)(但并非必須)的摩爾比混合，以產(chǎn)生DES混合物，例如在雙組分DES混合物中，組分1和組分2可以以下述比例混合：10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10(摩爾:摩爾)；或者例如在三組分DES混合物中，組分1、組分2和組分3可以以這些比例混合：10:1:1、9:1:1、8:1:2、7:1:3、6:1:4、5:1:5、4:1:6、3:1:7、2:1:8、1:1:9、1:2:8、1:3:7、1:4:6、1:5:5、1:6:4、1:7:3、1:8:2、1:9:1、1:10:1(摩爾:摩爾:摩爾)。技術(shù)人員會理解，組分的其他混合比例也是可以的，例如20:1或者1:30(摩爾:摩爾)，并且對于特定目的，例如穩(wěn)定RNA和/或固定細胞形態(tài)而言，產(chǎn)生共熔點的特定摩爾比不必是最優(yōu)的期望的摩爾比。DES的穩(wěn)定活性可以與DES混合物的氫鍵合性質(zhì)相關(guān)。對于制造用于特定應(yīng)用的有用DES混合物對組分的數(shù)目或者混合比例沒有特別限制或限定?？梢酝ㄟ^添加另外的組分，或者作為選擇，通過添加下述的“添加劑”，來改變DES的其他物理性質(zhì)，例如粘性或密度。一些DES混合物可以使用分數(shù)摩爾比制備，例如，ZnCl2:尿素以1:3.5(摩爾:摩爾)制備，并且同樣地，對使用的組分1和組分2、或者組分1、組分2和組分3的摩爾比沒有特別限定，包含在待用于諸如細胞固定等應(yīng)用的DES混合物中的組分的最佳比例通過經(jīng)驗最精確地確定。僅舉例而言，氯化膽堿/三氟乙酰胺可以以2:1、1.75:1、1.5:1、1.25:1、1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75或1:2(摩爾:摩爾)的比例或其其他的分數(shù)量混合，然后單獨地測試以確定具有最佳RNA穩(wěn)定化和/或細胞固定性質(zhì)的比例。諸如成本或毒性等其他因素也可以使技術(shù)人員減少特定組分的比例，并且用便宜的替代品部分地將其代替。僅舉例而言，對于一些應(yīng)用，氯化乙酰膽堿:尿素(1摩爾:2摩爾)DES混合物可以被較便宜的氯化膽堿代替，如氯化乙酰膽堿:氯化膽堿:尿素(1摩爾:1摩爾:4摩爾)。對技術(shù)人員顯而易見的是，例如，由于在用于制造DES的組分中污染的存在(例如水、氧化、吸收CO2、合成過程中污染副產(chǎn)物或組分之一的分解產(chǎn)物)，1:1(摩爾：摩爾)(僅舉例而言)混合物的所需確切比例可以實際上意味著在組分1或者組分2的確切量上有+/-10％、但更優(yōu)選5％、甚至更優(yōu)選1％的差異。舉例而言，5％的誤差可能產(chǎn)生以下最終摩爾比：0.95:1、1:0.95、1.05:0.95或0.95:1.05(摩爾:摩爾)，該誤差的影響通常僅憑經(jīng)驗確定，例如其對RNA品質(zhì)的影響，如在實施例1中提出。通常為了除去包括水在內(nèi)的污染物，可以進行公知的在乙醇中再結(jié)晶的步驟，然后充分抽真空和/或化學(xué)干燥。方法見‘PurificationofLaboratoryChemicals’Butterworth-Heinemann(2012)中所述。通常而言，但不是排除性的，通過將氫鍵受體與氫鍵供體混合來制備DES，所述氫鍵受體來自下述類別的化學(xué)品之一：(i)具有帶正電陽離子的氮鹽，例如伯氮、仲氮、叔氮或季氮，氮鹽的一個實例是具有鹵離子的氮鹽，例如氯化膽堿；(ii)金屬鹽，例如過渡金屬鹵化物；所述氫鍵供體可以包括(iii)胺；(iv)羥基；(v)醛；(vi)酰胺或(vii)羧酸，因此可以包括例如糖、羧酸、脲(諸如三氟乙酰胺)和醇等氫鍵供體。在一個設(shè)定中，深共熔溶劑是III型或IV型深共熔溶劑，其中如使用AgilentBioanalyser2100所測定，大鼠肝臟樣品與400mg深共熔溶劑在24℃溫育20天，提取自10mg所述大鼠肝臟樣品的RNA具有的RNA完整數(shù)(RNAintegritynumber)(RIN)為至少4.0。RNA完整數(shù)可以使用RNA6000Nano總RNA試劑盒(貨號5067-1511,AgilentTechnologies,美國)和Bioanalyser2100儀器(貨號G2939AA,AgilentTechnologies,美國)測定。如本文所用，術(shù)語“III型深共熔溶劑”是指具有至少第一組分和第二組分的深共熔溶劑，其中所述第一組分是季銨或鏻化合物，例如氯化膽堿或N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜堿)，并且其中第二組分是氫鍵供體，例如尿素或三氟乙酰胺。IV型深共熔溶劑是包含至少第一組分和第二組分的深共熔溶劑，其中第一組分是金屬鹽，例如氯化鋅，并且其中第二組分是氫鍵供體，例如尿素。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉從組織樣品提取RNA的方法。適合的是，RNA可以使用RNeasy微型試劑盒(貨號：74106,Qiagen,德國)根據(jù)制造商說明提取，雖然可以使用其他方法。本發(fā)明提供深共熔溶劑作為病毒、細胞或組織固定劑來產(chǎn)生經(jīng)固定的病毒、細胞或組織的應(yīng)用。優(yōu)選的是，對于生長于基體(substrate)上并與深共熔溶劑在24℃溫育1小時的海拉細胞，在用水替換深共熔溶劑并在24℃溫育1小時之后，所述海拉細胞中的至少75％仍然附著。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于確定保持附著在基體的細胞的數(shù)量的方法。例如，約2,000個海拉細胞可以生長在合適的基體上，例如蓋玻片上。合適的蓋玻片的一個實例是CellatticeTM：(微劃線細胞培養(yǎng)蓋玻片表面，貨號：CLS5-25D-050NexcelomBioscience,美國)?？梢詫⒒w放在組織培養(yǎng)板上，并在合適的緩沖液中(例如2mlDMEM/10％FBS)中生長過夜。在基體的規(guī)定區(qū)域中附著細胞的數(shù)量可以使用10×顯微鏡物鏡手動計數(shù)。組織培養(yǎng)基可以使用例如移液管除去，并用400mg的深共熔溶劑替換?？梢詫⒔M織培養(yǎng)物在室溫溫育1小時，以允許進行細胞固定，然后用2ml蒸餾水替換除去深共熔溶劑，在室溫溫育1小時，并對規(guī)定的柵格區(qū)域中的細胞數(shù)量手動計數(shù)。然后可以計算殘留在規(guī)定區(qū)域中的附著細胞相對于最初數(shù)量的百分比。在特別優(yōu)選的設(shè)定中，大鼠肝臟樣品在24℃與400mg深共熔溶...