一種提高蘆葦粘性愈傷組織誘導(dǎo)率的植物離體培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物離體培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種提高蘆葦粘性愈傷組織誘導(dǎo)率的植物離體培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育而言，氮素的同化是一個(gè)非常重要的生理過(guò)程，植物通過(guò)同化作用把無(wú)機(jī)氮同化為N-轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸(N-transportaminoacid)，實(shí)現(xiàn)氮從源器官向庫(kù)組織轉(zhuǎn)移，及在氮源充足時(shí)貯存氮，以備植物體生長(zhǎng)、防御和繁殖所需。谷氨酰胺是一種具有代謝活性N-轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸，不但為核酸、氨基酸和其他的含氮化合物的合成提供氮源，且其所同化的氮也能整合到天冬氨酸與天冬酰胺中，同時(shí)谷氨酰胺與谷氨酸可進(jìn)入植物體內(nèi)銨主要的同化途徑GS/G0GAT循環(huán)，因而谷氨酰胺形式的氮可立即進(jìn)入植物代謝。在以種子為外植體的蘆葦組織培養(yǎng)中加入谷氨酰胺，不但給培養(yǎng)物提供氮素營(yíng)養(yǎng)，還可促進(jìn)細(xì)胞分裂，提高愈傷組織誘導(dǎo)，改善愈傷組織質(zhì)量，從而加快組培苗的生長(zhǎng)速度。建立高效快速的以種子為外植體的蘆葦再生體系，能改善蘆葦因長(zhǎng)期大量的分株繁殖常常會(huì)導(dǎo)致種性的退化現(xiàn)象，使其保持原有品種的種性并具有實(shí)生苗的復(fù)壯效應(yīng)，為人工濕地建設(shè)提供優(yōu)質(zhì)種苗。
[0003]蘆葦是廣泛分布于世界各地、形態(tài)上高度分化的草甸與濕地植被建群種，具有重要的生態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值。蘆葦?shù)某Ｒ?guī)繁殖以分株繁殖方式為主，長(zhǎng)期大量的分株繁殖會(huì)導(dǎo)致種性的退化，從而影響植物的生活力。同時(shí)因人類活動(dòng)對(duì)生態(tài)環(huán)境的擾動(dòng)，城市化進(jìn)程的加快，我國(guó)城市段河岸的混凝土化，導(dǎo)致蘆葦自然群落正大面積減少，其具有的環(huán)境保護(hù)作用在不斷喪失。所以，避免從蘆葦原生地采取蘆葦而保護(hù)原生地生態(tài)環(huán)境的同時(shí)，又如何輕便、快速培育蘆葦幼苗成為恢復(fù)蘆葦群落研宄的關(guān)鍵。
[0004]植物離體培養(yǎng)技術(shù)是指從植物體分離出符合需要的組織、器官、細(xì)胞或原生質(zhì)體等，經(jīng)無(wú)菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得再生完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。包括細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞無(wú)性系變異、體細(xì)胞突變體的篩選、體細(xì)胞雜交。植物離體培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物品種改良、基因工程育種、種質(zhì)資源保存、次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、分析基因功能等方面，亦是實(shí)現(xiàn)植物快速繁殖的主要手段。離體條件下的植物器官與組織可通過(guò)多次繼代形成無(wú)性繁殖系。無(wú)性系生長(zhǎng)和分支迅速，代謝活躍，生理功能正常，遺傳基礎(chǔ)完全一致，再分化形成完整植株并保證特征性結(jié)構(gòu)。與自然生境狀態(tài)下植物的生長(zhǎng)繁殖相比，離體條件下的培養(yǎng)過(guò)程具有簡(jiǎn)單性和可控性的特點(diǎn)，不僅易于控制生長(zhǎng)環(huán)境條件，而且不受土壤、生長(zhǎng)季節(jié)等的限制及病蟲害的干擾，因而離體培養(yǎng)是蘆葦大量培育的理想方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種提高蘆葦粘性愈傷組織誘導(dǎo)率的植物離體培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種提高蘆葦粘性愈傷組織誘導(dǎo)率的植物離體培養(yǎng)方法，其特征在于步驟如下:
[0007]步驟一、MS儲(chǔ)備液配制，
[0008]稱取47.5gKN03^P 41.25gNH 4勵(lì)3溶于去離子水，定容至500ml，獲得MS-A儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0009]稱取18.5gMgS04.7H20、1.115gMnS04.4H20 和 0.43gZnS04.7Η20 溶于去離子水，再加入Imgmr1的CuSO4.5Η20溶液1.25ml，定容至500ml，獲得MS-B儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0010]稱取22gCaCl2.2Η20溶于去離子水，分別加入Imgml ―1的CoCl 2.6Η20溶液1.25ml和1mgmr1的KI溶液4.15ml，定容至500ml，獲得MS-C儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0011]稱取8.5gKH2P04和 0.31gH 3B03溶于去離子水，再加入 1mgml I^Na2MoO4.2Η20 溶液1.25ml，定容至500ml，獲得MS-D儲(chǔ)備液，4°C保存；
[0012]稱取1.39gFeS04.7H20和1.865gNa2EDTA，分別溶于去離子水，混合后定容至500ml，獲得MS-E儲(chǔ)備液，4°C避光保存；
[0013]稱取1mg維生素B3、10mg維生素B6、40mg甘氨酸和2g肌醇，溶于去離子水，再加入Img ?ml 1維生素BI溶液2ml，定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，分裝于2ml微量離心管，獲得MS-F儲(chǔ)備液，_20°C保存；
[0014]為避免Ca2+與SO 42_、Ca2+與PO廣發(fā)生沉淀，采用分別配制儲(chǔ)備液的方式，在通過(guò)濃度很小的儲(chǔ)備液之間的復(fù)配來(lái)獲取培養(yǎng)基，以保證培養(yǎng)基中各種植物生長(zhǎng)所需的元素之間的平衡。
[0015]步驟二、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑儲(chǔ)備液的配制，
[0016]將10mg 二氯苯氧乙酸加入ImolI/1的氫氧化鈉溶液中振蕩溶解后，蒸餾水定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，獲得濃度為Imgml 1的二氯苯氧乙酸儲(chǔ)備液，分裝于2ml的微量離心管，_20°C保存；
[0017]將10mg萘乙酸加入ImolI/1的氫氧化鈉溶液中振蕩溶解后，蒸餾水定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，獲得萘乙酸儲(chǔ)備液，分裝于2ml的微量離心管，_20°C保存；
[0018]將50mg芐基腺嘌呤加入ImolI/1的鹽酸溶液中振蕩溶解，蒸餾水定容至50ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，獲得芐基腺嘌呤儲(chǔ)備液，分裝于2ml的微量離心管，_20°C保存；
[0019]步驟三、L-谷氨酰胺儲(chǔ)備液配制，
[0020]稱取0.1gL-谷氨酰胺溶于去離子水，定容至100ml，0.22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，分裝于2ml的微量離心管，_20°C保存；
[0021]步驟四、培養(yǎng)基配制，取800ml去離子水，依次加入20mlMS_A儲(chǔ)備液、1mlMS-B儲(chǔ)備液、1mlMS-C儲(chǔ)備液、1mlMS-D儲(chǔ)備液、1mlMS-E儲(chǔ)備液、蔗糖30g，攪拌溶解，定容至1L，調(diào)節(jié)PH值至5.8，轉(zhuǎn)至IL錐形瓶，再加入16g瓊脂粉，封口后于121°C高溫高壓滅菌20分鐘，冷卻至60°C，加入5mlMS-F儲(chǔ)備液，獲得初培養(yǎng)基，
[0022]在初培養(yǎng)基中加入二氯苯氧乙酸儲(chǔ)備液、萘乙酸儲(chǔ)備液、芐基腺嘌呤儲(chǔ)備液與L-谷氨酰胺儲(chǔ)備液，搖勻分裝至平皿或錐形瓶，封口膜密封保存，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中二氯苯氧乙酸的濃度為Img L—1，萘乙酸的濃度為Img L—1，芐基腺嘌呤的濃度為0.5mgΙΛ L-谷氨酰胺的濃度為0.25?Img L—1;
[0023]在初培養(yǎng)基中加入二氯苯氧乙酸儲(chǔ)備液，搖勻分裝至平皿或錐形瓶，封口膜密封保存，獲得增殖培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)基中二氯苯氧乙酸的濃度為2.5mg I71;
[0024]在初培養(yǎng)基中不加入任何物質(zhì)，分裝至平皿或錐形瓶，封口膜密封保存，獲得再生培養(yǎng)基；
[0025]步驟五、獲取外植體，采集成熟的蘆葦小穗，置種子袋中，于陽(yáng)光下曬7日后，儲(chǔ)存在種子柜中備用，挑選飽滿穎果，用接種針緩慢剝?nèi)?nèi)外稃，體式顯微鏡下觀察獲取的蘆葦種子表面有無(wú)損傷，取無(wú)損的種子作為外植體，每50粒種子置于2ml無(wú)菌微量離心管中，Parafilm膜封口保存，2日內(nèi)種子未使用，則棄用；
[0026]步驟六、種子消毒，將蘆葦種子移至25ml無(wú)菌錐形瓶，加入1ml無(wú)菌水，隔夜浸泡18小時(shí)，去無(wú)菌水后，加體積濃度為70%的乙醇進(jìn)行表面消毒30秒；再加入質(zhì)量濃度5%的次氯酸鈉表面消毒20分鐘，每5分鐘搖晃一次錐形瓶。無(wú)菌水清洗五次后，將種子轉(zhuǎn)至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。同時(shí)，取最后一次清洗的無(wú)菌水100 μ L涂布于LB培養(yǎng)基、869培養(yǎng)基平皿上，置于培養(yǎng)箱孵育3天，檢測(cè)種子消毒是否徹底，污染則棄用；
[0027]步驟七、誘導(dǎo)粘性愈傷組織，將消毒過(guò)的種子接種置誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在人工氣候箱里24°C暗培養(yǎng)2周，至在胚芽鞘末端形成粘性愈傷組織；
[0028]步驟八、增殖胚性愈傷組織，從胚芽鞘末端剝離粘性愈傷組織，轉(zhuǎn)至新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行光培養(yǎng)，每3周繼代一次，至愈傷組織表面具有細(xì)小瘤狀物和綠點(diǎn)，篩選此類愈傷組織形態(tài)為胚性愈傷組織，再將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0029]步驟九、幼苗再生，將增殖的胚性愈傷轉(zhuǎn)至再生培養(yǎng)基，觀察根莖分化并適時(shí)繼代，直至再生完整植株。
[0030]作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟八中，光培養(yǎng)的光周期為16/8h，光照強(qiáng)度為60 μ moI m 2S、
[0031]作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟四中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺的濃度為0.5mg L、
[0032]作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟六中，質(zhì)量濃度5%的次氯酸鈉中還含有質(zhì)量濃度為0.02%的吐溫20。
[0033]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):通過(guò)本發(fā)明提供的方案，蘆葦愈傷粘性組織誘導(dǎo)率高，且誘導(dǎo)出的愈傷組織可再生成完整幼苗，方法簡(jiǎn)單可靠，成本低廉；通過(guò)本發(fā)明提供的方案可形成具有雙極性結(jié)構(gòu)的胚狀體進(jìn)行莖芽分化，30-45天后可獲得大量的蘆葦幼苗，且鮮有白化苗生成。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作