專(zhuān)利名稱(chēng)：二化螟與臺(tái)灣稻螟的分子生物學(xué)區(qū)分方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻害蟲(chóng)二化螟(Chilo suppressalis walker)和臺(tái)灣稻螟(Chiloauricilia Dudgeo)的分子生物學(xué)區(qū)分方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
二化螟和臺(tái)灣稻螟是水稻上的常發(fā)性害蟲(chóng)，由于都屬于鉆蛀性害蟲(chóng)，較難防治，常常造成水稻的大面積減產(chǎn)。二化螟和臺(tái)灣稻螟的危害方式相似，幼蟲(chóng)都是先在葉鞘處危害，再?gòu)娜~鞘處蛀孔侵入稻莖內(nèi)。對(duì)水稻造成的危害狀態(tài)也非常相似，都會(huì)形成枯鞘、枯心、枯孕穗等癥狀，根據(jù)稻田內(nèi)的危害狀況，我們無(wú)法準(zhǔn)確判斷是二化螟導(dǎo)致的危害還是臺(tái)灣稻螟導(dǎo)致的危害。二化螟和臺(tái)灣稻螟的幼蟲(chóng)通常都為6齡，幼蟲(chóng)體色相似且背部都有5條褐色縱線(xiàn)，利用肉眼觀察很難將兩者區(qū)分開(kāi)來(lái)。再者，當(dāng)二化螟或臺(tái)灣稻螟被微生物感染后，蟲(chóng)體完全喪失原有的形態(tài)特征，導(dǎo)致無(wú)法判斷是何種螟蟲(chóng)。目前對(duì)于二化螟和臺(tái)灣稻螟的鑒定，通常是借助于形態(tài)學(xué)特征來(lái)區(qū)分，這必須保證待測(cè)樣本的關(guān)鍵形態(tài)學(xué)特征完好無(wú)損，但如上所述，當(dāng)形態(tài)特征喪失后，則無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分二化螟和臺(tái)灣稻螟，這極大限制了二化螟和臺(tái)灣稻螟相關(guān)領(lǐng)域的研究。例如，若要研究某地區(qū)二化螟或臺(tái)灣稻螟的微生物侵染狀況，但由于無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分被微生物侵染的樣本是何種螟蟲(chóng)，所以這一領(lǐng)域的研究受到了很大的限制。為了解決這一難題，我們發(fā)明了這一分子生物學(xué)區(qū)分方法。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的提供一種準(zhǔn)確區(qū)分二化螟和臺(tái)灣稻螟的分子生物學(xué)方法，為非昆蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)教育背景的相關(guān)人員提供一種可靠的二化螟和臺(tái)灣稻螟的區(qū)分方法。2、技術(shù)方案以待測(cè)樣本的基因組DNA為模板，禾Ij用特異引物F:5，-GGGCAAGAAAGTAGACGCCTGGTT-3，和 R 5，-AAAACCCAAAGAGGCGACACGGTA-3，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶MspAl I進(jìn)行酶切消化，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。如果只有一條400bp的片段，則所檢測(cè)的樣本二化螟；如果得到兩條片段分別為M7bp和15!3bp，則所檢測(cè)樣本為臺(tái)灣稻螟。3、有益效果本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法相比，主要優(yōu)點(diǎn)有(1)準(zhǔn)確性高傳統(tǒng)方法會(huì)因?yàn)椴煌蔫b定人對(duì)各分類(lèi)特征把握的不準(zhǔn)確而導(dǎo)致鑒定結(jié)果出現(xiàn)誤差。而本發(fā)明的方法是基于PCR的分子檢測(cè)技術(shù)，而PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展的很成熟，擁有標(biāo)準(zhǔn)化和傻瓜化的實(shí)驗(yàn)流程，保證了結(jié)果的高準(zhǔn)確性。( 靈敏度高傳統(tǒng)方法對(duì)喪失形態(tài)學(xué)特征的樣本無(wú)法進(jìn)行區(qū)分。而基于本發(fā)明的方法，只要能從待測(cè)樣本中提取微量的基因組DNA，就能夠擴(kuò)增得到目標(biāo)PCR產(chǎn)物，從而完成對(duì)待測(cè)樣本的鑒定。具體實(shí)施例方式1、樣本基因組DNA的提取利用上海生工UNIQ-10柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取樣本的基因組DNA，具體操作如下(1)待檢測(cè)的樣本，在液氮中磨成粉末，并轉(zhuǎn)移置1. 5ml的離心管中；(2)加入300 μ 1 ACL Solution和20 μ 1的蛋白酶K。(預(yù)先將蛋白酶K置37°C溫育1小時(shí)，以利于激活蛋白酶K的活性)；(3)渦旋震蕩混勻1分鐘，然后置于55°C水浴放置1-3小時(shí)，在此期間可以適當(dāng)取出混勻，有助于充分裂解；(4)取出樣品，待降至室溫后輕輕晃動(dòng)混勻，然后12，OOOrpm離心5分鐘；(5)吸取 300μ 1 上清至 UNIQ-lOColumn，然后再吸取 300μ 1 的 AB Solution 至UNIQ-IOColumn中，上下顛倒混勻2_3次，室溫靜置3分鐘；(6)3，OOOrpm離心3分鐘，取下UNIQ-lOColumn，倒掉收集管中廢液；(7)將 UNIQ-IOColumn 放回收集管中，加入 500 μ 1 Wash Solution，8，OOOrpm，室溫離心30秒；(8)重復(fù)步驟(7) —次；(9)取下UNIQ-lOColumn，棄去收集管中的廢液，將UNIQ-IOColumn放回收集管中，10，OOOrpm,室溫離心30秒，以除去殘留Wash Solution ；(10)將UNIQ-lOColumn放入干凈1. 5ml的離心管中，在UNIQ-lOColumn中央加入50 μ 1 Elution Buffer，室溫放置2-3分鐘。再10，OOOrpm，室溫離心1分鐘。離心管中的液體即為樣本的基因組DNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?、PCR體系的配制使用25 μ 1 的 PCR反應(yīng)體系，包括2. 5 μ 1 的 10XPCR Buffer (Mg2+ Free)、2 μ 1 的dNTPs (2. 5mmol/L)、l. 5μ 1 的 MgCl2 Q5mmol/L)、上游和下游引物(10ymol/L)各 Ιμ 、樣本基因組 DNAl μ 1,0. 125 μ 1 的 iTaq DNA Polymerase (TakaRa)，再加滅菌水補(bǔ)足至 25 μ 1。3、PCR擴(kuò)增程序940C 3 分鐘；94°C 30 秒、60°C 30 秒、72°C 50 秒(32 個(gè)循環(huán))；72°C 8 分鐘。4、PCR產(chǎn)物的MspAl I酶切消化10 μ 1 的酶切體系，包括1μ 1 的 IOXBuffer 4,0. 1μ 1 的 100XBSA、0. 25 μ 1 的MspAl I酶、PCR產(chǎn)物彡0. 5 μ g，加滅菌水補(bǔ)足至10 μ 1。之后37°C溫育1-2小時(shí)。5、酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物在2 %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，穩(wěn)流80mA，電泳40分鐘，溴化乙錠(EB)染色后在紫外等下觀察，根據(jù)DNA Marker判斷電泳條帶的大小。若電泳顯示只有一條長(zhǎng)400bp的片段，則表示待測(cè)樣本為二化螟；若電泳顯示有兩條片段，分別長(zhǎng)M7bp和15!3bp，則表示所測(cè)樣本為臺(tái)灣稻螟。實(shí)施例2011年11月，我們?cè)趶V東河源田間采集到3份被微生物侵染的樣本，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察無(wú)法確定樣本是二化螟還是臺(tái)灣稻螟，則利用本發(fā)明方進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，這三份樣本均為臺(tái)灣稻螟。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖中的圖2。
五

圖1 二化螟和臺(tái)灣稻螟的特征性電泳圖譜圖2廣東河源田間采集樣本的檢測(cè)結(jié)果在圖1中，“Csu”指示的是二化螟樣本，“Cau”指示的是臺(tái)灣稻螟樣本。在圖2中，A、B、C所指示的三條泳道表示3份檢測(cè)樣品。在圖1和圖2中，“M”所指示的泳道是DNAMarker，從上到下依次為 IOOObp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp。在“摘要附圖” Word文檔中的圖即為“說(shuō)明書(shū)附圖” Word文檔中的圖1。
權(quán)利要求
1.一種利用分子生物學(xué)手段準(zhǔn)確區(qū)分二化螟和臺(tái)灣稻螟的方法，其特征是當(dāng)常規(guī)形態(tài)學(xué)方法無(wú)法區(qū)分樣本是二化螟還是臺(tái)灣稻螟時(shí)，提取待檢測(cè)樣本的基因組DNA做為PCR 的模板，利用所設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再用利用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切消化，最后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳條帶來(lái)準(zhǔn)確區(qū)分待檢測(cè)樣本是屬于二化螟還是臺(tái)灣稻螟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是利用我們所設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 在二化螟中擴(kuò)增獲得的片段上沒(méi)有MspAl I切割位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物酶切后電泳只有一條條帶， 長(zhǎng)400bp，而在臺(tái)灣稻螟中擴(kuò)增得到的片段上存在一個(gè)MspAl I的切割位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物酶切后電泳顯示有兩條條帶，分別長(zhǎng)M7bp和15!3bp。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻害蟲(chóng)二化螟和臺(tái)灣稻螟的分子生物學(xué)區(qū)分方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。以基因組DNA為模板，用特異性引物F5’-GGGCAAGAAAGTAGACGCCTGGTT-3’和R5’-AAAACCCAAAGAGGCGACACGGTA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶MspA1 I進(jìn)行酶切消化，如果僅得到一條長(zhǎng)400bp的片段，則說(shuō)明所檢測(cè)的樣本為二化螟；如果得到兩條片段分別為247bp和153bp，則說(shuō)明所檢測(cè)的樣本為臺(tái)灣稻螟。該方法穩(wěn)定性高、周期短、靈敏度高，專(zhuān)用于二化螟和臺(tái)灣稻螟的高靈敏度快速檢測(cè)區(qū)分。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559922SQ20121006454
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者劉寶生, 張志春, 張谷豐, 方繼朝, 羅光華, 郭慧芳 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院