專利名稱：：一種防治煙草粉螟的生防菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種防治煙草粉螟的生防菌劑。屬微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：煙草粉螟^力est/ae7"&77a(他bner)，屬鱗翅目螟蛾科。在煙葉倉庫害蟲中是僅次于煙草甲的倉貯害蟲。煙草粉螟廣泛分布于世界熱帶及溫帶地區(qū)，國內(nèi)分布于遼寧、甘肅、云南、貴州、四川、湖南、湖北、河南及江蘇等地。在云南，煙葉倉庫害蟲以煙草粉螟為害最重，資料統(tǒng)計表明，每年因這種害蟲造成的忙煙量損失占總貯量的0.5%1%。煙草粉螟以幼蟲危害煙葉，成蟲不吃食物。幼蟲喜吃含糖高、尼古丁低的烤煙和香料煙。目前，防治煙葉倉庫害蟲主要應(yīng)用熏蒸劑(如磷化鋁)薰蒸。但是近年來，國內(nèi)外對環(huán)境保護日益重視，要求減少和禁止使用劇毒薰蒸劑的呼聲高漲，氰化氫、溴甲烷、磷化鋁等已相繼被禁用。在煙葉倉庫中使用磷化鋁，由于操作不當易造成火災(zāi)，且倉庫需要良好的密封性能。由于人類對環(huán)境保護及自身健康意識的增強，生物防治已成為人們研究的熱點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種使用安全、煙葉及環(huán)境污染低的防治煙草粉螟的生防菌劑，為煙葉的貯存提供技術(shù)支持。本發(fā)明采用的是蘇云金桿菌科爾默亞種few7hs2^^y/^7'e/sissi/力5"/.co/歷er菌株5，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院；保藏日期2009年2月6日；保藏登記入冊的編號CGMCCNO.2895。菌株5屬于蘇云金桿菌，系本發(fā)明人從大量復(fù)烤煙葉里分離出的蘇云金桿菌中篩選出來的，對煙草粉螟具有較好防治效果。本發(fā)明人通過13項生理生化試驗結(jié)果與已知的29個蘇云金桿菌亞種的生理生化指標比較，鑒定為科爾默亞種co7歷er，血清型Ha。本發(fā)明的生物菌劑經(jīng)如下工藝制成試管種子培養(yǎng)將菌株5接種到試管斜面培養(yǎng)基上，試管斜面培養(yǎng)基(重量百分比)配方為牛肉膏5%，蛋白胨1.0%，瓊脂2.0%,氯化鈉0.5%,pH8.0;30'C恒溫培養(yǎng)2天，獲得試管種子。液體發(fā)酵采用試管培養(yǎng)的蘇云金桿菌菌株5原種，按三角搖瓶一種子罐一發(fā)酵罐的三級工藝培養(yǎng)。在30L發(fā)酵罐中，裝入20L液體發(fā)酵培養(yǎng)液，液體培養(yǎng)基(重量百分比)配方為玉米粉0.5%、黃豆粉2.0%、酵母粉0.15%、魚粉0.25%、蛋白胨0.05%、磷酸二氫鉀0.25%、碳酸鈣0.05%和硫酸鎂0.035%、0.025%植物油作消泡劑，初始pH值為7.5。經(jīng)0.05mpa滅菌30分鐘，冷卻至室溫接入1.8L菌株5液體種子，接種量為9%(體積比)，發(fā)酵溫度為30。C，通氣量為15%(體積比)，攪拌速度為150r/min，發(fā)酵時間為36h。制備生防菌劑將經(jīng)液體發(fā)酵后的培養(yǎng)液在5。C溫度下，用高速離心機5000g離心20分鐘，去除上清液一離心后的沉淀物用凍干超濾儀在室溫下凍干一粉碎成粉得到生防菌劑，生防菌劑(粉劑)的活芽孢數(shù)為4.76Xl(T個/ml。本發(fā)明的生防菌劑具有使用安全、煙葉及環(huán)境污染低的優(yōu)點，能廣泛用于煙葉貯存中煙草粉螟的生物防治。具體實施例方式一、生防菌劑的制備本發(fā)明的生物菌劑經(jīng)如下工藝制成試管種培養(yǎng)將菌株5接種到試管斜面培養(yǎng)基上，試管斜面培養(yǎng)基(重量百分比)配方為牛肉膏5%，蛋白胨1.0%，瓊脂2.0%，氯化鈉0.5%，pH8.0;30。C恒溫培養(yǎng)2天，獲得試管種。液體發(fā)酵采用試管培養(yǎng)的蘇云金桿菌菌株5原種，按三角搖瓶一種子罐一發(fā)酵罐的三級工藝培養(yǎng)。在30L發(fā)酵罐中，裝入20L液體發(fā)酵培養(yǎng)液，液體培養(yǎng)基(重量百分比)配方為玉米粉0.5%、黃豆粉2.0%、酵母粉0.15%、魚粉0.25%、蛋白胨0.05%、磷酸二氫鉀0.25%、碳酸鈣0.05%和硫酸鎂0.035%，0.025%植物油作消泡劑，初始pH值為7.5。經(jīng)0.05卿a滅菌30分鐘，冷卻至室溫接入1.8L菌株5液體種子(接種量為9%)，發(fā)酵溫度為3(TC，通氣量為15%，攪拌速度為150r/min，發(fā)酵時間為36h。制備生防菌劑將經(jīng)液體發(fā)酵后的培養(yǎng)液在5t溫度下，用高速離心機5000g離心20分鐘，去除上清液一離心后的沉淀物用凍干超濾儀在室溫下凍干一粉碎成粉得到生防菌劑，生防菌劑(粉劑)的活芽孢數(shù)為4.76X10"'個/ml。二、本發(fā)明生防菌劑防治煙草粉螟的功能試驗1、菌株5對幼蟲生長發(fā)育的影響設(shè)IOO、200、300倍三個濃度。以噴無菌水為對照。噴(菌)液量為20W/g菌劑處理煙葉后置于養(yǎng)蟲室，溫濕度為自然溫濕度。每試驗濃度接蟲15頭，三次重復(fù)。試驗處理后7天調(diào)查煙草粉螟的死亡情況。從表l可知菌株5的100、200、300倍對一至五齡煙草粉螟幼蟲的防治效果均均為100%。表l菌株5對煙草粉螟的防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、菌株5小批量防治煙草粉螟試驗2.1材料與方法無蟲復(fù)烤煙葉等級為云南玉溪中部桔黃二級GF煙葉；有蟲復(fù)烤煙葉為云南昭通中部桔黃二級C2F煙葉。設(shè)100、200、300倍三個濃度，三次重復(fù)。以噴無菌水為對照。試驗重復(fù)設(shè)置如表2。每小區(qū)4kg煙葉，噴(菌)液量為20ml/kg菌劑處理后置于玉溪煙廠第一煙葉庫區(qū)11號試驗倉庫，溫濕度為自然溫濕度。試驗處理后20天調(diào)査蟲情。防治效果計算公式無蟲復(fù)烤煙葉組_對照試驗組-處理試驗組防治效果=X100%對照試驗組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>試驗后對照組基數(shù)-試驗前對照組基數(shù)表2試驗重復(fù)設(shè)置<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>菌株5200W33-200-1W33-200-2W33-200-3Y33-200菌株5300W33-300-1W33-300-2W33-300-3Y33-300CKWCK—1WCK-2WCK-3YCK2.2結(jié)果與分析2.2.1菌株5對無蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果由表3可知菌株5對無蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果100是88.94%;200倍是68.14%;300倍是65.04%。表3菌株5對無蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果菌株濃度(倍)無蟲復(fù)烤煙葉組(頭)防治效果(%)IIIIII合計菌株510083142588.94菌株52003126157268.14菌株53004326107965.04CK7877712262.2.2菌株5對有蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果由表4可知菌株5對有蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果100倍是88.57%;200倍是77.14%;300倍分別是65.71%。表4菌株5對有蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果菌株濃度(倍)有蟲復(fù)烤煙葉組(頭)防治效果(％)Bt33100688.57Bt332001077.14Bt333001465.71CK試驗前2CK試驗后__3菌株5在煙葉倉庫中的防治效果試驗3.1材料與方法試驗地點為云南玉溪、楚雄煙廠煙葉倉庫；煙葉等級為上部桔黃二級B2F;菌劑施用方法(1)、煙葉均勻噴霧，菌劑0.lg/lkg煙葉+無菌水5ml/lkg煙葉；(2)、煙包表面噴霧，0.2g/lkg煙葉+無菌水5ml/lkg。煙葉噴菌劑后按常規(guī)打包煙葉倉庫存貯。施藥后3、6、12個月定期調(diào)査蟲害發(fā)生情況。3.2結(jié)果與分析從表5中可知噴菌劑后3個月玉溪、楚雄兩個試驗點各處理均未遭到蟲害。6個月后兩個試驗點煙葉均勻噴霧的各處理防治效果較好；煙包表面噴霧處理均發(fā)生蟲6害；12個月后兩個試驗點煙葉均勻噴霧的各處理防治效果較好；煙包表面噴霧處理均發(fā)生蟲害，但與對照比蟲害輕?？傊?，兩個試驗點煙葉均勻噴霧菌劑處理對煙草粉螟的防治效果好于煙包表面噴霧菌劑處理；煙葉均勻噴霧菌劑處理與對照比，防治草粉螟的效果較好。表5菌株5在煙葉倉庫中使用效果評價試驗地點處理噴菌劑后噴菌劑后3個月6個月噴菌劑后12個月噴施菌劑方法蟲情防效蟲情防效蟲情防效煙葉均勻噴霧_-優(yōu)-優(yōu)玉溪煙包表面噴霧-+中+良CK一++++++煙葉均勾噴霧-_優(yōu)+良楚雄煙包表面噴霧-+中++中CK一++++++—，，表示無蟲害發(fā)生；"+"表示有蟲害發(fā)生，"+"號越多表示蟲害越嚴重。4施用菌劑后對煙葉化學成分的影響，噴菌株5菌劑后3、6、9、12個月取樣對煙葉進行化學常規(guī)成分分析，各處理總糖、還原糖、總氮、煙堿、蛋白質(zhì)含量與同期CK相比，無明顯影響。說明使用菌株5防治煙草粉螟后對煙葉化學成分影響不大。(表6)表6噴施菌株5菌劑對煙葉化學常規(guī)成分的影響測定時間(月)樣品總糖名稱(％)與對照還原糖與對照比(%)(%)比(%)總氮(%)與對照蛋白質(zhì)與對照煙堿比(%)(%)比(%)(%)與對照比(%)0噴藥前26.7824.122.229.573.613菌株525.37CK25.190.7422.3223.77-6.101.862.09008.129.30-12.692.923.14-7.016菌株524.73CK25.39-2.7122.2022.82-2.721.961.818.298.267.529.843.403.254.629菌株524.10CK24.22-O.5022.0822.57-2.172.282.222.7010.199.883.143.383.302.4212菌株525.50CK24.454.3122.4322.131.342.182.170.5110.1710.051.243.203.28-2.36注數(shù)據(jù)由云南省煙草科學研究所分析測試中心分析.5施用菌劑對單體煙評吸結(jié)果的影響噴菌劑后12個月取煙樣進行單體煙評吸，結(jié)果見表7。經(jīng)云南煙草研究院產(chǎn)品開發(fā)研究室評吸認為1#(菌株5)樣煙在香氣質(zhì)、香氣量、雜氣方面的品質(zhì)均優(yōu)于賴(CK)樣煙。在刺激性、勁頭、余味方面4支煙較為接近。表7均勻噴霧處理噴菌劑后12個月的單體煙評吸結(jié)果評吸指標fffck_i_總分處--s香氣質(zhì)香氣量煙氣濃度雜氣刺激性勁頭余味平均[30分]'[9分][9分][9分]2[分][9分]菌株26.80±1.6426.80±1.107.40±0.897.00±0.716.40±0.891.20±0.456.80±1.3082.405CK25.00±3.3224.40±2.886.20±0.846.00±1.226.80±1.301.60±0.556.80±1.3076.80注由云南煙草研究院產(chǎn)品開發(fā)研究室評吸.8權(quán)利要求1、一種防治煙草粉螟的生防菌劑，該生物菌劑由生產(chǎn)菌株經(jīng)試管種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵及制備生防菌劑工序得到，其特征在于a.生產(chǎn)菌株為蘇云金桿菌科爾默亞種(Bacillusthuringiensissubsp.colmer)菌株5，CGMCCNO.2895；b.試管種子培養(yǎng)將菌株5接種到試管斜面培養(yǎng)基上，試管斜面培養(yǎng)基配方為牛肉膏5％，蛋白胨1.0％，瓊脂2.0％，氯化鈉0.5％，pH8.0，配方的比例為重量百分比，30℃恒溫培養(yǎng)2天，獲得試管種子；c.液體發(fā)酵將菌株5種子接種到發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基配方為玉米粉0.5％、黃豆粉2.0％、酵母粉0.15％、魚粉0.25％、蛋白胨0.05％、磷酸二氫鉀0.25％、碳酸鈣0.05％和硫酸鎂0.035％，0.025％植物油作消泡劑，初始pH值為7.5，配方的比例為重量百分比，在發(fā)酵溫度30℃，通氣量15％，攪拌速度150r/min的條件下發(fā)酵36h；d.制備生防菌劑將經(jīng)液體發(fā)酵后的培養(yǎng)液在5℃溫度下，用高速離心機5000g離心20分鐘，離心后的沉淀物用凍干超濾儀在室溫下凍干，粉碎成粉得到生防菌劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種防治煙草粉螟的生防菌劑，屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。該生防菌劑由如下工序制備a.生產(chǎn)菌株為蘇云金桿菌菌侏5，CGMCCNO.2895；b.將菌株5接種到牛肉膏5％，蛋白胨1.0％，瓊脂2.0％，氯化鈉0.5％，pH8.0的試管斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)2天，獲得試管種子；c.將種子接種到裝有玉米粉0.5％、黃豆粉2.0％、酵母粉0.15％、魚粉0.25％、蛋白胨0.05％、磷酸二氫鉀0.25％、碳酸鈣0.05％和硫酸鎂0.035％，消泡劑0.025％，pH7.5，其余為水的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度30℃，通氣量15％，攪拌速度150r/min的條件下發(fā)酵36h；d.培養(yǎng)液5℃下用離心機5000g離心20分鐘，沉淀物室溫凍干，粉碎即得生防菌劑。本發(fā)明的生物制劑具有使用安全、煙葉及環(huán)境污染低的優(yōu)點，能夠用于煙葉貯存中煙草粉螟的生物防治。文檔編號C12R1/07GK101558765SQ20091009413公開日2009年10月21日申請日期2009年2月27日優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日發(fā)明者勇劉,宋春滿,李天飛,鄧云龍,高家合申請人:云南省煙草科學研究所