用于在真菌細胞中表達基因的啟動子的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明申請是基于申請日為2011年11月30日、申請?zhí)枮?01180066380. 3 (國際 申請?zhí)枮镻CT/US2011/062663)、名稱為"用于在真菌細胞中表達基因的啟動子"的發(fā)明專利 申請的分案申請。
[0002] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2010年11月30日提交的美國臨時申請系列號61/418, 302的權(quán)益， 該申請通過提述并入本文。
[0004] 涉及序列表
[0005] 本申請包含計算機可讀形式的序列表。所述計算機可讀形式通過提述并入本文。
[0006] 發(fā)明背景
技術(shù)領(lǐng)域
[0007] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法。本發(fā)明亦涉及分離的啟動子和涉及包含可操作地連 接于編碼多肽的多核苷酸的啟動子的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞。
【背景技術(shù)】
[0008] 在真菌宿主細胞，例如絲狀真菌細胞中，多肽的重組表達，可對于以商業(yè)上相關(guān)的 量產(chǎn)生所述多肽提供更理想的媒介（vehicle)。
[0009] 多肽的重組產(chǎn)生伴隨構(gòu)建表達盒，其中將編碼多肽的DNA置于啟動子的表達調(diào)控 下，所述啟動子從基因切出并適于所述宿主細胞。將該表達盒導(dǎo)入宿主細胞，通常通過質(zhì)粒 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。然后，多肽的產(chǎn)生通過在包含在所述表達盒上的啟動子的合適功能所需的誘 導(dǎo)條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞來實現(xiàn)。
[0010] 將真菌宿主細胞用于多肽的重組產(chǎn)生一般需要得到適于在宿主細胞中調(diào)控所述 多肽表達的啟動子。因此，在本領(lǐng)域具有對調(diào)控基因的重組表達的新穎啟動子的需要。
[0011] Melin等，2002,Mol.Genet.Genomics267(6):695-702 公開了構(gòu)巢曲霉 (Aspergillusnidulans)concanamycin(伴刀球霉素）誘導(dǎo)的蛋白C。Lu等，2010,Microb. CellFact. 9:23 公開了黑曲霉（Aspergillusniger)中的cipC蛋白。
[0012] 本發(fā)明提供了改善的用于在真菌宿主細胞中產(chǎn)生多肽的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生多肽的方法，其包括：(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞包含編碼多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可 操作地連接于啟動子，所述啟動子選自下組：（i)啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸 序列與SEQIDN0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3，SEQIDN0:4，SEQIDN0:5，SEQIDN0:6， SEQIDN0:7,SEQIDN0:8,SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32 具有至少 60%序列同一性； (ii)啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在至少中等嚴格條件下與以下雜交：SEQ IDN0:1,SEQIDN0:2,SEQIDN0:3,SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQID N0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32;或其全長互補鏈；（iii)啟動子，其包 含SEQIDN0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3，SEQIDN0:4，SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQ IDN0:7,SEQIDN0:8,SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32;(iv)啟動子，其包含（i)，（ii)， 或（iii)的保持啟動子活性的亞序列；和（v) (i)，（ii)，（iii)，或（iv)的突變、雜合或串聯(lián) (tandom)啟動子；其中所述編碼多肽的多核苷酸對于所述啟動子是外源的；和（b)從培養(yǎng) 基分尚所述多肽。
[0014] 本發(fā)明亦涉及分離的啟動子，其選自下組：（i)啟動子，其包含核苷酸序列，所述 核苷酸序列與SEQIDN0:1，SEQIDN0:2,SEQIDN0:3,SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQ IDN0:6，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32 具有至少 60%序列 同一性，（ii)啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在至少中等嚴格條件下與以下雜 交：SEQIDN0:1，SEQIDN0:2,SEQIDN0:3,SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6， SEQIDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32;或其全長互補鏈；（iii)啟動 子，其包含SEQIDN0:1，SEQIDN0:2,SEQIDN0:3,SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQID N0:6,SEQIDN0:7,SEQIDN0:8,SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32;(iv)啟動子，其包含 (i)，（ii)，或（iii)的保持啟動子活性的亞序列；和（v) (i)，（ii)，（iii)，或（iv)的突變、 雜合或串聯(lián)啟動子。
[0015] 本發(fā)明亦涉及包含可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的本發(fā)明的啟動子的構(gòu) 建體、載體和真菌宿主細胞。
[0016] 具體地，本發(fā)明涉及如下各項：
[0017] 1.-種產(chǎn)生多肽的方法，其包括：
[0018] (a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細 胞包含編碼多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于啟動子，所述啟動子選自下組： ⑴啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:1，SEQIDN0:2，SEQID N0:3，SEQIDN0:4，SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:31， 或SEQIDN0:32具有至少60%序列同一性，（ii)啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸 序列在至少中等嚴格條件下與以下雜交：SEQIDN0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3，SEQID N0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQIDN0:7,SEQIDN0:8,SEQIDN0:31，或SEQID NO:32;或其全長互補鏈；（iii)啟動子，其包含SEQIDNO: 1，SEQIDNO:2,SEQIDNO:3， SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQIDN0:7,SEQIDN0:8,SEQIDN0:31，或 SEQIDNO: 32 ;(iv)啟動子，其包含（i)，（ii)，或（iii)的保持啟動子活性的亞序列；和（v) (i)，（ii)，（iii)，或（iv)的突變、雜合或串聯(lián)啟動子；其中所述編碼多肽的多核苷酸對于 所述啟動子是外源的；和
[0019] (b)從培養(yǎng)基分咼所述多肽。
[0020] 2.項1的方法，其中所述啟動子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQID N0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3，SEQIDN0:4，SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQIDN0:7， SEQIDN0:8,SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32 具有至少 60%，至少 65%，至少 70%，至少 75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少 87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少 95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。
[0021] 3.項1的方法，其中所述啟動子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在中等嚴格條 件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交：SEQIDNO: 1，SEQID N0:2，SEQIDN0:3，SEQIDN0:4，SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8， SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32;或其全長互補鏈。
[0022] 4.項1的方法，其中所述啟動子包含或組成為SEQIDNO: 1，SEQIDNO: 2,SEQID N0:3，SEQIDN0:4，SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:31， 或SEQIDN0:32的多核苷酸序列；或其具有啟動子活性的亞序列。
[0023] 5.項1的方法，其中所述啟動子是雜合啟動子，其包含SEQIDNO: 1，SEQIDN0:2， SEQIDN0:3,SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQIDN0:7,和SEQIDN0:8 的 多核苷酸序列的一個或多個部分。
[0024] 6.項的方法1，其中所述啟動子是串聯(lián)啟動子，其包含SEQIDNO: 1，SEQIDN0:2， SEQIDN0:3,SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQIDN0:7,和SEQIDN0:8 的 一個或多個多核苷酸序列；或其保留啟動子活性的亞序列。
[0025] 7.項1-6任一項的方法，其中其中所述多肽對于真菌宿主細胞是天然的或外源 的。
[0026] 8.項1-7任一項的方法，其中所述真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。
[0027] 9.項1-7任一項的方法，其中所述真菌宿主細胞是酵母細胞。
[0028] 10.-種分離的啟動子，其選自下組：（i)啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸 序列與SEQIDN0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3，SEQIDN0:4，SEQIDN0:5，SEQIDN0:6， SEQIDN0:7,SEQIDN0:8,SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32 具有至少 60%序列同一性； (ii) 啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在至少中等嚴格條件下與以下雜交：SEQ IDN0:1,SEQIDN0:2,SEQIDN0:3,SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQID N0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32;或其全長互補鏈；（iii)啟動子，其包 含SEQIDN0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3，SEQIDN0:4，SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQ IDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32 ;(iv)啟動子，其包含（i)，（ii)，或 (iii) 的保持啟動子活性的亞序列；和（v) (i)，（ii)，（iii)，或（iv)的突變、雜合或串聯(lián)啟 動子。
[0029] 11.項10的啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:1，SEQID NO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8， SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%， 至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至 少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少 97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。
[0030] 12.項10的啟動子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在中等嚴格條件，中 等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交：SEQIDN0:1，SEQID NO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8， SEQIDN0:31，或SEQIDN0:32;或其全長互補鏈。
[0031] 13.項 10 的啟動子，其包含或組成為SEQIDNO: 1，SEQIDNO:2,SEQIDNO:3， SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQIDN0:7,SEQIDN0:8,SEQIDN0:31，或 SEQIDN0:32的多核苷酸序列；或其具有啟動子活性的亞序列。
[0032] 14.項10的啟動子，其為雜合啟動子，所述雜合啟動子包含SEQIDN0:1，SEQID NO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:8 的多核苷酸序列的一個或多個部分。
[0033] 15.項10的啟動子，其為串聯(lián)啟動子，所述串聯(lián)啟動子包含SEQIDN0:1，SEQID NO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:8 的一個或多個多核苷酸序列；或其保留啟動子活性的亞序列。
[0034] 16. -種核酸構(gòu)建體，其包含可操作地連接于項10-15任一項的啟動子的編碼多 肽的多核苷酸。
[0035] 17.-種重組宿主細胞，其包含項16的核酸構(gòu)建體。
[0036] 18.項17的重組宿主細胞，其為絲狀真菌細胞。
[0037] 19.項17的重組宿主細胞，其為酵母細胞。
【附圖說明】
[0038] 圖1顯示pHUda852的限制性圖。
[0039] 圖2顯示pMhCt036的限制性圖。
[0040] 圖3顯示來自黑曲霉889-852-47和黑曲霉cipC036. 24的發(fā)酵的相對淀粉葡糖苷 酶產(chǎn)率（yield)。
[0041] 定義
[0042] 等位變體（allelicvariant):術(shù)語"等位變體"意指占據(jù)相同染色體基因座的基 因的任何兩種或更多種（例如幾種）可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo) 致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊模ㄔ诰幋a的多肽中無變化）或可以編碼具有改 變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
[0043] cDNA:術(shù)語"cDNA"意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核或原核細胞的成熟的、已剪接 的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起 始的（initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工包括剪接，然 后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。
[0044] 編碼序列：術(shù)語"編碼序列"意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序 列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框以起始密碼子如ATG、GTG或TTG開始，并且以終止 密碼子如TAA、TAG或TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0045] 調(diào)控序列（controlsequence):術(shù)語"調(diào)控序列"意指對編碼多肽的多核苷酸表達 是必需的核酸序列。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的（即，來自 同一基因）或外源的（即，來自不同基因）。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷 酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子 和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所 述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼所述多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。
[0046] 表達：術(shù)語"表達"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
[0047] 表達載體：術(shù)語"表達載體"意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多 核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的調(diào)控序列可操作地連接。
[0048] 高嚴格條件：術(shù)語"高嚴格條件"意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C， 在5XSSPE、0.3%SDS、200 微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和50%的甲酰胺中，根據(jù) 標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0. 2%SDS在65°C 將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。
[0049] 宿主細胞：術(shù)語"宿主細胞"意指任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含感興 趣的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的（susc印tible)。術(shù) 語"宿主細胞"涵蓋任何親本細胞的后代，其由于在復(fù)制中發(fā)生的突變而不同于親本細胞。
[0050] 雜合啟動子：術(shù)語"雜合啟動子"意指兩個或更多個（例如幾個）啟動子的部分連 接在一起以生成是所述兩個或更多個啟動子的部分的融合物的序列，所述序列當可操作地 連接于編碼序列時，介導(dǎo)所述編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。
[0051] 分離的：術(shù)語"分離的"意指以不在自然界出現(xiàn)的形式或環(huán)境存在的物質(zhì)。分離 的物質(zhì)的非限定性實例包括（1)任何非天然存在的物質(zhì)，（2)任何至少部分地從一種或多 種或全部與其天然結(jié)合的天然存在的成分移出的物質(zhì)，包括但不限于任何酶、變體、多核苷 酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；（3)任何相對于見于自然界的該物質(zhì)經(jīng)人工修飾的物質(zhì)；或（4)任 何通過相對于與其自然結(jié)合的其他組分增加該物質(zhì)的量（例如，編碼該物質(zhì)的基因的多拷 貝；比與編碼該物質(zhì)的基因自然結(jié)合的啟動子更強的啟動子的使用）而修飾的物質(zhì)。感興 趣的多肽可以以發(fā)酵液產(chǎn)物的形式用于工業(yè)應(yīng)用，即所述多肽是在工業(yè)應(yīng)用（例如乙醇產(chǎn) 生）中作為產(chǎn)物使用的發(fā)酵液的組分。所述發(fā)酵液產(chǎn)物除了感興趣的多肽之外，還會包含 其它用于發(fā)酵工藝的成分，如例如細胞（包括含有編碼感興趣的多肽的基因的宿主細胞， 其用于產(chǎn)生所述多肽），細胞碎片，生物質(zhì)，發(fā)酵培養(yǎng)基和/或發(fā)酵產(chǎn)物?？扇芜x地對發(fā)酵 液進行一個或多個純化（包括過濾）步驟以去除或減少一種或多種發(fā)酵工藝的組分。相應(yīng) 地，分離的物質(zhì)可在此種發(fā)酵液產(chǎn)物中存在。
[0052] 低嚴格條件：術(shù)語"低嚴格條件"意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C， 在5XSSPE、0.3%SDS、200 微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和25%的甲酰胺中，根據(jù) 標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0. 2%SDS在50°C 將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。
[0053] 成熟多肽：術(shù)語"成熟多肽"意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存 在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本領(lǐng)域中已知宿 主細胞可產(chǎn)生由相同多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽（即具有不同的C端和/ 或N端氨基酸）的混合物。
[0054] 成熟多肽編碼序列：術(shù)語"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有生物活性的成熟多肽 的多核苷酸。
[0055] 中等嚴格條件：術(shù)語"中等嚴格條件"意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在 42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和35%的甲酰胺中， 根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0. 2%SDS在 55 °C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。
[0056]中等-高嚴格條件：術(shù)語"中等-高嚴格條件"意指對于長度至少100個核苷酸的 探針，在42°C，在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和35%的甲 酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0. 2%SDS在60°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。
[0057] 核酸構(gòu)建體：術(shù)語"核酸構(gòu)建體"意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在 的基因，或其經(jīng)修飾以本來不存在于（nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的 區(qū)段，或其為合成的。
[0058] 可操作地連接：術(shù)語"可操作地連接"意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對 于多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達。
[0059]多肽片段：術(shù)語"多肽片段"意指具有從成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失一個或 多個（例如幾個）氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物活性。在一個方面，所述片段具有 成熟多肽的氨基酸數(shù)的至少85%，例如至少90%或至少95%。
[0060] 多肽變體：術(shù)語"多肽變體"意指包含改變，即在一個或多個（例如幾個）位置的 取代、插入和/或缺失的具有生物活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占據(jù)某位置 的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指在鄰接并緊接著占據(jù)某位置的 氨基酸之后添加氨基酸。
[0061]啟動子：術(shù)語"啟動子"意指DNA序列，其結(jié)合RNA聚合酶并將所述聚合酶導(dǎo)向編 碼多肽的多核苷酸的下游轉(zhuǎn)錄起始位點以起始轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶有效地催化互補于編碼區(qū) 的合適DNA鏈的信使RNA的裝配（assembly)。術(shù)語"啟動子"亦理解為包括用于在轉(zhuǎn)錄為 mRNA之后的翻譯的5'非編碼區(qū)（在啟動子和翻譯起點之間），順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如增 強子，和其它能夠與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的核苷酸序列。
[0062]啟動子變體：術(shù)語"啟動子變體"意指包含改變，即在一個或多個（例如幾個）位 置的取代、插入和/或缺失的啟動子。取代意指用不同的氨基酸替代占據(jù)某位置的氨基酸； 缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指在鄰接并緊接著占據(jù)某位置的氨基酸之后 添加氨基酸。術(shù)語"啟動子變體"亦會涵蓋天然變體，和通過使用本領(lǐng)域公知的方法如經(jīng)典 的誘變，定位誘變和DNA改組而獲得的體外生成的變體。
[0063] 序列同一性：參數(shù)"序列同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間 的相關(guān)性。
[0064] 就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,Trends Genet. 16:276-277)，優(yōu)選3. 0. 0、5. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch, 1970,J.Mol.Biol. 48:443-453)來測定。 使用的參數(shù)為缺口罰分（gappenalty) 10,缺口延伸罰分（gapextensionpenalty)0. 5和 EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版）取代矩陣。使用Needle標記為"最高同一性（longest identity) "的輸出結(jié)果（使用-nobrief選項獲得）作為同一1性百分比，并計算如下：
[0065](同樣的殘基X100V(比對長度一比對中缺口的總數(shù)）
[0066] 就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上 文），優(yōu)選3. 0. 0、5. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和Wunsch，1970,見上文）來測定。使用的參數(shù)為缺口罰分10,缺口延伸罰分 0. 5和EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版）取代矩陣。使用Needle標記為"最高同一性" 的輸出結(jié)果（使用-nobrief選項獲得）作為同一性百分比，并計算如下：
[0067](同樣的脫氧核糖核苷酸X100V(比對長度一比對中缺口的總數(shù)）
[0068] 亞序列：術(shù)語"亞序列（subsequence) "意指從成熟多肽編碼序列的5'和/或3' 端缺失一個或多個（例如幾個）核苷酸的多核苷酸，其中所述亞序列編碼具有生物活性的 片段，或者從啟動子序列的5'和/或3'端缺失一個或多個（例如幾個）核苷酸的多核苷 酸，其中所述啟動子亞序列具有啟動子活性。在一個方面，所述亞序列具有成熟多肽編碼序 列的核苷酸數(shù)的至少85%，例如至少90%或至少95%。在另一個方面，所述啟動子亞序列 具有啟動子序列的核苷酸數(shù)的至少85%，例如至少90%或至少95%。
[0069] 串聯(lián)啟動子：術(shù)語"串聯(lián)啟動子"意指串聯(lián)連接的兩個或更多個（例如幾個）啟動 子，其每一個均可操作地連接于編碼序列并介導(dǎo)所述編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。
[0070] 非常高嚴格條件：術(shù)語"非常高嚴格條件"意指對于長度至少100個核苷酸的探 針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和50%的甲酰 胺中，根據(jù)標