專利名稱：新的啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在假絲酵母屬(Candida)酵母中可以進(jìn)行基因表達(dá)的新型啟動(dòng)子。具體地，本發(fā)明涉及在假絲酵母屬酵母中，可以不依賴于培養(yǎng)條件或培養(yǎng)基條件等誘導(dǎo)條件而組成性并且高效地表達(dá)有用基因的啟動(dòng)子。
背景技術(shù)：
隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，開始用微生物來(lái)生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)和有用的化學(xué)物質(zhì)等。目前正在積極開發(fā)采用原核生物大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)的基因重組系統(tǒng)，其中，特別是采用大腸埃希氏菌的宿主-載體系統(tǒng)已經(jīng)用于生產(chǎn)各種有用的物質(zhì)。但是，在大腸埃希氏菌中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)有時(shí)在菌體中形成不溶性顆粒，并且它們不進(jìn)行糖基化，而這是真核生物中的特征。
對(duì)此，也進(jìn)行了以真核生物酵母為宿主的系統(tǒng)的開發(fā)。酵母自古就用于釀造和面包制造，還曾進(jìn)行生產(chǎn)用于飼料，其高安全性得到保證。另外，對(duì)其所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化也是其與原核生物相區(qū)別的特征。
除遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)很豐富的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)外，在許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、Yarrowia屬和假絲酵母屬中也在開發(fā)宿主-載體系統(tǒng)(Nonconventional Yeasts in Biotechnology，Klaus Wolf著，Springer出版)。
在這些酵母中，有的即使是以直鏈烴鏈(正鏈烷)作為唯一的碳源也能生長(zhǎng)。它們是假絲酵母屬的麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)等，或多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)、Yarrowialipolytica等。這些酵母具有氧化正鏈烷烴末端的酶系統(tǒng)，將氧化產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈羧酸通過(guò)過(guò)氧化物酶體β氧化系統(tǒng)分解成作為TCA循環(huán)基質(zhì)的乙酰CoA，從而可以用作能量源。
利用正鏈烷烴的酵母不僅能以直鏈烴作為碳源而繁殖，而且對(duì)阻礙一般酵母繁殖的疏水性物質(zhì)具有耐受性。因此，它們有望作為通過(guò)轉(zhuǎn)化疏水性化學(xué)物質(zhì)來(lái)產(chǎn)生有用物質(zhì)的反應(yīng)領(lǐng)域的宿主。因此，通過(guò)在這樣的酵母中構(gòu)建基因表達(dá)系統(tǒng)，可以不產(chǎn)生有害副產(chǎn)物、不浪費(fèi)能量而構(gòu)建新的有用化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)體系。
在利用正鏈烷烴的酵母中，正在積極努力在麥芽糖假絲酵母中構(gòu)建基因表達(dá)系統(tǒng)。M.Kawamura等人在麥芽糖假絲酵母中發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致高效率轉(zhuǎn)化的區(qū)域(轉(zhuǎn)化能力，以下簡(jiǎn)稱為“TRA”)(M.Kawamura等，Gene，vol.24，157(1983))。已經(jīng)揭示該區(qū)域包含在麥芽糖假絲酵母中參與自主復(fù)制的序列(自主復(fù)制序列，以下簡(jiǎn)稱為“ARS”)和著絲粒序列(以下簡(jiǎn)稱為“CEN”)。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了包含整個(gè)TRA區(qū)域的低拷貝數(shù)載體和去除了CEN區(qū)域、有望高水平表達(dá)導(dǎo)入基因的高拷貝數(shù)載體(M.Ohkuma等，Mol.Gen.Genet.，vol.249，447(1995))。
在麥芽糖假絲酵母中，基因表達(dá)必需在該酵母中起作用的啟動(dòng)子，現(xiàn)在已經(jīng)有多種可用于這方面的啟動(dòng)子。麥芽糖假絲酵母在鏈烷烴的存在下高水平地產(chǎn)生正鏈烷烴氧化系統(tǒng)的酶。特別是強(qiáng)有力地誘導(dǎo)編碼參與鏈烷烴早期氧化的細(xì)胞色素P450的基因(以下簡(jiǎn)稱為“ALK”)的轉(zhuǎn)錄(M.Ohokuma等，DNA and Cell Biology，vol.14，163(1995))，還誘導(dǎo)編碼β氧化系統(tǒng)的基因的轉(zhuǎn)錄(Y.Masuda等，Gene，vol.167，157(1995))。ALK基因群中，ALK1基因的啟動(dòng)子被正鏈烷烴最強(qiáng)有力地誘導(dǎo)，可以用于基因表達(dá)。另外，在脂肪酸的存在下，適合使用ALK2或ALK5基因的啟動(dòng)子。
已知糖酵解途徑中的磷酸甘油酸激酶(以下簡(jiǎn)稱為“PGK”)的啟動(dòng)子在葡萄糖的存在下誘導(dǎo)強(qiáng)有力的基因表達(dá)。麥芽糖假絲酵母的PGK啟動(dòng)子已經(jīng)被Y.Masuda克隆(Y.Masuda等，Curr.Genet.，vol.25，412(1994))。另外，在半乳糖的存在下具有強(qiáng)有力的基因表達(dá)誘導(dǎo)活性的GAL啟動(dòng)子也已經(jīng)被克隆(S.M.Park等，Yeast，vol.13，21(1997))。如上克隆的ALK啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子和GAL啟動(dòng)子可以用于麥芽糖假絲酵母中的基因表達(dá)。
然而，在利用葡萄糖等碳源時(shí)，ALK啟動(dòng)子幾乎不起作用，而以脂肪酸或正鏈烷烴為碳源時(shí)，PGK啟動(dòng)子幾乎不起作用。因此，在麥芽糖假絲酵母中適于生產(chǎn)有用物質(zhì)的碳源不一定適于強(qiáng)有力的基因表達(dá)。并且，GAL啟動(dòng)子僅在以半乳糖作為碳源時(shí)被誘導(dǎo)，因此由于必須采用昂貴的半乳糖而不適于工業(yè)生產(chǎn)。
因此，為了在麥芽糖假絲酵母中高效地生產(chǎn)有用物質(zhì)，亟待一種能不受碳源種類的限制而強(qiáng)有力地進(jìn)行基因表達(dá)的新型啟動(dòng)子。
另一方面，在啤酒糖酵母中，醇脫氫酶1基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶3基因(以下簡(jiǎn)稱為“GAP3”)、PGK和GAL等的啟動(dòng)子已經(jīng)被克隆，并廣泛用作表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子。已經(jīng)揭示在以啤酒糖酵母為宿主時(shí)，這些啟動(dòng)子的活性很強(qiáng)。因此，有望在以麥芽糖假絲酵母為宿主時(shí)也高水平地表達(dá)。但是，在麥芽糖假絲酵母中這些啟動(dòng)子區(qū)域的基因尚未被克隆，其克隆還處于等待之中。
但是，與啤酒糖酵母不同，假絲酵母屬酵母尚未發(fā)現(xiàn)有性世代，它們大多具有二倍體基因組。另外，還有報(bào)告指出在遺傳密碼子的讀取中存在異常。有報(bào)告指出，Candida cylindraceae(Y.Kawaguchi等，Nature，vol.341，164(1989))或麥芽糖假絲酵母(H.Sugiyama等，Yeast，vol.11，43(1995))將通常編碼亮氨酸的CUG密碼子讀成絲氨酸。因此，可以說(shuō)假絲酵母屬酵母的性質(zhì)與啤酒糖酵母大不相同，因此還不知道來(lái)自啤酒糖酵母的啟動(dòng)子區(qū)域在假絲酵母屬酵母中是否具有同等的活性。
發(fā)明概述鑒于以上現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種新型啟動(dòng)子，其在假絲酵母屬酵母、特別是麥芽糖假絲酵母中中，可以不受碳源種類的影響而組成性地并且高效地生產(chǎn)有用物質(zhì)。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)悉心研究，結(jié)果首次鑒定了麥芽糖假絲酵母的肌動(dòng)蛋白合成酶1基因(以下簡(jiǎn)稱為“ACT1”)啟動(dòng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶3基因(以下簡(jiǎn)稱為“GAP3”)啟動(dòng)子、原生質(zhì)膜質(zhì)子ATPase 1基因(以下簡(jiǎn)稱為“PMA1”)啟動(dòng)子和翻譯延伸因子1基因(以下簡(jiǎn)稱為“TEF1”)啟動(dòng)子的序列，發(fā)現(xiàn)這些啟動(dòng)子的活性等同或高于現(xiàn)有ALK啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子和GAL啟動(dòng)子的活性，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及包含以下(a)～(d)中任意一項(xiàng)的DNA的ACT1基因啟動(dòng)子(a)SEQ ID NO9所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO9所示的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO9所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(d)與SEQ ID NO9所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有啟動(dòng)子活性、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA；另外，本發(fā)明還涉及包含以下(a)～(d)中任意一項(xiàng)的DNA的GAP3基因啟動(dòng)子(a)SEQ ID NO10所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO10所示的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO10所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(d)與SEQ ID NO10所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有啟動(dòng)子活性、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA；另外，本發(fā)明還涉及包含以下(a)～(d)中任意一項(xiàng)的DNA的PMA1基因啟動(dòng)子(a)SEQ ID NO11所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO11所示的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO11所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(d)與SEQ ID NO11所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有啟動(dòng)子活性、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA；另外，本發(fā)明還涉及包含以下(a)～(d)中任意一項(xiàng)的DNA的TEF1基因啟動(dòng)子(a)SEQ ID NO12所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO12所示的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO12所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(d)與SEQ ID NO12所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有啟動(dòng)子活性、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA；另外，本發(fā)明還涉及包含上述任意一項(xiàng)的啟動(dòng)子以及連接在該啟動(dòng)子序列下游的結(jié)構(gòu)基因的DNA。
本發(fā)明還涉及包含上述DNA和終止子的基因表達(dá)單元。
本發(fā)明還涉及包含上述基因表達(dá)單元的質(zhì)粒。
另外，本發(fā)明還涉及往宿主細(xì)胞中導(dǎo)入上述DNA或上述質(zhì)粒所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
另外，本發(fā)明還涉及3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚聚酯的生產(chǎn)方法，該方法包括培養(yǎng)下述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，該細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)基因來(lái)自豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，其編碼參與3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚聚酯合成的酶。
發(fā)明詳述來(lái)自麥芽糖假絲酵母的ACT1基因啟動(dòng)子、GAP3基因啟動(dòng)子、PMA1基因啟動(dòng)子和TEF1基因啟動(dòng)子是本發(fā)明首次鑒定的新型啟動(dòng)子。下面對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
(1)新型啟動(dòng)子的克隆ACT1基因是參與合成構(gòu)成細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白的酶之一，GAP3基因是糖酵解系統(tǒng)的酶之一，PMA1基因是據(jù)說(shuō)占糖酵母屬中原生質(zhì)膜蛋白的10％的原生質(zhì)蛋白之一，TEF1基因是蛋白質(zhì)合成中的翻譯延伸因子之一，已知所有在啤酒糖酵母中對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子都是強(qiáng)有力的啟動(dòng)子。
本發(fā)明中，為了通過(guò)雜交法克隆麥芽糖假絲酵母的ACT1基因、GAP3基因、PMA1基因和TEF1基因的啟動(dòng)子區(qū)域，首先通過(guò)PCR法從親緣較近的啤酒糖酵母擴(kuò)增相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因的部分DNA序列，將其用作探針片段。例如，已經(jīng)報(bào)告了啤酒糖酵母的ACT1基因序列(Daniel，H.M.等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，vol.51，1593(2001))?？梢詮脑撔蛄泻铣善【铺墙湍窤CT1基因擴(kuò)增用的PCR引物。啤酒糖酵母的GAP3結(jié)構(gòu)基因序列已經(jīng)被報(bào)告(Holland，M.J.等，J.Biol.Chem.，vol.254，5466(1979))，可以從該序列合成啤酒糖酵母GAP3基因擴(kuò)增用的PCR引物。另外，Capieaux，E.等人已經(jīng)報(bào)告了啤酒糖酵母的PMA1基因序列(J.Biol.Chem.，vol.264，7437(1989))，可以從該序列合成啤酒糖酵母PMA1結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增用的PCR引物。Cottrelle，P.等人已經(jīng)報(bào)告了啤酒糖酵母的TEF1結(jié)構(gòu)基因序列(J.Biol.Chem.，vol.260，3090(1985))，可以從該序列合成啤酒糖酵母TEF1結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增用的PCR引物。
啤酒糖酵母和麥芽糖假絲酵母的染色體DNA可以用市售的試劑來(lái)分離。以分離得到的啤酒糖酵母染色體DNA為PCR模板，用上述合成的引物進(jìn)行PCR，由此可以擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于各引物的啤酒糖酵母的ACT1、GAP3、PMA1和TEF1結(jié)構(gòu)基因的一部分。將擴(kuò)增過(guò)的DNA片段用放射性化合物或者堿性磷酸酯酶標(biāo)記，以此作為雜交檢測(cè)探針。
分離麥芽糖假絲酵母的染色體DNA，用適當(dāng)?shù)南拗泼阜侄危⑦M(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后與上述檢測(cè)探針進(jìn)行Southern雜交，由此可以估計(jì)出包含各目的啟動(dòng)子序列的片段的長(zhǎng)度。對(duì)于各啟動(dòng)子，用上述Southern雜交所用的限制酶切割麥芽糖假絲酵母的染色體，用克隆載體制作基因文庫(kù)。轉(zhuǎn)化該文庫(kù)，使得在含有抗生素的瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)適當(dāng)數(shù)量的集落，然后在硝酸纖維素膜上培養(yǎng)，并將該膜進(jìn)行堿變性處理，然后中和、洗滌并干燥后，進(jìn)行雜交，由此可以克隆包含麥芽糖假絲酵母每一種目的啟動(dòng)子的染色體DNA片段。所得的DNA不僅包含啟動(dòng)子區(qū)域，還包含結(jié)構(gòu)基因。因此，可以根據(jù)與相應(yīng)已知啟動(dòng)子或結(jié)構(gòu)基因的堿基序列(如啤酒糖酵母)的相似性(同源性)，采用常規(guī)方法鑒定啟動(dòng)子區(qū)域并將其與結(jié)構(gòu)基因分離，由此確定啟動(dòng)子的堿基序列。
通過(guò)以上方法，可以獲得本發(fā)明的新型ACT1基因啟動(dòng)子、GAP3基因啟動(dòng)子、PMA1基因啟動(dòng)子和TEF1基因啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的堿基序列分別如SEQ ID NO9、10、11和12所示。
本發(fā)明的上述啟動(dòng)子可以通過(guò)上述方法獲得，也可以在鑒定堿基序列后，通過(guò)化學(xué)合成獲得。
本發(fā)明啟動(dòng)子不僅可以是上述SEQ ID NO9、10、11和12所示的DNA，也可以是包含上述堿基序列號(hào)中所示堿基序列的DNA，只要其具有啟動(dòng)子活性，還可以是包含在上述堿基序列號(hào)所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列的DNA，以及與上述堿基序列號(hào)中所述的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA。
包含上述堿基序列號(hào)中所示的堿基序列的DNA和包含在上述堿基序列號(hào)所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列的DNA，是指包含下述堿基序列的DNA，該堿基序列通過(guò)Protein，Nucleic Acid，Enzyme，Supplemental IssueGene Amplification PCR Technology TAKKAJ 35(17)，2951-3178(1990)或Henry A.Erlich(ed.)，PCR Technology(the translationedited by Ikunoshin Kato)(1990)等中記載的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法缺失、添加、插入和/或取代了可以進(jìn)行缺失、添加、插入和/或取代的數(shù)量的堿基。
與上述堿基序列號(hào)中所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交的DNA是指以包含上述序列號(hào)所示的堿基序列的DNA為探針，通過(guò)菌落雜交、蝕斑雜交或Southern雜交等方法獲得的DNA。
本發(fā)明的DNA優(yōu)選包含與上述堿基序列號(hào)所示的堿基序列具有80％或80％以上同源性的堿基序列，同源性優(yōu)選為90％或90％以上，更優(yōu)選95％或95％以上，進(jìn)一步優(yōu)選98％或98％以上。
“同源性”如下計(jì)算將待對(duì)比的兩個(gè)堿基序列以最適方式排列，計(jì)數(shù)兩個(gè)序列之間的配對(duì)堿基(A、T、C、G、U或I)位置數(shù)，用該數(shù)除以比較堿基總數(shù)，所得結(jié)果乘以100。具體地，可以用Hitachi Soft Engineering公司的DNASIS、Software Development公司的GENETYX或Finland CSC公司的Clustal X分析軟件進(jìn)行計(jì)算。
這些DNA可以通過(guò)以下方法容易地獲得通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的上述方法在上述堿基序列號(hào)所示的DNA中缺失、添加、插入和/或取代至少1個(gè)堿基，或通過(guò)根據(jù)Molecular Cloning，2nd Edition(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中記載的方法進(jìn)行雜交來(lái)獲得。
本發(fā)明中，“具有啟動(dòng)子活性”的啟動(dòng)子是指其通過(guò)后述功能分析測(cè)得的酶活性為上述堿基序列號(hào)中所示的DNA在相同條件下測(cè)定的酶活性的50％或50％以上、優(yōu)選70％或70％以上、更優(yōu)選80％或80％以上、進(jìn)一步優(yōu)選90％或90％以上、特別優(yōu)選95％或95％以上的啟動(dòng)子。
(2)啟動(dòng)子功能的分析新型啟動(dòng)子的功能分析可以通過(guò)測(cè)定由該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的mRNA或由該mRNA翻譯的基因產(chǎn)物的量來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明的啟動(dòng)子在其下游連接結(jié)構(gòu)基因時(shí)，可以表達(dá)該結(jié)構(gòu)基因的功能。對(duì)本發(fā)明所用的結(jié)構(gòu)基因沒有特殊限制，例如，可以列舉編碼參與聚羥基鏈烷酸酯(特別是3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚酯P(3HB-co-3HH))合成的酶的基因、抗體基因、編碼淋巴因子等有用蛋白質(zhì)的基因等。
另外，如果需要，本發(fā)明的啟動(dòng)子、其下游連接的結(jié)構(gòu)基因以及終止子可以用作基因表達(dá)單元。這里的終止子可以使用適當(dāng)?shù)墓K止子，只要其可以用于目的表達(dá)系統(tǒng)中。對(duì)所述終止子沒有特別限制，可以列舉ALK1、GCN4等。
另外，還可以將上述基因表達(dá)單元插入到質(zhì)粒中使用。本發(fā)明所用的質(zhì)粒沒有特殊限制，可以列舉pUTU1、pBTH10B(Nakazawa，等，J.Bacteriol.，vol.179，5030(1997))。
本發(fā)明中，可以將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到構(gòu)成表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中制備轉(zhuǎn)化細(xì)胞，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使轉(zhuǎn)化的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。另外，也可以不導(dǎo)入質(zhì)粒，而將包含本發(fā)明啟動(dòng)子及其下游連接的結(jié)構(gòu)基因的DNA直接整合到宿主染色體中。這里所用的宿主沒有特別限制，只要本發(fā)明的啟動(dòng)子能在其中發(fā)揮作用，但優(yōu)選假絲酵母屬酵母，特別優(yōu)選麥芽糖假絲酵母。
可以按照公知的方法用本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，例如可以采用鈣法(E.M.Lederberg等，J.Bacteriol.，vol.119，1072(1974))或電穿孔法(CurrentProtocols in Molecular Biology，vol.1，para.1.8.4，1994)。另外，可以利用FastTrackTM-Yeast Transformation Kit SM(Geno Technology)等市售的轉(zhuǎn)化試劑盒。
用所得的轉(zhuǎn)化體來(lái)分析新型啟動(dòng)子的功能可以通過(guò)將該轉(zhuǎn)化體用其可以利用的碳源進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)，可以用加入了碳源的YPD培養(yǎng)基(酵母提取物1％、聚胨2％)、YNB培養(yǎng)基(Yeast nitrogen base 0.67％)等通常用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基。另外，還可以用完全合成的培養(yǎng)基等。本發(fā)明所用的碳源沒有特別限制，可以用例如葡萄糖、麥芽糖等糖類，正鏈烷烴、脂肪酸和油脂等。對(duì)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間沒有特殊限制，只要適合于轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)，但優(yōu)選在10～40℃培養(yǎng)2～72小時(shí)。培養(yǎng)完畢的細(xì)胞通過(guò)分析培養(yǎng)液或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)來(lái)分析啟動(dòng)子的功能。由連接在啟動(dòng)子下游的基因表達(dá)的酶等表達(dá)在細(xì)胞外時(shí)，不必將細(xì)胞破碎，但當(dāng)該酶留在細(xì)胞內(nèi)時(shí)，則必須將細(xì)胞進(jìn)行處理。進(jìn)行細(xì)胞處理的方法沒有特別限制，可以用Zymolyase等細(xì)胞壁溶解酶將細(xì)胞消化后，通過(guò)超聲處理或凍融法等進(jìn)行。另外，也可以用玻璃珠進(jìn)行直接的物理性破碎。
啟動(dòng)子的功能分析可以通過(guò)以下方法進(jìn)行，該方法能夠特異性地檢測(cè)出由啟動(dòng)子下游連接的基因表達(dá)的酶等的活性或量。對(duì)分析方法沒有特殊限制，例如，可以用(1)中克隆的各啟動(dòng)子區(qū)域，構(gòu)建下述基因的表達(dá)載體，該基因編碼參與3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚聚酯P(3HB-co-3HH)合成的酶，此酶來(lái)自豚鼠氣單胞菌(以下簡(jiǎn)稱為“ORF2S”)，然后通過(guò)以下文獻(xiàn)方法(Valentin，H.E.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，vol.40，699(1994))測(cè)定該酶的活性。具體地，用ORF2S測(cè)定啟動(dòng)子的活性時(shí)，通過(guò)將ORF2S摻入(R)-3-羥基丁基-CoA得到游離的CoA-SH，將其以等摩爾比與DTNB(5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))反應(yīng)，同時(shí)測(cè)定與游離CoA-SH以等摩爾比反應(yīng)所生成的離子化TNB(2-硝基-5-巰基苯甲酸)在單位時(shí)間內(nèi)在約412nm的吸光度的增加，由此可以簡(jiǎn)便地測(cè)定酶活性。
所得的酶活性值用酶活性測(cè)定中所用的細(xì)胞破碎溶液中的蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，可以將所得的酶活性值計(jì)為通過(guò)本發(fā)明啟動(dòng)子表達(dá)的酶比活性，由此可以相互比較啟動(dòng)子的活性。
本發(fā)明的啟動(dòng)子中，ACT1基因啟動(dòng)子、PMA1基因啟動(dòng)子和TEF1基因啟動(dòng)子都是生長(zhǎng)繁殖所必需的基因的啟動(dòng)子，因此，其不受碳源種類的限制，只要在麥芽糖假絲酵母可以生長(zhǎng)繁殖的條件下就可以起作用。另外，GAP3基因啟動(dòng)子是糖酵解體系中的酶的啟動(dòng)子，特別是在以葡萄糖作為碳源時(shí)有望強(qiáng)表達(dá)，從這點(diǎn)講，其具有任何公知啟動(dòng)子所不具有的性質(zhì)。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，可以通過(guò)培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)上述共聚聚酯，該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因是來(lái)自豚鼠氣單胞菌的基因，它編碼參與3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚聚酯的合成的酶。
此培養(yǎng)所用的碳源可以是任何一種碳源，只要轉(zhuǎn)化體可以利用。另外，可以使用含有碳源以外的營(yíng)養(yǎng)源例如氮源、無(wú)機(jī)鹽類或其他有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度只要是該細(xì)胞可以生長(zhǎng)繁殖的溫度即可，優(yōu)選20～40℃。對(duì)培養(yǎng)時(shí)間沒有特殊限制，可以是1～7天左右。然后，可以從所得的培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)物中回收聚酯。
碳源可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖等碳水化合物、油脂類、脂肪酸類以及正石蠟烴等。油脂可以列舉例如菜籽油、椰子油、棕櫚油和棕櫚仁油等。脂肪酸可以列舉己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸、豆蔻酸等飽和或不飽和脂肪酸，或這些脂肪酸的酯或鹽等脂肪酸衍生物。作為一例，在麥芽糖假絲酵母的培養(yǎng)中，可以用油脂作為碳源進(jìn)行培養(yǎng)。在不能利用或不能有效利用油脂的轉(zhuǎn)化體的情況中，可以往培養(yǎng)基中加入脂肪酶來(lái)改善利用效率。另外，可以通過(guò)轉(zhuǎn)化脂肪酶基因賦予油脂利用能力。
氮源可以列舉例如氨，氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽，蛋白胨、肉浸膏、酵母提取物等。作為無(wú)機(jī)鹽，可以列舉磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂和氯化鈉等。
其它的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源可以列舉氨基酸類(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等)、維生素(例如維生素B1、維生素B12、生物素、煙酰胺、泛酸、維生素C等)等。
本發(fā)明中，可以用如下的方法從細(xì)胞中回收聚酯，例如，在培養(yǎng)結(jié)束后，用離心分離器從培養(yǎng)液中分離細(xì)胞，用蒸餾水和甲醇等將所得細(xì)胞洗滌，然后干燥。用氯仿等有機(jī)溶劑從所得的干燥細(xì)胞中提取聚酯。將包含聚酯的有機(jī)溶劑溶液通過(guò)過(guò)濾等除去細(xì)胞，往濾液中加入甲醇和己烷等不良溶劑使聚酯沉淀。通過(guò)過(guò)濾或離心分離除去上清液，將沉淀的聚酯干燥，從而可以回收聚酯。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示實(shí)施例9中用于構(gòu)建質(zhì)粒的質(zhì)粒pUAL-ORF2S的限制性圖譜。
圖2表示實(shí)施例9～13中用于構(gòu)建質(zhì)粒的質(zhì)粒pSTV-ALK1-ORF2S的限制性圖譜。
圖3表示實(shí)施例9～13中用于構(gòu)建質(zhì)粒的質(zhì)粒pUTA1的限制性圖譜。
圖4表示實(shí)施例9中構(gòu)建的質(zhì)粒pUTA-ALK1-ORF2S的限制性圖譜。
圖5表示實(shí)施例10中構(gòu)建的、作為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的質(zhì)粒pUTA-ACT1-ORF2S的限制性圖譜。
圖6表示實(shí)施例11中構(gòu)建的、作為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的質(zhì)粒pUTA-GAP3-ORF2S的限制性圖譜。
圖7表示實(shí)施例12中構(gòu)建的、作為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的質(zhì)粒pUTA-PMA1-ORF2S的限制性圖譜。
圖8表示實(shí)施例13中構(gòu)建的、作為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的質(zhì)粒pUTA-TEF1-ORF2S的限制性圖譜。
發(fā)明的最佳實(shí)施方案下面通過(guò)實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例的限制。
(實(shí)施例1)酵母染色體DNA的制備用E.Z.N.A.Yeast DNA試劑盒(OMEGA BIOTEK公司)制備啤酒糖酵母和麥芽糖假絲酵母的染色體DNA，制備方法如該試劑盒中隨附的說(shuō)明書所述。
(實(shí)施例2)啤酒糖酵母的ACT1、GAP3、PMA1和TEF1基因片段的擴(kuò)增按照下述方法擴(kuò)增堿基序列已知的啤酒糖酵母ACT1、GAP3、PMA1和TEF1基因片段以實(shí)施例1中制備的啤酒糖酵母染色體DNA為模板，用SEQ ID NO1和2(對(duì)于ACT1)、SEQ ID NO3和4(對(duì)于GAP3)、SEQ IDNO5和6(對(duì)于PMA1)以及SEQ ID NO7和8(對(duì)于TEF1)所示的合成DNA作為引物，用TaKaRa Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo)通過(guò)PCR擴(kuò)增。所采用的條件如所述試劑盒中隨附的說(shuō)明書所述。具體地，往模板DNA 1μg、最終濃度分別為1μM的兩種引物、2.5U的ExTaq聚合酶、附帶的緩沖劑0.01ml和附帶的dNTP混合液0.008ml中加水至體積為0.1ml，然后將其進(jìn)行PCR25個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)包括98℃15秒、55℃1分鐘、72℃1分鐘)，由此擴(kuò)增啤酒糖酵母約400bp的ACT1基因片段、或約1kb的GAP3基因片段、或約2.8kb的PMA1基因片段、或約1.5kb的TEF1基因片段。
(實(shí)施例3)標(biāo)記探針片段的制備、雜交、洗滌和陽(yáng)性克隆的檢測(cè)將擴(kuò)增后的各探針片段用Amersham-Pharmacia公司的Gene imagesAlkPhos試劑盒根據(jù)隨附的說(shuō)明書用堿性磷酸酯酶標(biāo)記。
雜交用Amersham-Pharmacia公司的Gene images AlkPhos試劑盒根據(jù)隨附的說(shuō)明書在55℃過(guò)夜進(jìn)行。
洗滌用Amersham-Pharmacia公司的Gene images AlkPhos試劑盒根據(jù)隨附的說(shuō)明書在55℃和室溫進(jìn)行。
陽(yáng)性克隆的檢測(cè)用Amersham-Pharmacia公司的CDP-Star試劑盒根據(jù)隨附的說(shuō)明書進(jìn)行。
(實(shí)施例4)麥芽糖假絲酵母ACT1基因啟動(dòng)子區(qū)域的克隆將實(shí)施例1中制備的麥芽糖假絲酵母染色體DNA用限制酶BglII切斷，在瓊脂糖凝膠電泳后，從凝膠提取約1kb～3kb的片段，將所述片段連接到用限制酶BamHI處理過(guò)的pUC19，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α菌株。將約3,000株轉(zhuǎn)化株以用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的啤酒糖酵母ACT1基因片段作為探針進(jìn)行雜交，結(jié)果得到6株陽(yáng)性克隆，確定插入片段的部分堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是含有麥芽糖假絲酵母ACT1啟動(dòng)子區(qū)域的基因。克隆片段的一部分序列如SEQ ID NO9所示。
(實(shí)施例5)麥芽糖假絲酵母GAP3基因啟動(dòng)子區(qū)域的克隆將實(shí)施例1中制備的麥芽糖假絲酵母染色體DNA用限制酶EcoRI切斷，在瓊脂糖凝膠電泳后，從凝膠提取約7kb～9kb的片段，將所述片段連接到用相同限制酶處理過(guò)的pUC19，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α菌株。將約2,000株轉(zhuǎn)化株以用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的啤酒糖酵母GAP3基因片段作為探針進(jìn)行雜交，結(jié)果得到2株陽(yáng)性克隆，確定插入片段的部分堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是含有麥芽糖假絲酵母GAP3啟動(dòng)子區(qū)域的基因?？寺∑蔚囊徊糠中蛄腥鏢EQ ID NO10所示。
(實(shí)施例6)麥芽糖假絲酵母PMA1基因啟動(dòng)子區(qū)域的克隆將實(shí)施例1中制備的麥芽糖假絲酵母染色體DNA用限制酶XbaI切斷，在瓊脂糖凝膠電泳后，從凝膠提取約2kb～4kb的片段，將所述片段連接到用相同限制酶處理過(guò)的pUC19，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α菌株。將約5,000株轉(zhuǎn)化株以用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的啤酒糖酵母PMA1基因片段作為探針進(jìn)行雜交，結(jié)果得到5株陽(yáng)性克隆，確定插入片段的部分堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是SEQ ID NO11所示的含有麥芽糖假絲酵母PMA1啟動(dòng)子區(qū)域的基因。
(實(shí)施例7)麥芽糖假絲酵母TEF1基因啟動(dòng)子區(qū)域的克隆將實(shí)施例1中制備的麥芽糖假絲酵母染色體DNA用限制酶EcoRI和PstI切斷，在瓊脂糖凝膠電泳后，從凝膠提取約2kb～4kb的片段，將所述片段連接到用相同限制酶處理過(guò)的pUC19，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α菌株。將約400株轉(zhuǎn)化株以用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的啤酒糖酵母TEF1基因片段作為探針進(jìn)行雜交，結(jié)果得到7株陽(yáng)性克隆，確定插入片段的部分堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是SEQ ID NO12所示的含有麥芽糖假絲酵母TEF1啟動(dòng)子區(qū)域的基因。
(實(shí)施例8)參與聚酯合成的基因的合成以來(lái)自豚鼠氣單胞菌的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合成酶(T.Fukui，等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，vol.170，69(1999))的氨基酸序列為基礎(chǔ)合成參與聚酯合成的酶基因。由于麥芽糖假絲酵母是將CTG密碼子翻譯成絲氨酸而不是亮氨酸的酵母，因此沒有將CTG指定為亮氨酸密碼子。各氨基酸相應(yīng)的密碼子優(yōu)先選擇在麥芽糖假絲酵母中使用頻率高的密碼子。密碼子的使用頻率參考Klaus Wolf著的“Nonconventional Yeasts in Biotechnology”(Springer出版)。如上設(shè)計(jì)PHA合成酶基因(以下簡(jiǎn)稱為“ORF2S”，SEQ IDNO13)，并完全合成ORF2S基因部分。
(實(shí)施例9)用麥芽糖假絲酵母ALK1啟動(dòng)子構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體為了使上述ORF2S在麥芽糖假絲酵母中表達(dá)，在5’上游連接麥芽糖假絲酵母Alk1基因的啟動(dòng)子ALK1p(SEQ ID NO15)，并在3’下游連接麥芽糖假絲酵母Alk1基因的終止子ALK1t(SEQ ID NO14)。用于將啟動(dòng)子和終止子與結(jié)構(gòu)基因連接的限制酶位點(diǎn)通過(guò)PCR法制備。對(duì)于啟動(dòng)子部分，以SEQ ID NO15所示的啟動(dòng)子為模板，用SEQ ID NO16和SEQ ID NO17所示的DNA進(jìn)行PCR，制備在5’末端具有PvuII位點(diǎn)、3’末端具有EcoRI位點(diǎn)的ALK1p片段。對(duì)于終止子部分，以SEQ ID NO14所示的終止子為模板，用SEQ ID NO18和SEQ ID NO19所示的DNA進(jìn)行PCR，制備在5’末端具有HindIII位點(diǎn)、3’末端具有EcoRV位點(diǎn)的ALK1t片段。將上述ALK1p片段連接到pUCNT(公開于WO 94/03613)的PvuII-EcoRI位點(diǎn)，ALK1t片段連接到pUCNT的HindIII-SspI位點(diǎn)，由此構(gòu)建pUAL1。然后在pUAL1的NdeI-PstI位點(diǎn)結(jié)合ORF2S片段，構(gòu)建質(zhì)粒pUAL-ORF2S(圖1)。接著將該質(zhì)粒用SalI進(jìn)行部分切割，用XhoI接頭(Takara Shuzo)將SalI位點(diǎn)轉(zhuǎn)變成XhoI位點(diǎn)。這樣修飾過(guò)的質(zhì)粒一旦被PvuI和PvuII切割，就與pSTV28(Takara Shuzo)的PvuI和SmaI片段連接，由此構(gòu)建如圖2所示的pSTV-ALK1ORF2S。
進(jìn)一步地，使用pUTA1載體(圖3)，該載體的標(biāo)記基因已經(jīng)用pUTU1(M.Ohkuma等，J.Biol.Chem.，vol.273，3948(1998))和麥芽糖假絲酵母ADE1基因(Genebank D00855)由尿嘧啶變成腺嘌呤。該載體的構(gòu)建如下進(jìn)行用XhoI從pUTU1消除URA3基因，用SalI將切出的ADE1基因片段連接到剩余部分。
用EcoT22I切割pSTV-ALK1-ORF2S，制備包含啟動(dòng)子、ORF2S和終止子的片段，并將其插入pUTA1的PstI位點(diǎn)，由此構(gòu)建圖4所示的pUTA-ALK1-ORF2S。
(實(shí)施例10)用麥芽糖假絲酵母ACT1啟動(dòng)子構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體用實(shí)施例4中克隆的麥芽糖假絲酵母ACT1啟動(dòng)子區(qū)域按照下述方法構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體。用SEQ ID NO20和21所示的合成DNA作為引物，以包含麥芽糖假絲酵母ACT1啟動(dòng)子區(qū)域的片段(SEQ ID NO9)為模板進(jìn)行PCR，得到5’-末端具有EcoT22I限制酶位點(diǎn)、3’-末端具有NdeI限制酶位點(diǎn)的片段，并用EcoT22I和NdeI處理該片段。將實(shí)施例9中得到的pSTV-ALK1-ORF2S用EcoT22I和NdeI同法處理，制備不含ALK啟動(dòng)子的片段。將上述兩個(gè)片段進(jìn)行連接，構(gòu)建pSTV-ACT1-ORF2S。用EcoT22I限制酶處理該質(zhì)粒，制備ACT1-ORF2S片段。將該片段插入實(shí)施例9中所得的pUTA1的PstI位點(diǎn)，由此構(gòu)建圖5所示的pUTA-ACT1-ORF2S表達(dá)載體。
(實(shí)施例11)用麥芽糖假絲酵母GAP3啟動(dòng)子構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體用實(shí)施例5中克隆的麥芽糖假絲酵母GAP3啟動(dòng)子按照下述方法構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體。用SEQ ID NO22和23所示的合成DNA作為引物，以包含麥芽糖假絲酵母GAP3啟動(dòng)子區(qū)域的片段(SEQ ID NO10)為模板進(jìn)行PCR，得到5’-末端具有XhoI限制酶位點(diǎn)、3’-末端具有NdeI限制酶位點(diǎn)的片段，并用XhoI和NdeI處理該片段。將實(shí)施例9中得到的pSTV-ALK1-ORF2S用XhoI和NdeI同法處理，制備并不含ALK啟動(dòng)子的片段。將上述兩個(gè)片段進(jìn)行連接，構(gòu)建pSTV-GAP3-ORF2S。用限制酶XhoI和SalI處理該質(zhì)粒，制備GAP3-ORF2S片段。用SalI處理實(shí)施例9中所得的pUTA1質(zhì)粒，并將所得的兩個(gè)片段進(jìn)行連接，由此構(gòu)建圖6所示的pUTA-GAP3-ORF2S表達(dá)載體。
(實(shí)施例12)用麥芽糖假絲酵母PMA1啟動(dòng)子構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體用實(shí)施例6中克隆的麥芽糖假絲酵母PMA1啟動(dòng)子按照下述方法構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體。用SEQ ID NO24和25所示的合成DNA作為引物，以包含麥芽糖假絲酵母PMA1啟動(dòng)子區(qū)域的片段(SEQ ID NO11)為模板進(jìn)行PCR，得到5’-末端具有XhoI限制酶位點(diǎn)、3’-末端具有NdeI限制酶位點(diǎn)的片段，并用XhoI和NdeI處理該片段。將實(shí)施例9中得到的pSTV-ALK1-ORF2S質(zhì)粒用XhoI和NdeI同法處理，制備不含ALK啟動(dòng)子的片段。將上述兩個(gè)片段進(jìn)行連接，構(gòu)建pSTV-PMA1-ORF2S。用限制酶XhoI和SalI處理該質(zhì)粒，制備PMA1-ORF2S片段。用SalI處理實(shí)施例9中所得的pUTA1質(zhì)粒，并將所得的兩個(gè)片段進(jìn)行連接，由此構(gòu)建圖7所示的pUTA-PMA1-ORF2S表達(dá)載體。
(實(shí)施例13)用麥芽糖假絲酵母TEF1啟動(dòng)子構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體用實(shí)施例7中克隆的麥芽糖假絲酵母TEF1啟動(dòng)子按照下述方法構(gòu)建ORF2S表達(dá)載體。用SEQ ID NO26和27所示的合成DNA作為引物，以包含麥芽糖假絲酵母TEF1啟動(dòng)子區(qū)域的片段(SEQ ID NO12)為模板進(jìn)行PCR，得到5’-末端具有XhoI限制酶位點(diǎn)、3’-末端具有NdeI限制酶位點(diǎn)的片段，并用XhoI和NdeI處理該片段。將實(shí)施例9中得到的pSTV-ALK1-ORF2S質(zhì)粒用XhoI和NdeI同法處理，制備不含ALK啟動(dòng)子的片段。將上述兩個(gè)片段進(jìn)行連接，構(gòu)建pSTV-TEF1-ORF2S。用限制酶XhoI和SalI處理該質(zhì)粒，制備TEF1-ORF2S片段。用SalI處理實(shí)施例9中所得的pUTA1質(zhì)粒，并將所得的兩個(gè)片段進(jìn)行連接，由此構(gòu)建圖8所示的pUTA-TEF1-ORF2S表達(dá)載體。
(實(shí)施例14)麥芽糖假絲酵母轉(zhuǎn)化株的分離用電穿孔法轉(zhuǎn)化麥芽糖假絲酵母AC16株(根據(jù)布達(dá)佩斯條約委托保藏，國(guó)際保藏局獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物委托保藏中心(1-1-3 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏日為2000年11月15日，保藏號(hào)為FERM BP-7366)。將用YPD培養(yǎng)基在30℃過(guò)夜培養(yǎng)過(guò)的培養(yǎng)液1ml接種到裝入了相同培養(yǎng)基100ml的500ml Sakaguchi燒瓶中，在30℃培養(yǎng)7小時(shí)。以3,000rpm在室溫離心10分鐘后，用冰冷卻的1M山梨糖醇溶液約50ml洗滌，共3次。將細(xì)胞懸浮到3ml相同的溶液中，將懸浮液分成0.1ml每份，并在80℃保存，作為轉(zhuǎn)化用細(xì)胞?；蜣D(zhuǎn)化時(shí)用ECM 600M(BTX)。具體地，將0.1ml待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和約1μg實(shí)施例9～13中構(gòu)建的任意一種表達(dá)載體裝入具有2mm寬的空隙的小試管中，在模式2.5kV、電壓1.9kV和電阻246Ω的條件下進(jìn)行電穿孔，然后立即冰冷卻，加入0.5ml的1M山梨糖醇，并在室溫保溫1小時(shí)，然后于30℃在YNB選擇板上培養(yǎng)。選擇板用沒有氨基酸的0.67w/v％Yeast Nitrogen Base(Difco)、2w/v％葡萄糖和2w/v％Bacto Agar(Difco)。
通過(guò)上述制備，得到包含實(shí)施例9～13中構(gòu)建的表達(dá)載體的5種轉(zhuǎn)化體。
(實(shí)施例15)啟動(dòng)子功能的分析將實(shí)施例14中得到的轉(zhuǎn)化株用沒有氨基酸的0.67w/v％Yeast NitrogenBase(Difco)和2w/v％葡萄糖過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)后，將2.5ml預(yù)培養(yǎng)物接種到裝入了50ml相同培養(yǎng)基的500ml Sakaguchi燒瓶中，在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。僅在作為比較例的由ALK1啟動(dòng)子制備的表達(dá)載體的培養(yǎng)中，用2w/v％的正十二烷作為碳源。將相當(dāng)于約10ml的培養(yǎng)液以3,000rpm在室溫離心10分鐘，然后用生理鹽水洗滌，并在相同條件下再次離心。將細(xì)胞懸浮在1ml 0.5M的磷酸鉀溶液(pH＝7.2)中，將懸浮液與等量的酵母破碎用玻璃珠(0.45mm，Biospec Products)混合，用Mini Bead Beater(Biospec Products)處理5次，每次1分鐘，使細(xì)胞破碎，然后用臺(tái)式離心機(jī)以3,000g離心分離10秒，回收上清作為測(cè)定ORF2S活性的樣品。用該樣品和Protein Assay試劑盒(BioRad)測(cè)定蛋白濃度，并按照Valentin，H.E.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，vol.40，699(1994)所述的測(cè)定酶活性。
具體地，將包含0.01ml細(xì)胞破碎液和7mg/ml(R)-3-羥基丁基-CoA(Sigma)的水溶液0.01213ml和溶于0.5M磷酸鉀溶液(pH 7.2)的3.8mg/ml的DTNB(Sigma)0.04ml混合到0.338ml水中，在室溫測(cè)定所得混合物在412nm處5分鐘內(nèi)的吸光度變化。吸光度的測(cè)定采用島津制作所的分光光度計(jì)進(jìn)行。根據(jù)下式計(jì)算活性活性(U/ml)＝ΔA412/min×103×VT/ε412×VE。
在上式中，ΔA412/min表示每分鐘的吸光度增加量，VT表示反應(yīng)液的量(ml)，ε412為15.6×103(M-1·cm-1)，VE表示酶液量(ml)。
用上述文獻(xiàn)和下式所示的比活性(U/mg)來(lái)表示所述酶活性比活性(U/mg)＝活性(U/ml)/蛋白濃度(mg/ml)。
所得結(jié)果如表1所示，由該結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明克隆的ACT1、GAP3、PMA1和TEF1啟動(dòng)子區(qū)域是在麥芽糖假絲酵母細(xì)胞中與ALK1啟動(dòng)子同等或較之更高效地發(fā)揮作用的啟動(dòng)子。
表1

產(chǎn)業(yè)適應(yīng)性根據(jù)本發(fā)明，可以在假絲酵母，特別是麥芽糖假絲酵母中高效地表達(dá)有用的基因。
序列表<110>鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社(KANEKA CORPORATION)<120>新的啟動(dòng)子<130>T747.SBP-7<150>JP 2002-105240<151>2002-4-18<160>27<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-ACT1 5′的PCR引物<400>1ccggaattca tggattctgg tatgttcta 29<210>2<211>29
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-ACT1 3′的PCR引物<400>2ccggaattca agacagcacg aggagcgtc 29<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-GAP3 5′的PCR引物<400>3atgatcagaa ttgctattaa cggtttcggt 30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-GAP3 3′的PCR引物
<400>4ttaagccttg gcaacatatt cgatcaagt 29<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-PMA1 5′的PCR引物<400>5atgactgata catcatcctc ttcatcatcc 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-PMA1 3′的PCR引物<400>6ttaggtttcc ttttcgtgtt gagtagagac 30
<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-TEF1 5’的PCR引物<400>7atgggtaaag agaagtctca cattaacgtt 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-TEF1 3’的PCR引物<400>8ttatttctta gcagcctttt gagcagcctt 30<210>9<211>1300<212>DNA
<213>Candida maltosa<220>
<223>Cm-ACT1啟動(dòng)子<400>9gatctcggct gtgaatcgca atttgccatg acacctctcg ctatttccga attacataag 60accatcagtg aaagattgga gagaaaaaaa tgtgaacaga atagtcggag tttatattaa 120attcatcgtc caaaaaaacc tgaatatcat tggctctgcg gtttattaaa aagtgtaccg 180ccgacttatc cgaacaatta aacgtaacat gactgcaaaa aaaaaccatg aagaaaacat 240ttacaaaata tttgtaatat cgtcgaagat aataaaccat accagacgga aagttggatg 300aaattgttgc aaaaataatt atgctactcg ttctcacgtt taaatataca cgtagatcaa 360accagcaaac ttctataaat tgccatcgat ccaccaaaca tcgtcaaaaa caattttgta 420actttattgc ctctcatacg tttaaatttc aaaatcaata aatattaatc aaccgtgtaa 480caaaaaaaaa aaactgagat agtgcacagc ccaaaaaggt ttagtgattg cctccaaaca 540tacataatag gttatttttt tcgttgaacg catttcttgc tcgctcaccg aatttctgcc 600aacgaaacaa attttatata tttcattttt ttctctttca tgtaattttt tctttctttc 660tgctttttct tttttttttc ttttccttcc caatcccccc ctacattaat atattaatta 720tcatttaaaa tggacggtgg tatgtttaaa ctatttcatt gacttgattg atcgattgat 780tgattggttg atttcttcaa agcacggact ttttttcttt ctccattatt tgatttttag 840attttgggtg atttttttgt tttttttggg gagtgactga tctaatctca attcaggatt 900atgggacgaa gaagaatcga gagatggaat ctagatatat caatttcaat ttttattgtt 960ttgatctcga gagtatttat ggaaagattt gattgaacaa cttttttttt cattggcctg 1020gatcaattcc gtccataaaa gaaagagagc tttacactga tcgattcatt catatttttt 1080acactggagt ttcttcaaaa atcattggat tctacccaat ggcaatccta catcttaaaa 1140atcatcattt attacgagtt tattggataa tggtcacttt aaattcttgg tatcttgaat 1200ttgttttttt tttttttttt tttcagaaat ttgtaccccc ttttaaaaat gttcagaatt 1260tttttttttt tttcgtcaaa cccacacaca cacatttttc 1300
<210>10<211>3000<212>DNA<213>Candida maltosa<220>
<223>Cm-GAP3啟動(dòng)子<400>10ctgcaggtgg gatcttcaga ctgtttaata tttcttcaat atgatgggtc ccataattag 60aaaccccaat actcttaaca atccccttgg acacggcttc ttccatgact ttccaacttt 120ccaatcgttt ttgtttccca ggtaatggtg aatggatcaa taacaaatcg atatatttca 180aatcaccaat ttgatccaac atagtagtga tcgcatgtct tgtatttgtt gtacccaatt 240gactattcca tagtttggtg gtatagaaaa actctgaacg agggatatct ggattatcgt 300gaaggaattt cgttatccct tctgccactt cttcttcgtt gccgtacaaa actgcggtat 360caaaatgtcg atatccgact ttacaggctt cgtagacaat gctggccgtt ttatttcttg 420gaatgtcgta acagcctaaa ccgattgaag ggatgctata tccggaattg agtttgatta 480atcgaaatga catgattgtg ttgagtatat tgaaagcaat aattaatata aaaaaaagag 540gaacgaaaaa aaagagagat gttgaagtgg ttgggttatg taagtacgta tttattcact 600gattattaat tgctatctta ataatatttt tttccctccc atttttactt tttttggata 660tcttgtttga aatgtggggg caaaaaaaaa aaaaatttac atagccctat tccataaaat 720ataaatcttt tatgtatatt tgcaacatcg acacaatttg atatttccaa atactccagg 780tttttttttc tttttcattc acagtctcgg gattaagtgt gaaacccggg ggaaatcgaa 840attttttttt ttcagcattg tttatacaca atttcagttt gtccgaatac acccgcacgt 900gattccccca aacaggcaaa aaaaaaaaaa aatgaatata tagtgagtac gtgtcccgcg 960gctcaggaac ctcttttttt tttagaggtg gtatgatgtg aagtattttt tttttttcct 1020
ttttcctttt cctttttcat tcacaccacc accatataga atttacttac gtcaggttat 1080attctagaca acctttgtgg tttttttttt taaagggaat ttgagccact atgtccatag 1140aaaacttttt actgtaacga aaatctatag tctgagataa aggggaaaat ggtaaccacg 1200tattttttta tttttttttg gattcctata accccgatat ttatgttcgg aattgtagat 1260atatagatat tccagattac ttggctgtaa tgtaggctat ggaaatgata ctactcatca 1320atataaaccc attgacagta taagatagat aattatactg tggtggtacc atataaaatt 1380aatatgttga tcaggtgctt ttggcaacac cacgagcttt gcgcaagttt tttttttttg 1440ttcttttttg ttttttgttg gttgtttgat gcaaatggat gataatgccc cgggcgcggg 1500cgtgtgtgac gcaaatccaa tagaaaaaat tcacctggtt aaacctattt tcactgacaa 1560atcaatttat tttgccaaaa gaaaaaaaga atatataata acccttgaat gtccaattgg 1620aatttttttt ctctttctaa aatttttctt tctttctttc ttttcttctt cttttcttct 1680ttacacaatc aattgacttt aaacctcaat taaacaacac ataactttca aacttacttt 1740ttaacataca aaaaatggct attaaaattg gtattaacgg tttcggtaga atcggtagat 1800tagtcttgag aattgcttta ggcagaaaag acattgaagt tgttgccgtc aacgatccat 1860tcattgctgc tgattacgct gcttacatgt tcaaatacga ttccacccac ggtagataca 1920aaggtgaagt caaatctgaa ggtaacgatt tagtcattga cggtaagaaa atccaagtct 1980tccaagaaag agacccagct aacattccat ggggtaaaga aggtgttgaa tatgttattg 2040actccactgg tgttttcacc aagattgaag gtgctcaaaa acacattgat gctggtgcca 2100aaaaagttat catcactggt tcatctgctg atgctccaat gttcgttgtt ggtgttaacg 2160aagacaaata caccccagac ttgaaaatca tttctaacgc ttcctgtacc actaactgtt 2220tagctccatt agctaaagtt atcaacgata ctttcggaat tgaagaaggt ttgatgacca 2280ctgtccactc catcactgct acccaaaaga ctgttgacgg tccttcccac aaagattgga 2340gaggtggtag aactgcttcc ggtaacatta tcccatcttc tactggtgct gctaaagccg 2400tcggtaaagt tatcccagaa ttaaacggta aattgactgg tatgtctttg agagttccaa 2460ccaccgatgt ctccgttgtt gacttgactg tcagattatc taaaccaacc acttacgaag 2520aaatctctga agctatcaag aaagctgctg atggtccatt gaacggaatc ttgggttaca 2580ctgaagatgc tgttgtctct actgacttct tgtcttctaa ctactcttct gttttcgatg 2640ctaaagctgg tatcttgttg tccccaactt tcgtcaaatt gatctcttgg tacgataacg 2700
aatacggtta ctctaccaga gttgtcgact tattggaaca cgttgccaaa gtttccggtt 2760cctcttaact cagaaacaag ttttagttga cattgtgtct gttttctttt attacatagg 2820ttgttatatc aatatatgtt tataaatacg tcttgaaaat cttgtttttt ttttttgtaa 2880attttgtaaa ttttcatctt gtgcgggaca aaggacgagt ggagaaaaaa aaaacgaaac 2940tttttttttc ttttctccga aattgtaaac aaaaacaaca acaacacctc catgtcggaa 3000<210>11<211>3173<212>DNA<213>Candida maltosa<220>
<223>Cm-PMA1啟動(dòng)子<400>11tctagaattt atattggttt ctttcttttt ttttagatcg tttattaatt aattagttaa 60ttaattactt cataacatgt aaattagatt taaccaaaaa aaagaaaagt taaagataat 120ggctaagtag atgttaaagc caggttcaat tgtttataat actcatcatc atcaatcaat 180taaattgcaa aaacaaacaa acccgttgaa aaaaggaaag aaaaaaaaaa cacggctggt 240aataaatctt tcatgtactg gtcaattaat taaccgacgt aataagagat ccttggataa 300atagtaagaa tatccagcaa tttacgtacg taaatgaaac acaaatgaat gaatgctgaa 360ctttcatgac ttaattgagt agtttagttg gttggtatat gcgaaattta tttattccga 420taattattat caataggttg tagcgggaaa tttaaaacca aacaggagat tagaagcggc 480agaatgaaat aaaaaaaaac atggccggcg aaaaaaaaaa ggaaaaaaag gaaggaaaaa 540aaaacgaaaa agggtcgggt aaatctactc aacaaatatt ataataatga ttgtttattt 600atctatggat gtttggatga attaagtcaa gtttgtgtta tttcgtatga aagagacata 660gttagagata gagatagata gacaaataga tttgagagat gaggtggttc agttacatta 720
catttttttt tcttaaaaac taaaaatatt tcttatgtaa ctttccagtt tattatatta 780ataccaagaa agttatatgt aatatcagtt gatattcaac aattgctgtt acaattgtca 840actctcaact tctaccttcc catttgaata tctctcttcc agtcatatga gttgtattca 900aaattttttt tatttccgtt cggcataatt aattttgtgt cgtgggaata tgcacaattt 960ataaaacaaa agcaaaatct aaattgaggg aatttctgca gaagagtcaa aaaaaacata 1020aagtcgtgtc tcggaactca aaaataacat tttccatact aagattaaac gataacattt 1080aaaaaaatcc acaaatttga ttggtcggaa taaaaaataa aaatatccct caccctaaag 1140aaagaaaatt tttttattta gttgagaaaa ccgaataatt ttgtcctatg aggtaattaa 1200atatttccat tttgtgttat tgtttattat tttcctaaac cactttatca aaaaaagaaa 1260aagaaatttt tcttcttttt tggacaaaat taaaaatttt ttacaacctc ttctaaaaaa 1320gaaaaacaac aacaacagaa aaacgacctc caaaaaaatc ttacaaccaa aaatttaaat 1380ttttaatttt ccaaaggtaa tataaaaagg ataataaatt cccttgatta gatttttttt 1440tttaacgaat tctttattca tttttccttt ttcccttttt ttttttttcc tttttttaga 1500tagtcaatcg aagttttact tttattaact ttttttccta cccactaatt cttactttct 1560tttttttttc attcaaaaat tttttaatag tattttaaaa aatataccat ctcacacccc 1620caaaaaagaa aaataaaaag gaattcattt ttaataccct aattttttaa tattagaatt 1680atagagagag aaaaagagac agaaaacaaa aacttatcat gagtgctact gatcctacta 1740atgaaaagat caataaagac atctccgatg atgaagatga agatattgat caattggttt 1800tagatttaca atctaatcca ggtgctttag atgacgaaga agaagaagaa gatcaagctt 1860cttttaaagc cgtccctgaa gaattattac aaactgaccc aagaactggt ttatctgatg 1920atgaagttca aaaaagaaga aaaaagtatg gtttgaatca aatggctgaa gaacaagaaa 1980atttagtcat gaaattcgtc atgtttttcg ttggtccaat tcaattcgtt atggaagccg 2040ctgctgtttt agctgctggt ttggaagatt gggtcgattt tggtgttatc tgtgctttat 2100tggtattgaa tgcttttgtt ggtttcatcc aagaatacca agctggttct attgtcgatg 2160aattaaaaaa gactttagct aacgttgctt tagttgttag aaatggtcaa ttggttgaaa 2220ttccagccaa tgaagttgtt ccaggtgata tcttgcaatt ggaagatggt accgttatcc 2280caactgatgg tagaattgtt tctgaagatt gtttattaca agttgatcaa tctgctatta 2340ctggtgaatg tttagctgtt gacaaaagat ctggtgactc ttgttactct tcttccactg 2400
ttaaaactgg tgaagctttt atggttgtta ccgctactgg tgacaacact tttgttggta 2460gagctgctgc tttagtcaac aaagcttccg ctggtactgg tcatttcact gaagttttga 2520acggtattgg tactacattg ttggttttcg tcattgttac tttgttggtt gtctgggttg 2580cttgtttcta cagaactgtt agaattgttc caatcttgag atacactttg gctatcacca 2640ttattggtgt tccagtcggt ttaccagctg tcgttaccac taccatggct gtcggtgctg 2700cttacttggc taaaaaacaa gctattgtcc aaaaattgtc tgctattgaa tctttggctg 2760gtgtcgaaat tttatgttct gataaaactg gtactttgac caagaataaa ttgtctttac 2820atgaaccata cactgttgaa ggtgttgaac cagatgactt gatgttgact gcttgtttgg 2880ctgcttccag aaagaagaag ggtttggatg ctattgataa agctttcttg aaatctttga 2940ttaactaccc aagagctaaa gctgctttac caaaatacaa agttattgaa ttccaacctt 3000ttgatcctgt ctccaaaaaa gttactgcca ttgttgaatc accagaaggt gaaagaatta 3060tttgtgttaa gggtgctcca ttattcgtct tgaagactgt tgaagatgcc catccaatcc 3120cagaagatat ccatgaaaac tatcaaaaca ctgttgccga atttgcttct aga3173<210>12<211>1675<212>DNA<213>Candida maltosa<220>
<223>Cm-TEF1啟動(dòng)子<400>12ctgcagcagc ttctactgct gccgctccaa cattaggtgc tgaatatact agcggtactg 60gtaaattagt tggtgtggtt acattgactg atattttggg attatttgcc acatcaaaag 120gtagaagaac tgatccacaa gctgcaagaa accaaagaag aagaagttcc acttccacta 180cgagatcatc tgttgatagt gcattaaacg ctgaaggtgt gattaatcct tctgccacca 240
ccaccaccga tgccattcct ggtaataaca attctagtcg tagagaaagt gttgatgctt 300caagtgatgt tttcagaaaa tcatttacta aaccccaaga aaatgtattt tccaaagagt 360aagggttcct tctttcataa caaaaaaaga aaaacaatca ccgatttatt tatttatttg 420caatgctatt tataatatat tttgtagata aaaacaaatg aaaaatcttg ttagctatgt 480atactactac atatatacta caataaaaac acaccaaaat gaaacgtgtt ttgcacaatt 540tcgcacgact cagaggcatc gcatttctgt cctttttgta cgtcattgta atttttttta 600tgttattttt tttacagcaa gcaatccaaa aaaacaaaaa aaaaatgaga gagaaaaaaa 660tgagggggtt gatttaaaaa gatggtcaaa aatattcgtg acatattaca taatcgatga 720gtttgatatg gaacgaatat tgatggtttt ggtctgaatt gatatggtgt aagtatttgt 780tggtgataat tttatcaaca taaactcaat tccgctcaat tgtacaaaat tgaccttctt 840tcgccttttg ttcaatgcca ttttttccaa taattttttt tttcaaattt tgccatccag 900cacaaagaaa aaaaaaattt acatgtccga caactcaccg gtgtttctga caacaattga 960caacaccagt ctgtagaccc aattggtaag tcaatgataa ctactacatc tacctagttg 1020ttatctttta acttaaaatt agcaaagaaa taataatggt tatcattgaa gatggtttca 1080caaaattaaa cgaatacgtg tacgttttac caaaaagatt tttttttttc tctttagttt 1140ttttttcgtt gttcttccca tcactgaaaa atttttctcc ctctatataa atcaatccca 1200tcaacgaaaa ttttttttct tcctttttga attttttttt tctccttttt ttttctcctt 1260tttttttctc cttttctttc ttcatctaac ttatatttaa tcaatcatgg gtaaagaaaa 1320aactcacgtt aacgtcgttg ttattggtca cgtcgattct ggtaaatcta ctaccaccgg 1380tcacttgatc tacaagtgtg gtggtattga caaaagaacc attgaaaaat tcgaaaaaga 1440agctgctgaa ttaggtaaag gttctttcaa atacgcttgg gtcttggata aattgaaggc 1500tgaaagagaa agaggtatca ccattgatat cgctttgtgg aaattcgaaa ctccaaaata 1560ccacgttacc gttattgatg ctccaggtca cagagatttc atcaaaaata tgattactgg 1620tacttctcaa gctgattgtg ctattttgat tattgctggt ggtactggtg aattc 1675<210>13<211>1794
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ORF2S<400>13atg tct caa cca tct tat ggt cca ttg ttc gaa gct ttg gct cat tac48aat gat aaa ttg ttg gct atg gct aaa gct caa acc gaa aga act gct96caa gcc ttg ttg caa act aac ttg gat gat ttg ggt caa gtt ttg gaa144caa ggt tct caa caa cca tgg caa ttg att caa gct caa atg aat tgg192tgg caa gat caa tta aaa ttg atg caa cac act ttg tta aaa tct gct240ggt caa cca tct gaa cca gtt att act cca gaa aga tct gat aga aga288ttt aaa gct gaa gct tgg tct gaa caa cca att tat gat tac tta aaa336caa tcc tat ttg tta act gct aga cat ttg ttg gct tct gtt gat gct384ttg gaa ggt gtc cca caa aaa tct aga gaa aga ttg aga ttc ttt act432aga caa tac gtc aac gct atg gct cca tct aat ttc ttg gct act aac480cca gaa ttg tta aaa ttg act ttg gaa tcc gat ggt caa aat ttg gtt528aga ggt ttg gct tta ttg gct gaa gat ttg gaa aga tct gct gat caa576tta aac att aga ttg act gat gaa tcc gct ttt gaa tta ggt aga gat624ttg gct ttg act cca ggt aga gtt gtt caa aga act gaa tta tat gaa672tta att caa tac tct cca act act gaa acc gtt ggt aaa acc cca gtt720ttg atc gtt cca cca ttc att aat aaa tat tac att atg gat atg aga768cca caa aac tcc ttg gtc gct tgg ttg gtc gct caa ggt caa acc gtt816ttc atg att tcc tgg aga aac cca ggt gtt gct caa gct caa att gat864tta gat gat tat gtt gtt gat ggt gtc att gct gct ttg gat ggt gtt912gaa gcc gct act ggt gaa aga gaa gtt cac ggt att ggt tac tgt att960ggt ggt acc gct ttg tct tta gct atg ggt tgg ttg gcc gcc aga aga1008
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<223>終止子ALK1t<400>14
Atagatggat ttttcttttt tatgtgtatt tccggttaat aaatgtttaa attttttttt 60taataaaaat atttgtagtt atttatatgc aaaaaaaaaa aatattcaaa gcaatcttcc 120tttctttctt tatctttccc ccatgctaag gtctaaaaca ccacaactta aaacccaact 180taaccgtata atactaagat caatctccaa agatgcat 218<210>15<211>1017<212>DNA<213>Candida maltosa<220>
<223>啟動(dòng)子ALK1p<400>15atgcatgaac aggatttaat cccaagaaaa aagtctattt tctattttca caaggaaact 60ggaaaaacct ttttgtgttt tgaagtagct ccgtaataac ctgtaaaaaa ataaattttg 120aagatttgac ttgctgatga aaatgctatc agtgtagctc tagacttgat actagactat 180gatggcaaca catggtggtc aacgtgcaag acatcaccca atgagaagac tgctaaccag 240aaaaaaaagg ggacaaaaga aaaactcgag agaaaaagtc aaattggtgt aaaattggct 300atttttggta ctttcctaat ggggaaatta attgtttaaa attccagttt ttccagagtt 360aagatttcga ccaattattt ttaatccata tgatcttcat cattatcaac ttgtgaaaaa 420taataatcga ggtacgttta atacgagata ttagtctacg gctatgaatg ttggatatac 480ttcattgacg atcagaagct tgattggtta ttcaggtgca tgtgtggata taaacccaac 540aaattatcta gcaactgtgc cttccccaca ttggtcaaag aaaccctaaa gcaaattaaa 600atctggataa ataaatcatt catttcacat tttccggtta gtataaggtt ttttaaattt 660ttttttacag tttagccctt tcaattacca aatacggtaa caatgtgctt tgtaacatgc 720aggggatttt ctccgttgct gttttctcca catgctttta atgtgtaata aattaaaaaa 780
attacaaaga aaaaccggca tataagcatc ggagtttaca ttgttaacta actgcaaaat 840ggcgatgttt caaatcaaca aaatttaaaa aaaccccaaa aaaaaagtat catataaatt 900aaactcaaaa tccttttgat tgcataaaat ttttaaatct cttctttttt ttctttttta 960ctttcttatc tattctattc tttttttata tatctaattc atttataaca tctggtc1017<210>16<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ALK1p 5’的PCR引物<400>16tttttcagct ggagctcgtc gacatgcatg aacaggattt aatccc46<210>17<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ALK1p 3’的PCR引物<400>17ccggaattcc atatgcagat gttataaatg aattagata39
<210>18<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ALK1t 5’的PCR引物<400>18cggaagctta tagatggatt tttctttttt at 32<210>19<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ALK1t 3’的PCR引物<400>19tttttgatatc gagctcgtcg acatgcatct ttggagattg atctt45<210>20<211>47
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-ACT1p 5′的PCR引物<400>20cgcggatccg aattcgtcga catgcatgga tctcggctgt gaatcgc 47<210>21<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-ACT1p 3′的PCR引物<400>21gcgggatccc atatgtatcc aataaactcg taata35<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-GAP3p 5′的PCR引物<400>22atggctatta aaattggtat taacggtttc ggtag35<210>23<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-GAP3p 3′的PCR引物<400>23agaagcattg gagataatct tcaagtctgg agtgt35<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-PMA1p 5′的PCR引物<400>24gaatatctct cttccagtca ctcgagttgt attc 34
<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-PMA1p 3′的PCR引物<400>25ctcatatgaa gtttttgttt tctgtctc28<210>26<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-TEF1p 5′的PCR引物<400>26gcgggatcct cgagtaaggg ttccttcttt cata 34<210>27<211>38
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-TEF1p 3′的PCR引物<400>27ttttctttac ccatatgtga ttaaatataa gttagatg 38
權(quán)利要求
1.ACT1基因啟動(dòng)子，其包含下述(a)～(d)中任意一項(xiàng)的DNA(a)SEQ ID NO9所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO9所示的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO9所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(d)與SEQ ID NO9所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有啟動(dòng)子活性、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA；
2.一種DNA，其包含權(quán)利要求1所述的ACT1基因啟動(dòng)子和連接在該啟動(dòng)子序列下游的結(jié)構(gòu)基因。
3.基因表達(dá)單元，其包含權(quán)利要求2所述的DNA和終止子。
4.一種質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求3所述的基因表達(dá)單元。
5.權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為pUTA-ACT1-ORF2S。
6.GAP3基因啟動(dòng)子，其包含以下(a)～(d)中任意一項(xiàng)的DNA(a)SEQ ID NO10所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO10所示的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO10所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(d)與SEQ ID NO10所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有啟動(dòng)子活性、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA。
7.一種DNA，其包含權(quán)利要求6所述的GAP3基因啟動(dòng)子和連接在該啟動(dòng)子序列下游的結(jié)構(gòu)基因。
8.基因表達(dá)單元，其包含權(quán)利要求7所述的DNA和終止子。
9.一種質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求8所述的基因表達(dá)單元。
10.權(quán)利要求9所述的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為pUTA-GAP3-ORF2S。
11.PMA1基因啟動(dòng)子，其包含以下(a)～(d)中任意一項(xiàng)的DNA(a)SEQ ID NO11所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO11所示的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO11所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(d)與SEQ ID NO11所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有啟動(dòng)子活性、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA。
12.一種DNA，其包含權(quán)利要求11所述的PMA1基因啟動(dòng)子和連接在該啟動(dòng)子序列下游的結(jié)構(gòu)基因。
13.基因表達(dá)單元，其包含權(quán)利要求12所述的DNA和終止子。
14.一種質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求13所述的基因表達(dá)單元。
15.權(quán)利要求14所述的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為pUTA-PMA1-ORF2S。
16.TEF1基因啟動(dòng)子，其包含以下(a)～(d)中任意一項(xiàng)的DNA(a)SEQ ID NO12所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO12所示的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO12所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個(gè)堿基所得的堿基序列、并且具有啟動(dòng)子活性的DNA；(d)與SEQ ID NO12所示的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有啟動(dòng)子活性、來(lái)自假絲酵母屬酵母的DNA。
17.一種DNA，其包含權(quán)利要求16所述的TEF1基因啟動(dòng)子和連接在該啟動(dòng)子序列下游的結(jié)構(gòu)基因。
18.基因表達(dá)單元，其包含權(quán)利要求17所述的DNA和終止子。
19.一種質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求18所述的基因表達(dá)單元。
20.權(quán)利要求19所述的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為pUTA-TEF1-ORF2S。
21.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其通過(guò)往宿主細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求2、7、12或17所述的DNA而獲得。
22.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其通過(guò)往宿主細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求4、5、9、10、14、15、19或20所述的質(zhì)粒而獲得。
23.權(quán)利要求21或22所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為麥芽糖假絲酵母。
24.權(quán)利要求21～23中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述結(jié)構(gòu)基因來(lái)自豚鼠氣單胞菌，編碼參與3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚聚酯合成的酶。
25.一種生產(chǎn)3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚聚酯的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及SEQ ID NO9所示的ACT1基因啟動(dòng)子、SEQ ID NO10所述的GAP3基因啟動(dòng)子、SEQ ID NO11所述的PMA1基因啟動(dòng)子、SEQID NO12所述的TEF1基因啟動(dòng)子，以及包含含有上述啟動(dòng)子的基因表達(dá)單元的質(zhì)粒，導(dǎo)入了上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明還涉及共聚聚酯的生產(chǎn)方法，該方法包括培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1646686SQ0380751
公開日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月8日
發(fā)明者長(zhǎng)岡哲也, 橫溝聰, 官本憲二, 小坂田史雄, 松本圭司, 高木正道, 太田明德 申請(qǐng)人:株式會(huì)社鐘化