專利名稱：一種篩選抗酚發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的方法
技術(shù)領域：
。
技術(shù)背景發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)是植物遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因 研究的一種重要工具，它屬根瘤菌科(Rhizobiaceae)，農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的一種 革蘭氏陰性土壤細菌。茶樹(Camellia sinensis)是一種富含兒茶素等多酚類物質(zhì)的多 年生木本植物，大量研究表明茶樹中的這類多酚類物質(zhì)具有明顯的殺菌或抑菌作用[杜 曉，李寧，周茹娟，等.植物中分離的兒茶素類及其聚合物的抑菌作用[J].四川農(nóng)業(yè)大學 學報.2005,23(3) :374-378.;王靜，戚向陽，朱學良，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯及其 不同氧化級分的抑菌活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā).2008 ]，這種抑菌作用將直接 阻礙發(fā)根農(nóng)桿菌對茶樹的遺傳轉(zhuǎn)化，這也就是國內(nèi)外發(fā)根農(nóng)桿菌介導茶樹遺傳轉(zhuǎn)化率極低 [張廣輝，梁月榮，陸建良.發(fā)根農(nóng)桿菌介導的茶樹發(fā)根高頻誘導與遺傳轉(zhuǎn)化[J].茶葉科 學.2006,26(1) :1-10.;奚彪，劉祖生，梁月榮，等.發(fā)根農(nóng)桿菌介導的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 茶葉禾斗學.1997， 17(增刊)155-156. ;Zebra M，Banerjee S，Mathur A K，et al. Induction of hairy roots in tea(C咖ellia sinensis L ) [J]. Current Science. 1996， 70 (1): 84-86.]及茶樹轉(zhuǎn)基因育種難以成功的主要原因。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種篩選抗酚發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的方法，通過該方 法獲得抗酚性較強的菌株，使之在介導茶樹等富含多酚類的植物時仍具有相當高的活性， 應用該方法獲得的抗酚性強的菌株可提高茶樹的發(fā)根誘導頻率及發(fā)根密度，為發(fā)根農(nóng)桿菌 介導的遺傳轉(zhuǎn)化應用于茶樹研究解決一大難題。 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種篩選抗酚發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的方法，將發(fā)根農(nóng)桿菌 菌株(Agrobacterium rhizogenes)轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然 后將此活化菌液100 1涂布在含有茶多酚濃度為25-800 g/ml以及含卡那霉素的AB固 體培養(yǎng)基上進行抑菌培養(yǎng)24-48小時，挑取在200 g/ml茶多酚濃度下仍能生長的單菌落， 再轉(zhuǎn)接到含200 g/ml濃度茶多酚的含卡那霉素的AB液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將活 化的菌液100 y 1分別涂布到含200、400、800和1000 y g/ml濃度的茶多酚的含卡那霉素的 AB液體培養(yǎng)基的平板進行再次抗酚篩選和活化培養(yǎng)，依此進行2-3次抗酚篩選直至獲得在 800-1000g/ml濃度茶多酚培養(yǎng)基仍然能生長形成菌落的抗酚性強的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。
所述含卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基由下法得到將lg酵母提取物，5g牛肉浸膏， 5g蛋白胨，0. 5gMgS04 7H^，5g蔗糖溶解到900ml的蒸餾水中，再用1NnaOH調(diào)節(jié)pH值至 7. 2，然后用蒸餾水定容至1000ml，蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基溫度降至60°C以下加入經(jīng)0. 22 y微 孔濾膜過濾滅菌的濃度100mg/ml卡那霉素1ml 。 所述含卡那霉素AB固體培養(yǎng)基由下法得到將3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、 0. 5gMgS04 7H20、lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mg FeS04 7H20、5g蔗糖和15g瓊脂溶解到900ml 的蒸餾水中，用IN NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2，蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基溫度降至60°C以下加入 經(jīng)0. 22 微孔濾膜過濾滅菌的濃度100mg/ml卡那霉素1ml ;所述含卡那霉素AB液體培 養(yǎng)基由下法得到將3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、0. 5gMgS04 7H20、 lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mgFeS04 7H20和5g蔗糖溶解到900ml的蒸餾水中，用IN NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2，然后 用蒸餾水定容至lOOOml，蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基溫度降至60°C以下加入經(jīng)0. 22 y微孔濾膜過 濾滅菌的濃度100mg/ml卡那霉素1ml 。
所述茶多酚中兒茶素的含量>80%。 所述茶多酚含有咖啡因0. 26%，表沒食子兒茶素2. 66%， dl_兒茶素0. 71 %，表 兒茶素2. 15%，表沒食子兒茶素沒食子酯62. 83%，沒食子兒茶素沒食子酯3. 03%，表兒茶 素沒食子酯16. 79%。 本發(fā)明通過抗酚篩選獲得了抗酚性強的菌株，使之在介導茶樹等富含多酚類的植 物時仍具有相當高的活性，應用該方法獲得的抗酚性強的菌株可提高茶樹的發(fā)根誘導頻率 及發(fā)根密度2-3倍，為發(fā)根農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化應用于茶樹研究解決了一大難題，也為 其他富含多酚類植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究以及利用發(fā)根培養(yǎng)生物合成兒茶素等次生代謝產(chǎn)物 提供了一條有效途徑。
具體實施方式
用接種環(huán)挑取儲存的原始發(fā)根農(nóng)桿菌菌株(如R1000)轉(zhuǎn)接到 含卡那霉素(Kanamycin sulfate, Km)的YEB液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將此活化菌 液100 ii 1涂布到在含有茶多酚(TC80)濃度為25-800 y g/ml和含Km的AB固體培養(yǎng)基上 進行抑菌培養(yǎng)，待大部分培養(yǎng)皿有菌落長出時(約培養(yǎng)24-48小時)挑取在較高濃度下仍 能生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含相應濃度TC80的液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將活化的菌液 100 ill涂布到分別含200-1000 g/ml不同濃度的茶多酚的平板進行再次抗酚篩選和活化 培養(yǎng)，依此進行兩三次抗酚篩選直至獲得在800-1000 g/ml仍能生長的抗酚性強的發(fā)根 農(nóng)桿菌。注含Km的YEB液體培養(yǎng)基由下法得到將lg酵母提取物，5g牛肉浸膏，5g蛋白 胨，O. 5gMgS04 7H^，5g蔗糖溶解到900ml的蒸餾水中，再用1NnaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2，然 后用蒸餾水定容至1000ml，高壓蒸汽滅菌(15bf/ir^，20min)，待培養(yǎng)基溫度降至60°C以下 (手感不燙)加入經(jīng)0.22ii過濾滅菌的卡那霉素(Kanamycin sulfate, Km) 100mg/L。
含Km AB培養(yǎng)基由下法得到將3gK2HP04， lgNaH2P04， 0. 15gKCl， 0. 5gMgS04 7H20， lgNH4Cl，0. 01CaCl2，2. 5mg FeS04 *7H20， 5g蔗糖用IN NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2 (配固體培養(yǎng)基 時加15g瓊脂)，然后用蒸餾水定容至1000ml，高壓蒸汽滅菌(15bf/in2，20min)待培養(yǎng)基溫 度降至60。C以下(手感不燙)加入經(jīng)0.22ii過濾滅菌的卡那霉素(Kanamycin sulfate, Km) 100mg/L。茶多酚制品(由長沙金農(nóng)天然植物制品實業(yè)有限公司提供)，其中兒茶素組成 為:咖啡因O. 26%，表沒食子兒茶素2.66%， (11-兒茶素0.71%，表兒茶素2. 15%，表沒食 子兒茶素沒食子酯62. 83%，沒食子兒茶素沒食子酯3. 03%，表兒茶素沒食子酯16. 79%， 其余為雜質(zhì)；兒茶素總量88. 17%。 實施例用接種環(huán)挑取儲存的原始發(fā)根農(nóng)桿菌菌株R1000轉(zhuǎn)接到含Km的YEB液 體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將此活化菌液100 iU涂布到在含有茶多酚(TC80)濃度為 100 i！ g/ml和含Km的AB固體培養(yǎng)基上進行抑菌培養(yǎng)，待大部分培養(yǎng)皿有菌落長出時(約 培養(yǎng)24-48小時)，挑取在200 g/ml茶多酚濃度下仍能生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含相應濃度 TC80的液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將活化的菌液100 1涂布到分別含200、400、800和 1000 g/ml濃度的茶多酚的含卡那霉素的AB液體培養(yǎng)基的平板進行再次抗酚篩選和活化 培養(yǎng)，依此進行兩次抗酚篩選，獲得在900 g/ml茶多酚濃度的培養(yǎng)基仍能生長的抗酚性 強的發(fā)根農(nóng)桿菌。獲得的抗酚性強的菌株可提高茶樹的發(fā)根誘導頻率2倍及發(fā)根密度3倍。
權(quán)利要求
一種篩選抗酚發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的方法，將發(fā)根農(nóng)桿菌菌株(Agrobacterium rhizogenes)轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將此活化菌液100μl涂布在含有茶多酚濃度為25-800μg/ml以及含卡那霉素的AB固體培養(yǎng)基上進行抑菌培養(yǎng)24-48小時，挑取在200μg/ml茶多酚濃度下仍能生長的單菌落，再轉(zhuǎn)接到含200μg/ml濃度茶多酚的含卡那霉素的AB液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將活化的菌液100μl分別涂布到含200、400、800和1000μg/ml濃度的茶多酚的含卡那霉素的AB液體培養(yǎng)基的平板進行再次抗酚篩選和活化培養(yǎng)，依此進行2-3次抗酚篩選直至獲得在800-1000μg/ml濃度茶多酚培養(yǎng)基仍然能生長形成菌落的抗酚性強的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基由下 法得到將lg酵母提取物，5g牛肉浸膏，5g蛋白胨，0. 5gMgS04 7H20， 5g蔗糖溶解到900ml 的蒸餾水中，再用INnaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2，然后用蒸餾水定容至1000ml，蒸汽滅菌，待培養(yǎng) 基溫度降至60°C以下加入經(jīng)0. 22 ii微孔濾膜過濾滅菌的濃度100mg/ml卡那霉素1ml 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述含卡那霉素AB固體培養(yǎng)基由 下法得到:將3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、0. 5gMgS04 7H20、 lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mg FeS04 *7H20、5g蔗糖和15g瓊脂溶解到900ml的蒸餾水中，用IN NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2，蒸 汽滅菌，待培養(yǎng)基溫度降至60°C以下加入經(jīng)0. 22 ii微孔濾膜過濾滅菌的濃度100mg/ml卡 那霉素1ml ;所述含卡那霉素AB液體培養(yǎng)基由下法得到^3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、 0. 5gMgS04 7H20、lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mg FeS04 7H20和5g蔗糖溶解到900ml的蒸餾水 中，用IN NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，然后用蒸餾水定容至1000ml，蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基溫度降 至60°C以下加入經(jīng)0. 22 ii微孔濾膜過濾滅菌的濃度100mg/ml卡那霉素1ml 。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述茶多酚中兒茶素的含量》80% 。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述茶多酚含有咖啡因0. 26%，表沒食 子兒茶素2. 66% ， dl-兒茶素0. 71 % ，表兒茶素2. 15% ，表沒食子兒茶素沒食子酯62. 83% ， 沒食子兒茶素沒食子酯3. 03%，表兒茶素沒食子酯16. 79%。
全文摘要
一種篩選抗酚發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的方法。將發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將活化菌液涂布在含有茶多酚和卡那霉素的AB固體培養(yǎng)基上進行抑菌培養(yǎng)，挑取在200μg/ml茶多酚濃度下仍能生長的單菌落，再轉(zhuǎn)接到含200μg/ml濃度茶多酚的含卡那霉素的AB液體培養(yǎng)基進行菌種活化，然后將活化的菌液分別涂布到含不同濃度的茶多酚的培養(yǎng)基的平板進行再次抗酚篩選和活化培養(yǎng)，直至獲得在800-1000μg/ml濃度茶多酚培養(yǎng)基仍然能生長形成菌落的抗酚性強的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。本發(fā)明通過抗酚篩選獲得抗酚性強的菌株，使之在介導茶樹等富含多酚類的植物時仍具有相當高的活性，獲得的抗酚性強的菌株可提高茶樹的發(fā)根誘導頻率及發(fā)根密度2-3倍。
文檔編號C12Q1/04GK101768623SQ20101011996
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者劉仲華, 施兆鵬, 朱旗, 李玲, 楊新河, 毛清黎 申請人:孝感學院