揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于作物遺傳育種和植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體設(shè)及成熟胚體外繼代誘導(dǎo)愈 傷組織。
【背景技術(shù)】
[000^ 1.小麥的育種目標(biāo)
[0003] 小麥(Triticum aestivum)是世界主要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)關(guān)系到社會(huì) 經(jīng)濟(jì)生活。隨著人口增加 W及國(guó)家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，需要更多的糧食滿足人們的生活需求。但是 水±流失導(dǎo)致農(nóng)田不斷減少W及全球氣候變暖使得近幾年的糧食產(chǎn)量增長(zhǎng)并不明顯。據(jù)相 關(guān)數(shù)據(jù)分析，分析近幾年的全球小麥單產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)小麥單產(chǎn)不穩(wěn)定，且增幅較小，小麥的增產(chǎn) 已經(jīng)成為人們關(guān)注的問(wèn)題之一。面對(duì)如此大的挑戰(zhàn)，任何可W提高糧食產(chǎn)量的方法都值得 去利用。針對(duì)糧食作物品種改良，人們主要采取傳統(tǒng)育種和轉(zhuǎn)基因的方式。兩者的本質(zhì)區(qū)別 是:前者通過(guò)去雄雜交促進(jìn)親本基因組的變異，后期W優(yōu)良性狀為指標(biāo)，利用田間試驗(yàn)，篩 選獲得所需優(yōu)良性狀的小麥品種。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)引起植物基因定向變異并產(chǎn)生優(yōu)良性 狀，相比于傳統(tǒng)雜交育種，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可打破生殖隔離，進(jìn)一步擴(kuò)大植物基因變異的范圍。 植物組織培養(yǎng)是小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵，傳統(tǒng)育種在自然條件下進(jìn)行，所W周期長(zhǎng)、受氣候 環(huán)境影響大。轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用組織培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程可在培養(yǎng)箱和溫室進(jìn)行，有效避免環(huán)境因 素的影響。轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要包括:基因克隆、目的基因功能鑒定、目的基因插入植物基因組 并通過(guò)生理鑒定獲得品種改良并具有商業(yè)價(jià)值的植株。植物基因組插入外源基因的方法有 基因槍法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等。
[0004] 2.小麥轉(zhuǎn)化方法
[0005] 小麥為異源六倍體植物、基因組大、基因調(diào)控困難，同時(shí)小麥外植體所誘導(dǎo)的愈傷 組織普遍存在愈傷胚性差、分化率低、轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生困難等問(wèn)題，是舉世公認(rèn)的最難轉(zhuǎn)化的 栽培作物?？茖W(xué)家通過(guò)各種方法實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥的轉(zhuǎn)化，但目前最主要的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)是基因 槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)。世界第一株轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)荲asil在1992年通過(guò)基因槍法將gus、bar基因 導(dǎo)入小麥品種化VOIU1997年化eng首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GUS和npt n轉(zhuǎn)入了小麥。除了 基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，花粉管通道法、顯微注射法、激光微束穿刺法、PEG法和電擊法等也 受到越來(lái)越多的關(guān)注。
[0006] 3.小麥愈傷組織誘導(dǎo)
[0007] 根據(jù)Christy在1987年對(duì)小麥組織培養(yǎng)形成愈傷組織分類(lèi)，可將其分為3類(lèi):胚性 愈傷組織化）、非胚性愈傷組織(肥)和可轉(zhuǎn)化成胚性愈傷組織的光滑緊致愈傷（SC)。6型愈 傷顏色呈白色或淡黃色，有光澤，結(jié)節(jié)狀，一觸易碎成顆粒狀，細(xì)胞球形狀;肥型愈傷易碎， 顏色呈褐色或者灰色;SC型愈傷主要特征是光滑緊致，而且具有很強(qiáng)的增生能力，可轉(zhuǎn)化為 E型愈傷。成熟胚的E型愈傷主要是從SC型愈傷組織轉(zhuǎn)化而來(lái)，小麥幼胚的胚性愈傷組織可 直接從胚誘導(dǎo)出E類(lèi)愈傷。胚狀體可W直接由單個(gè)細(xì)胞分化成完整植株、生命力旺盛，大大 縮短成苗周期。
[000引4.影響愈傷組織誘導(dǎo)因素
[0009] 4.1基因型不同品種由于基因型不一樣會(huì)影響產(chǎn)生胚性愈傷能力，運(yùn)在小麥、水稻 和玉米等植物的組織培養(yǎng)過(guò)程中，均可發(fā)現(xiàn)。明鳳等在2000年對(duì)迂10、7742、7757、新克旱9 和Roblin小麥繼代后，統(tǒng)計(jì)生成胚性愈傷組織比率，迂10小麥在接種414天后，78%的胚性 愈傷組織生成，而新克旱9愈傷組織已經(jīng)褐化。
[0010] 4.2外植體類(lèi)型許雪梅等2009年W紅皮云杉未成熟胚的不同部位為材料，研究其 對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同部位的外植體對(duì)愈傷誘導(dǎo)有很大的影響，全胚和胚 軸上部的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高分別達(dá)81.27%和75.96%。
[0011] 4.3培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基不僅為植物細(xì)胞體外培養(yǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也為細(xì)胞的脫分 化、再分化提供外源誘導(dǎo)因子和壓力。植物脫分化時(shí)期主要受生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的作用， 所W對(duì)于愈傷組織的生成，激素的調(diào)節(jié)是關(guān)鍵之一。何盛蓮等W豫麥49、豫麥18和蘭考906 為材料，研究不同外源物質(zhì)對(duì)小麥幼胚胚性愈傷組織生成的影響，發(fā)現(xiàn)隨著2,4-D濃度的增 高，胚性愈傷比率和綠點(diǎn)率不斷增加，但達(dá)到一定濃度之后又隨之下降。3個(gè)品種的小麥在 2,4-D為2mg/L時(shí)，胚性愈傷組織比率均達(dá)到最高。除了激素外，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸 或者微量元素等對(duì)與胚性愈傷的影響也受到了人們的關(guān)注。高武軍等在玉米的基本培養(yǎng)基 分別添加6種有機(jī)物，發(fā)現(xiàn)500mg/L水解酪蛋白與70〇111旨/1的心脯氨酸顯著提高玉米胚性愈 傷的比率。嚴(yán)華軍等W舟麥2號(hào)研究同樣發(fā)現(xiàn)水解酪蛋白a-脯氨酸、肌醇等對(duì)胚性愈傷組 織有顯著促進(jìn)作用。
[0012] 5.正交試驗(yàn)
[0013] 正交試驗(yàn)是通過(guò)整體設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表來(lái)安排多因素試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)綜合比較、統(tǒng)計(jì)分 析，通過(guò)較少的實(shí)驗(yàn)考察不同因素的影響大小和最佳組合。
[0014] 正交實(shí)驗(yàn)的主要特點(diǎn)是:針對(duì)多因素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可W選取試驗(yàn)因素具有代表性 的水平進(jìn)行比較，有效減少試驗(yàn)的次數(shù)，但不降低實(shí)驗(yàn)的可行性。最終選擇出各因素最優(yōu)的 水平，W及不同因素各水平間最佳組合。另一方面，通過(guò)正交試驗(yàn)的分析，可W找到關(guān)鍵因 素，W及各因素之間可能存在的相互關(guān)系
[0015] 1942年正交試驗(yàn)開(kāi)始受到關(guān)注，之后在各個(gè)領(lǐng)域均獲得廣泛的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)最早使 用正交實(shí)驗(yàn)等數(shù)學(xué)方法進(jìn)行植物離體培養(yǎng)研究是廣東省植物研究所遺傳室，之后越來(lái)越多 的研究者開(kāi)始利用運(yùn)一方法進(jìn)行培養(yǎng)基的改善。2010年孔維萍采用正交試驗(yàn)研究5種外加 因素 W及濃度對(duì)玉米成熟胚愈傷組織的影響，通過(guò)對(duì)不同組合出愈率的統(tǒng)計(jì)，最終確定了 玉米成熟胚誘導(dǎo)的最佳組合。2012年唐文忠等利用四因素=水平，研究基本培養(yǎng)基種類(lèi)、 IBA、NAA、W及AC對(duì)番木瓜組培苗生根的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的是提供一種揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基有利 于揚(yáng)麥14成熟胚繼代超過(guò)40天左右，仍維持較高再生能力的愈傷組織。（接受修改）
[0017] 小麥成熟胚長(zhǎng)期繼代獲得的胚性愈傷組織，具有較高的再生能力，是遺傳轉(zhuǎn)化的 好材料。為了在不影響揚(yáng)麥14成熟胚愈傷的再生能力的情況下，進(jìn)一步獲得更多胚性愈傷 組織并延長(zhǎng)胚性愈傷組織的保存時(shí)間，本發(fā)明通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出最有利于揚(yáng)麥14成 熟胚長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。脯氨酸、水解酪蛋白W及2,4-D為影響因素，分別設(shè) 置3個(gè)濃度，共配置9種不同組合的培養(yǎng)基，切取揚(yáng)麥14成熟胚并分別置于9種培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn) 重復(fù)3次。繼代5次后，每種培養(yǎng)基的所有愈傷組織均分別轉(zhuǎn)移同樣的分化培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)愈 傷的綠點(diǎn)率W及出苗情況。最終W綠點(diǎn)率為標(biāo)準(zhǔn)，分析各個(gè)因素的貢獻(xiàn)率，W及各因素最佳 組合。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)正交試驗(yàn)確定的揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MSWOOmg/ L k脯氨酸+lOOOmg/L酪蛋白水解物+2mg/L 2，4-D+30g/L薦糖+2.6g/L植物凝膠，P冊(cè).8。該 培養(yǎng)基誘導(dǎo)的揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織在長(zhǎng)期繼代的情況下，愈傷組織仍保持淡黃的顏色， 而且愈傷組織增長(zhǎng)較快;長(zhǎng)期繼代后，其它培養(yǎng)基誘導(dǎo)的揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織再生能力 受到抑制，均未出苗，而最優(yōu)培養(yǎng)基的揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織再生率最高達(dá)到6.7%。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是9種誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織再生圖。
[0020] 注：圖中1至9分別代表9種培養(yǎng)基培養(yǎng)出的揚(yáng)麥14的愈傷組織置于同樣的分化培 養(yǎng)基、同樣的生長(zhǎng)條件下，再生成苗和形成綠點(diǎn)率的情況。（9種培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)實(shí)施例1中正交 試驗(yàn)獲得的9種培養(yǎng)基組合，具體配方變化見(jiàn)表3)
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1:
[0022] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0023] 1.1供試品種:保存一年的揚(yáng)麥14種子(購(gòu)買(mǎi)于江蘇金±地種業(yè)有限公司）
[0024] 1.2培養(yǎng)基：愈傷組織誘導(dǎo)組成為MS基本培養(yǎng)基（具體成分見(jiàn)表l)、30g/L薦糖、 2.6g/L植物凝膠，分別添加不同濃度2,4-Da-脯氨酸W及酪蛋白水解物(表2)。分化培養(yǎng) 基由MS基本培養(yǎng)基、30g/L薦糖、2.6g/L植物凝膠、0.5mg/L激動(dòng)素、2mg/L玉米素組成。所有 培養(yǎng)基Kl均為5.8
[0025] 表1. MS培養(yǎng)基母液

[002引2.實(shí)驗(yàn)方法
[0029] 2.1設(shè)定試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。通過(guò)正交設(shè)計(jì)助手V3.1，設(shè)計(jì)L9(33)S因素 S水平 正交實(shí)驗(yàn)表見(jiàn)表3,并根據(jù)正交試驗(yàn)表配置9種組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0030] 2.2取實(shí)驗(yàn)室保存一年的揚(yáng)麥14的種子，挑選巧粒飽滿的小麥種子，置于滅完菌干 凈的S角瓶。經(jīng)75%酒精滅菌5min后，用0.1 %升隸浸泡30min，最后用滅菌水沖洗3~5遍。 超凈工作臺(tái)上用解剖刀撥取直徑Imm大小的幼胚，盾片朝上接種于9種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上， 每種培養(yǎng)基接種30個(gè)，每個(gè)處理重復(fù)3次，每隔10天換一次同樣的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，共繼代5次。
[0031] 2.3所有揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織均在繼代5次后分別轉(zhuǎn)移到同樣的分化培養(yǎng)基，25 ±rc光照培養(yǎng)一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)出苗率。
[0032] 表2正交試驗(yàn)的因素及水平
[0034] 3.結(jié)果與分析
[0035] 數(shù)據(jù)處理公式：
[0037]表3=種物質(zhì)的添加 W及不同濃度對(duì)愈傷組織影響
[0040] R值代表每個(gè)因素的影響大小，W揚(yáng)麥14成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織再分化時(shí)出現(xiàn)的 綠點(diǎn)率為指標(biāo)，R值越大代表影響越大，所WS種成分的影響關(guān)系是2,4-D化-脯氨酸〉酪蛋 白水解物。根據(jù)K值大小找出最優(yōu)組合:K值越大，效果越好，根據(jù)統(tǒng)計(jì)最優(yōu)組合是A3B3C2即 第九種培養(yǎng)基:MS+700mg/L k脯氨酸+lOOOmg/L酪蛋白水解物+2mg/L 2，4-D+30g/L薦糖+ 2.6g/L植物凝膠。
[0041 ] 實(shí)施例2:
[0042] 按照實(shí)例1處理的繼代5次的獲得的不同培養(yǎng)基的揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織，分別轉(zhuǎn) 移到同樣的分化培養(yǎng)基上，（25±irc光照培養(yǎng)一個(gè)月后觀察出苗情況。
[0043] 根據(jù)出苗情況得出：繼代5次后，其他培養(yǎng)基揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織受到繼代影 響，均未出芽；實(shí)例1獲得的最佳培養(yǎng)基(MS+700mg/L k脯氨酸+lOOOmg/L酪蛋白水解物+ 2mg/L 2，4-D+30g/L薦糖+2.6g/L植物凝膠，P冊(cè).8)培養(yǎng)的揚(yáng)麥14成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織， 在繼代5次后出苗率為6.7%，如圖1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于成分為:MS+700mg/L L-脯 氨酸+1000mg/L酪蛋白水解物+2mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2 · 6g/L植物凝膠;培養(yǎng)基的PH5 · 8。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分為：MS+700mg/L？L-脯氨酸+1000mg/L酪蛋白水解物+2mg/L？2，4-D+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的PH5.8。本發(fā)明培養(yǎng)基在延長(zhǎng)揚(yáng)麥14成熟胚愈傷組織的培養(yǎng)時(shí)間的情況下，還保持愈傷組織較高的再生率，有利于小麥轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定進(jìn)行。
【IPC分類(lèi)】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105660417
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610186333
【發(fā)明人】陳建民, 劉慧君, 高勇, 劉霜, 居鵬, 王雨竹, 張冬平
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月29日