一種篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的果蠅模型及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設及動物模型及其構(gòu)建方法，尤其設及一種篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性 抑制劑的果蛹模型及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒化epatitis B virus,皿V)是慢性肝病的一個主要致病因素，是全 世界最普遍也是最嚴重的傳染病之一，易導致肝炎、肝硬化，并最終導致肝癌。皿V是肝病毒 科的成員之一，病毒粒子是由外圍的包膜和內(nèi)層二十面體結(jié)構(gòu)的核衣殼蛋白組成。病毒粒 子有42nM的直徑。在核衣殼里面包圍的是病毒的DNA和DNA聚合酶，而DNA聚合酶具有反轉(zhuǎn)錄 活性。病毒的包膜蛋白中包含著嵌入蛋白，它主要在病毒的粘附，進入和感染細胞中起作 用。
[0003] 皿V的基因組是一個環(huán)狀的部分雙鏈DNA，全長有接近3200bp的長度，它包括四個 開放的閱讀框，分別是S，C，P和X。四個開放閱讀框分別編碼聚合酶蛋白（P)，表面抗原 (PreSl，PreS2和S)，核屯、蛋白（PreC/C)，X蛋白（X) oX蛋白對病毒的轉(zhuǎn)錄和復制是必須的，P 編碼對病毒復制至關(guān)重要的蛋白：Polymerase。化Iymerase在W負鏈為模板延長正鏈并進 行修復，形成cccDNA中起重要作用，并有可能參與肝癌的發(fā)生。
[0004] 由于易于飼養(yǎng)及便于遺傳學操作，果蛹被成功的作為模式生物應用到發(fā)育遺傳 學、信號轉(zhuǎn)導和細胞生物學的研究。高水平的基因和信號的保守性，W及哺乳動物與果蛹之 間的細胞生理生化過程的相似性，使果蛹模型便于研究人類基因。其中黑腹果蛹 (Droso曲ila melanogaster)，被廣泛的用來作為實驗室的模式動物，是被人類研究得最徹 底的生物之一，它作為最基礎的研究材料，對經(jīng)典遺傳學的建立起到了重要的作用。
[000引重組染色體的方法是用轉(zhuǎn)基因果蛹分別與帶有第一、第二、第=條染色體的平衡 染色體的果蛹雜交，后代果蛹挑同時具有紅眼和平衡染色體標記的雌雄果蛹雜交，觀察后 代果蛹的表型。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:提供一種篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的果 蛹模型(簡稱轉(zhuǎn)基因果蛹模型)構(gòu)建方法
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的果蛹模 型，其特征在于:該模型的果蛹眼睛過表達皿V Polymerase，且都具有比野生型果蛹眼睛大 的表型。
[000引進一步，該果蛹模型中果蛹的基因型為：e廠Gal4 ,UAS-化IiA/巧-Gal4 ,UAS-化IiA; 所述果蛹模型的眼睛比野生型果蛹眼睛大；所述的果蛹模型是克隆的乙肝病毒基因組中 Polymerase全長融合到pUAST轉(zhuǎn)基因果蛹載體，然后通過顯微注射逐步篩選所得。
[0009]另一方面，本發(fā)明提供一種篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的果蛹模型的構(gòu) 建方法，其特征在于，是由轉(zhuǎn)基因果蛹的處女蛹與ey-Gal4雄蛹雜交得到子一代果蛹，子一 代處女蛹與+/切O雄蛹雜交，后代挑取大眼、翅翅的處女蛹和雄蛹進行自交，后代即為篩選 乙型肝炎病毒蛋白聚合酶活性抑制劑的果蛹模型。
[0010] 進一步，所述轉(zhuǎn)基因果蛹的處女蛹的基因型為UAS-Poli\
[0011] 進一步，所述轉(zhuǎn)基因果蛹的處女蛹是將乙肝病毒基因組中化Iymerase全長基因整 合到果蛹染色體基因組中得到。
[0012] 進一步，所述篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的果蛹模型是將乙肝病毒基因 組中化Iymerase全長基因整合到pUAST轉(zhuǎn)基因果蛹載體，然后通過顯微注射篩選所得。
[0013] 進一步，該果蛹模型的眼睛過量表達乙型肝炎病毒蛋白化Iymerase，并具有比正 常野生型果蛹眼睛偏大的表型。
[0014] 另一方面，本發(fā)明還提供一種篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的方法，其特 征在于，是將所述篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的果蛹模型中的果蛹在胚胎期開始 飼喂待篩選藥物，如果羽化出的果蛹不是大眼睛，則該藥物是Polymerase聚合酶活性抑制 劑;如果羽化出的果蛹是大眼睛，則該藥物不是化Iymerase聚合酶活性抑制劑。
[0015] 進一步，將待篩選藥物參雜在果蛹培養(yǎng)基中
[0016] 該果蛹模型的眼睛變大是由于組成果蛹眼睛結(jié)構(gòu)的單個小眼結(jié)構(gòu)變大。
[0017] 各步的篩選方法和標準是看眼睛的形態(tài)。
[0018] 本發(fā)明所構(gòu)建的篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的果蛹模型一個特點是果 蛹眼睛中過量表達乙型肝炎病毒蛋白化Iymerase結(jié)構(gòu)域，從而導致果蛹的眼睛變得大。特 點之二是該果蛹模型表型易于觀察，喂藥方式簡便，藥物篩選工作相對快捷，可W快速地進 行大量的藥物篩選。
[0019] -般是將待篩選的藥物參雜在果蛹培養(yǎng)基中。具體的喂藥方式為將轉(zhuǎn)基因果蛹模 型放入無藥培養(yǎng)基中，然后將其所產(chǎn)的胚胎轉(zhuǎn)入有藥培養(yǎng)基中，觀察成體果蛹眼睛的變化， 可分為藥各類系列和同種藥的濃度系列進行比較。
[0020] 本發(fā)明所得的模型可用于按照圖4的大致步驟和技術(shù)的關(guān)鍵特征進行藥物篩選， 最終得到藥品。
【附圖說明】
[0021 ]圖1是pUAST載體圖譜。
[0022] 圖2是顯微注射篩選獲得轉(zhuǎn)基因果蛹的基本流程圖。
[0023] 圖3為用轉(zhuǎn)基因果蛹模型快捷篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的結(jié)果圖（妹 卡體視顯微鏡10X10倍下拍攝）。其中A為yw野生型果蛹眼睛圖；B為UAS-化IiA轉(zhuǎn)基因果蛹的 眼睛圖；C為巧-Gal4，UAS-Po11A/巧-Gal4，UAS-化IiA,轉(zhuǎn)基因果蛹經(jīng)過表達，重組之后得到 的果蛹的眼睛圖；D為巧-Gal4，UAS-化IiA/巧-Gal4，UAS-化IiA轉(zhuǎn)基因果蛹喂食藥物后的眼 睛圖。
[0024] 圖4為藥物篩選的大致步驟和技術(shù)的關(guān)鍵特征圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面將結(jié)合實施例并參考附圖對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技 術(shù)人員將會理解，下列實施例及其附圖僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。 實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn) 品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0026] W下實施例中所用的引物均為invi trogen公司合成，測序也是invi trogen公司。
[0027] 實施例1:篩選乙型肝炎病毒聚合酶活性抑制劑的果蛹模型的構(gòu)建
[0028] 1、構(gòu)建 pUAST-Polymerase 質(zhì)粒
[0029] 第一步:pUAST轉(zhuǎn)基因果蛹載體酶切
[0030] 將pUAST載體（中國質(zhì)粒載體菌株細胞株基因保藏中屯、-Biovector Science Lab, Inc. pUAST，載體圖譜見圖I)經(jīng)EcoI和化oI雙酶切，回收酶切后產(chǎn)物備用。
[0031 ] 第二步:皿V PoIymerase基因的擴增
[0032] 皿V基因組DNA提?。?ml標本由廈口大學醫(yī)學院醫(yī)護人員采集皿V感染者得到，往 5ml標本加入IOOul濃度為Img/ml的抗凝劑邸TA-Nas。標本為全血時，及時分離出血漿，提取 HBV基因組。W下提取步驟完全按照全式金試劑盒B IoodZol EE131 (http : // WWW, trans 邑 en. com. cn/attached/down/1403836677_138509.p壯)完成。①，加入2.5倍體積 的細胞裂解液于血樣中，顛倒混勻幾次，室溫放置5分鐘。②，1000 OXg離屯、3分鐘，去上清， 留白細胞沉淀。③，加200ul裂解Buffer3和2ul蛋白酶K，立即縱滿混勻，65°放置10分鐘，期 間混勻數(shù)次，溶液應變?yōu)榍辶痢＂?，加?00ul異丙醇充分顛倒混勻。⑤，1000 OXg離屯、5分 鐘，棄上清。⑥，加入200ul重量百分比為70 %的乙醇，縱滿震蕩5秒鐘，10000 X g離屯、5分鐘， 棄上清。⑦，重復⑥一次。⑧，干燥DNA沉淀，直到所有的液體揮發(fā)干凈。加入200U化B，低速滿 旋5秒，65°放置10分鐘至一個小時溶解DNA，期間輕彈數(shù)次助溶。得到HBV基因組即為下面 PCR擴增的模板，4°存放待使用。
[0033] 根據(jù)需要擴增皿V Polymerase片段（也即下文所稱的化Iymerase片段)長度，設計 并合成一定長度(一般為18-21個核巧酸）的特異性引物。為了后續(xù)克隆的方便，在引物的兩 端加上與載體匹配的15bp重復序列，用運對引物進行PCR擴增出來的目的片段經(jīng)過回收，加 入到EXOHI的反應體系中，就可與載體pUAST連接。
[0034] Polymerase因片段較長，設計兩對引物，分兩次PCR之后連接在一起。
[003引 Polymerase片段1的正向引物（記為化11-F):
(下劃線為重復序 (下劃線為重復序 列）
[0043] 將合成好的引物用1 XTE溶液稀釋成IOOiiM,取10化稀釋好的引物與90化ddw在 1.5mL Eppendorf管里混勻。
[0044] PCR反應體系如下： HBV基面組 Iyk 化 U-F O?掃 U k Pol l-R 0.百 y丄;：
[0045] p.remix聚合酶 巧'P.L; ddwater： 13U L； 共 孤AL:。
[0046] 反應程序： ① 95°C 5min；
[0047] ② 94'C 30 s； ⑨57〇C 30s； ④72°C lmin; ②-④迸行30個循環(huán)；
[004引 感巧 r： lOmin； 教4它 保存產(chǎn)物。
[0049] 第二次PCR，引物換為化12-F，Pol2-R，其他條件與第一次PCR條件一樣回收兩次所 得PCR產(chǎn)物。
[0050] 片段拼接，將回收的兩次PCR產(chǎn)物混合為模板進行第S次PCR，引物換為Poll-F, P012-R，反應程序同上，將最終所得的第S次PCR產(chǎn)物進行膠回收，存于-20°C備用。第S次 PCR產(chǎn)物即為F*olymerase片段。
[0051 ] 第S步:LIC反應由EXOIII DNA外切酶催化進行。
[005引將酶切后的PUAST載體和經(jīng)回收的第S次PCR產(chǎn)物按摩爾比1 : 1的比例加入到 1. SmLEppendo計f管中，一般一個連接反應使用20-50ng載體或片段，當然我們可W按照實 際的連接效果調(diào)整加入的載體和片段量，但一般不宜大于150ng。之后往里面加化L IOX EXO虹Buf f er，用無菌水補至10化，混勻后冰浴5min，在冰上加化L EXO虹（20U)，混勻，冰浴 eOmiriDEXO虹酶是核酸外切酶，它在4°C時的酶切速率大約為一小時15bp，所W在加入EXO虹 酶之前應該確保管中液體的溫度已經(jīng)降至4°C。酶切1小時后，加入化LO. 5M的抓TA(P冊.0) 終止酶切反應，將整個體系于60°C中放置5min，使酶進一步變性失活，隨后置于冰浴5min， 保證載體和插入片段