專利名稱：花生AhFatA蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花生AhhtA蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，屬于分析生物學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高等植物?；?ACP硫酯酶O^at)是一種終止脂肪酸合成的酶，可在質(zhì)體游離脂肪酸的生物合成過程中將acyl-ACPs水解脫去ACP，產(chǎn)生游離的脂肪酸。1992年，Voelker 等指出FAT直接決定了脂肪酸從頭合成途徑中脂?；湹拈L度(Voelker T A, Worrell A C, AndersonL. et al. Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants [J]. Science, 1992, 257 :72-74.)?；ㄉ；?ACP 硫酯酶對花生物種子中貯存態(tài)的脂肪酸種類和含量、從質(zhì)體輸出脂肪酸的鏈長和飽和性都起著關(guān)鍵的作用。FatA的酶主要對18 I-ACP有活性，對18 O-ACP也有活性。1998年，Deborah J. Hawkins和Jean C. Kridl在莽吉柿種子cDNA中克隆到兩條FatA序列，在體外表達(dá)時，發(fā)現(xiàn)對C18:1-ACP有特異性的!^atAl也有很強的C18:0_ACP的特異性，構(gòu)建了含莽吉柿!^atAl基因的轉(zhuǎn)基因油菜，結(jié)果在檢測菜籽油中脂肪酸的種類及其含量時，含量本應(yīng)很低的硬脂酸竟然占油菜種子油脂總量的20%以上，這個結(jié)論充分說明了莽吉柿!^atAl有很強的 C18:0-ACP 的特異性(Hawkins D J, Kridl J C. Characterization of acyI-ACP thioesterase of mangosteen(Garcinia magostana)seed and high levels of stearate production in transgenic canola[J]. The Plant Journal,1998,13 (6))。目前已從向日葵、油菜、擬南芥、蓖麻、山竹等多種植物中獲得!^atA基因片段[M. J. Serrano-Vega · R. Garces · Ε. Marti nez-Force. Cloning, characterization and structural model of a FatA-type thioesterase from sunf1 ower seeds (Helianthusannuus L.). Planta (2005) 221 :868-880]。但是，國內(nèi)外在目前的現(xiàn)有技術(shù)中對此基因的研究很少，在花生中尚沒有對!^atA基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種花生AhhtA蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。一種花生Ahi^atA蛋白編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。一種插入了包含上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。一種插入了包含上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列載體的重組細(xì)胞。由上述花生Ahi^atA蛋白編碼基因表達(dá)的Ahi^atA蛋白，具有SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列。上述花生Ahi^atA蛋白編碼基因、載體或重組細(xì)胞在花生品質(zhì)改良中的應(yīng)用。本發(fā)明從花生(Arachis hypogaea)中克隆的Ahi^atA蛋白編碼基因，這在國內(nèi)外尚屬首例。該基因通過影響花生?；?ACP硫酯酶的表達(dá)量，對花生種子中貯存態(tài)的脂肪酸種類和含量進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時還對花生種子中從質(zhì)體輸出的脂肪酸的鏈長和飽和性進(jìn)行調(diào)節(jié)。該基因在花生或其它油料作物種子中的過量表達(dá)，可增強其脂肪酸中C18:l脂肪酸的含量，進(jìn)而提高種子中的含油量，實現(xiàn)花生或其它油料作物品質(zhì)的改良，因此，具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益。


圖1半定量法表示花生Ahi^atA基因在花生根、莖、葉、花和種子中的表達(dá)情況。圖2半定量法表示花生Ahi^atA基因在花生果針入土后10天、20天、30天、40天、 50天、60天、70天的種子中的表達(dá)情況。圖3擬南芥種子脂肪酸氣象色譜檢測結(jié)果；其中FATA正義花生AhhtA正義基因轉(zhuǎn)化擬南芥后的第T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，AhFatA反義花生Ahi^atA反義基因轉(zhuǎn)化擬南芥后的第T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，WT 野生型擬南芥種子。
具體實施例方式實施例1花生Ahi^atA蛋白編碼基因的克隆，具體步驟如下1、5‘端序列確定根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中EST序列信息及山竹、葡萄、蕪菁、芥菜型油菜、擬南芥、萼苣花、紫蘇和德國鳶尾氨基酸比對確定所獲得的EST序列5’端包含AhFATA 基因起始密碼子ATG;2、花生未成熟種子總RNA獲得以魯花14花生未成熟種子為材料，采用改良CTAB 法提取魯花14未成熟種子總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA含量及質(zhì)量；3、目的基因cDNA片段的獲取以獲得的魯花14未成熟種子總RNA為模板，采用 TaKaRa3 ‘-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 反轉(zhuǎn)錄合成 3 ‘RACE Ready cDNA ；4、設(shè)計引物根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中EST序列信息設(shè)計引物FA-f 5' -TTCGTCGGAGGAGTGTATC-3，，(SEQ ID NO.3)FA-r 5' -CTCTCAAGAACCCAACCAAT-3，，(SEQ ID NO. 4)以3 ‘RACE Ready cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min， 94°〇變性308，601復(fù)性308，721延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C IOmin, PCR擴增結(jié)束后對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳；5、電泳后用全式金生物公司膠回收試劑盒對目的基因進(jìn)行回收，程序如下(1)紫外燈下用干凈、鋒利的手術(shù)刀割取盡量小的帶有目的條帶的瓊脂糖塊 (100mg-200mg)，置于 1. 5mL 離心管中；(2)以凝膠質(zhì)量毫克數(shù)溶膠液體積微升數(shù)為1 3的比例加入Extraction Buffer，于恒溫金屬浴中50°C溫育lOmin，得混合液；(3)將步驟(2)制得的混合液全部轉(zhuǎn)至Spin column內(nèi)，室溫6000rpm離心lmin，
棄去管內(nèi)液體；(4)力口 500uL Extraction Buffer 于 Spin column 內(nèi)，12000rpm 離心 lmin,棄去管內(nèi)液體；(5)向 Spin column 內(nèi)加 750uL Wash buffer，12000rpm 離心 lmin，棄去管內(nèi)液體；(6)2000rpm 離心 lmin，將 Spin column 轉(zhuǎn)移至 1. 5mL 無菌離心管中；(7)超凈工作臺上晾干；(8)向 Spin column 內(nèi)加 45uL Elution Buffer，室溫靜置 2min，12000rpm 離心 lmin,目的片段存在于離心管內(nèi)的液體中。6、回收的目的片段與pGEM-T easy (購自Promoga公司)載體連接用T4 DNA Iigase (購自TaKafci公司)將目的基因片段與pGEM-T easy載體連接，連接體系為10X T4 DNA Ligastion Buffer IuL,目的 PCR片段 5uL，pGEM_T easy載體 luL,T4 DNA Ligase (3U/uL)luL，ddH20 2uL。16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。7、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化(1)從37°C培養(yǎng)18 20h的培養(yǎng)基平板上挑取大腸桿菌DH5 α單菌落于30mL LB 液體培養(yǎng)基中，37°C，250r/min振蕩過夜培養(yǎng)；(2)按1/(50 100) (V/V)的量轉(zhuǎn)入新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600 =0. 4 0. 6 ；(3)菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心管種冰浴20min，使培養(yǎng)物冷卻至0°C，4°C，7000rpm離心 5min，收集菌體；(4)棄去上清，倒盡殘液，向沉淀中加入0. 6倍體積冰上預(yù)冷的lOOmmol/L CaCl2, 槍頭吸打混勻，冰浴20min ；(5)4°C，7000rpm離心5min，棄上清，向沉淀中加入IOOuL冰預(yù)冷的IOOmmol/L CaCl2，槍頭吸打混勻，置4°C冰箱備用，或?qū)⒅苽涞母惺軕B(tài)細(xì)胞加入20%無菌甘油，超低溫冰箱一70°C長期保存；(6)將IOuL帶目的片段的重組質(zhì)粒加入到50uL大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中(體積不超過感受態(tài)的5% )，輕輕混勻，對照管不加，冰浴30min ；(7) 420C，熱激90s后迅速置于冰浴2 !Bmin ；(8)各加入 85OuL LB 液體培養(yǎng)基，37°C，I5O-I7Orpm 復(fù)活 45min ；(9)取200uL平鋪到含有氨芐青霉素(50mg/mL)和5_溴-4-氯-3-吲哚-β -d_半乳糖O0mg/mL)的LB固體平板上，用玻璃涂棒涂勻，37°C培養(yǎng)約3小時至菌液被完全吸收， 將平板倒置，37°C過夜后4°C保存平板；8、菌落PCR檢測陽性克隆配制好PCR反應(yīng)液(不加模板)后用無菌牙簽挑取抗性平板上的白色單菌落， 在反應(yīng)液中輕點幾下，進(jìn)行菌落PCR，反應(yīng)體系如下10X PCR buffer 3uL, dNTP (2. 5mM each) 2. 5uL, Mg2+2uL, Taq (5U/uL) 0. 5uL,引物 L-F(IOuM) IuL,引物 L-R(IOuM) IuL, ddH20 20uL。擴增程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin, 35個循環(huán)后，72°C lOmin，擴增結(jié)束后取lOuLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；9、質(zhì)粒DN A提取用天根公司質(zhì)粒小提試劑盒，具體步驟如下(1)挑取菌落PCR陽性的菌落接種于30mL含有氨芐青霉素(50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，180rpm，過夜培養(yǎng)；
(2)取1. 5mL過夜培養(yǎng)的菌液加入1. 5mL離心管中；(3)常溫下12，OOOrpm離心lmin，棄去上清液；(4)加250uL溶液Pl，重懸細(xì)菌體沉淀(重懸后沒有細(xì)菌團(tuán)塊)；(5)加250uL溶液P2，上下翻轉(zhuǎn)4 6次使菌體充分裂解，反應(yīng)時間不超過5分鐘；(6)力Π 350uL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管4 6次，溶液應(yīng)該出現(xiàn)絮狀物， 但不會出現(xiàn)局部沉淀；(7)于 12，OOOrpm 離心 IOmin ；(8)離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移到Spin column內(nèi)，于6，OOOrpm離心lmin，并棄去
收集管內(nèi)液體；(9)向Spin column內(nèi)加750uL漂洗液Pff,于12，OOOg離心30 60秒，并棄去接液管內(nèi)液體后，再次加入650uL Wash Buffer,于12，OOOg離心30 60秒，棄去接液管內(nèi)液體；(10) 12，OOOg離心2min，將Spin column轉(zhuǎn)移到無菌的1. 5mL離心管中，室溫晾干；(11)向 Spin column 內(nèi)加 50uL Elution Buffer，室溫靜置 lmin ；(12)于12，OOOg離心lmin (1. 5mL離心管內(nèi)溶液中含有質(zhì)粒DNA)；10、對提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切驗證，陽性質(zhì)粒送山東省農(nóng)科院高新技術(shù)研究中心測序；11、目的基因全長序列獲得根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的5 ‘端EST序列及測序獲得的3 ‘端序列拼接后得到目的基因全長序列，并設(shè)計全長序列擴增引物AhFatA-f 5' -CTACCATGGAATGTTGAAGGTTTCAT-3，，(SEQ ID NO. 5)AhFatA-r 5' -CATCACGTGGATCATAATCTTGAAGCT-3，，(SEQ ID N0. 6)擴增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35 個循環(huán)后，72°C IOmin,按上述步驟5 9進(jìn)行操作后獲得花生脂酰-ACP硫脂酶基因全長序列，命名為花生Ahi^atA蛋白編碼基因。經(jīng)測序，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。實施例2Ah!^itA基因的序列信息與特性分析花生Ahi^atA蛋白編碼基因全長1650bp，開放閱讀框為1119bp，位于189_1307bp 處。BioXM軟件分析表明Ahi^atA基因共編碼372個氨基酸。根據(jù)PR0SITE SCAN數(shù)據(jù)庫分析花生Ahi^atA基因編碼的氨基酸，發(fā)現(xiàn)此序列包含N端糖基化位點(N-glycosylation site, PS00001)；環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶磷酸化位點(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, PS00004)；蛋白激 Bl C 舞酸化位點(Protein kinase C phosphorylation site, PS00005)；酪蛋白激酶 II 磷酸化位 ^ (Casein kinase Ilphosphorylation site, PS00006) ； (Tyrosine kinase phosphorylation site, PS00007) :N_ 端十四燒?；稽c(N-myristoylation site, PS00008)；微體C-末端定位信號(Microbodies C-terminal targeting signal，PS00342)。用ProtParam預(yù)測編碼蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)，推測其分子式C1835H2938N538O558S17， 分子量為42009. 8，等電點為6. 73，理論推導(dǎo)半衰期為30h，不穩(wěn)定參數(shù)是39. 15，屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白中含量相對較多的氨基酸是Leu(9. )，Arg(8.9% )，Val(8.9% )，Gly(7. 5%),Ser(7.0% ),Glu(7.0% )；并且該蛋白中不含Pyl和kc?？偟膸д姾蓺埢鶠?Arg+Lys) :48總的帶負(fù)1電荷的殘基為(Asp+Glu) :49。該蛋白親水性平均數(shù)為-0. 365， 預(yù)測該蛋白為疏水性蛋白。用SignalP 3. (Server進(jìn)行預(yù)測，表明該蛋白不含信號肽序列， 為非分泌性蛋白。以TMHMM2program為基礎(chǔ)的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)。采用在線HNN網(wǎng)站預(yù)測花生Ahi^atA蛋白二級結(jié)構(gòu)，表明該蛋白含有34. 14%的 α -螺旋，20. 97%的β -折疊以及44. 89%的無規(guī)則卷。用3D-JIGSAW預(yù)測花生Ahi^atA蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白呈緊密的球狀結(jié)構(gòu)。實施例3單鏈cDNA的獲得及Ahi^atA在魯花14不同組織中的表達(dá)模式分析分別以魯花14的根、莖、葉、花、種子和魯花14果針入土后10天、20天、30天、 40 天、50 天、60 天、70 天種子的總 RNA 為材料，利用 PrimeScript 1st Strand cDNA SynthesisKit(TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，根據(jù)GenBank中β -actin序列設(shè)計 1對引物F 5 ‘-GCAGGGCGTGATTTAACTG-3，，(SEQ ID NO. 7)R 5 ‘-CTCCGATCCAGACACTGTACT-3，. (SEQ ID NO. 8)以β -actin為內(nèi)參基因進(jìn)行半定量RT-PCR分析硫脂酶基因Ahi^atA在魯花14不同組織中的表達(dá)量。AhhtA引物AhFatA-RT-F 5 ‘-CAATAAGACTGCCACCGT-3，，(SEQ ID NO. 9)AhFatA-RT-R 5 ‘-TCAAGAACCCAACCAAT-3，，(SEQ ID NO. 10) PCR 反應(yīng)條件為: 940C 5min，后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C Imin 進(jìn)行四個循環(huán)；最后 72°C lOmin，反應(yīng)結(jié)束后， 進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示Ahi^aU在魯花14花生各部位中都有表達(dá)，其中種子中表達(dá)量最高，在葉、花中表達(dá)量次之，在根中表達(dá)稍低，在莖中幾乎不表達(dá)(如圖1所示)；AhhtA在花生果針入土后第10天到第70天都有表達(dá)，其中第10天表達(dá)量較低，第30 天表達(dá)量最高(如圖2所示)。實施例4花生Ahi^atA基因正反義表達(dá)載體的構(gòu)建(1)根據(jù)分離出的花生AhhtA基因核苷酸序列，設(shè)計引物正義正向引物5，—CTACCATGGAATGTTGAAGGTTTCAT—3'(SEQ ID N0. 11)正義反向引物5，—CATCACGTGGATCATAATCTTGAAGCT—3'(SEQ ID N0. 12)反義正向引物5，—CTACACGTGAATGTTGAAGGTTTCAT—3'(SEQ ID N0. 13)反義反向引物5，—CATCCATGGGATCATAATCTTGAAGCT—3'(SEQ ID N0. 14)(2)以花生種子總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序如下 模板 cDNAl μ L, 2 Xpfu MixlO. OyL, primerl (IOum) 0. 5 μ L, primer2 (IOum) 0. 5 μ L, ddH208. 0 μ L。PCR 反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，55 °C 復(fù)性 30s，72 °C 延伸 lmin，35個循環(huán)后，72°C IOmin結(jié)束反應(yīng)。取5yL PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，切膠回收，連接PGEM-T easy載體(購自progenia公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α， 藍(lán)白斑篩選后挑取白色菌落在LB液體培養(yǎng)基中搖菌，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測定，具體方法同實施例1中步驟5 10。(3)用NcoI和RnlI兩個限制性內(nèi)切酶將花生Ahi^atA正反兩個基因從pGEM_T easy載體上切下，與同樣經(jīng)NcoI和PmlI酶切的pCAMBIA3301載體(購自cambia公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后在含卡那霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對菌落進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。將構(gòu)建好的正反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。實施例5農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥(1)挑取轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌單克隆于含50μ g/ml卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中， 28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0. 6，離心收集菌體，5 %蔗糖溶液(0. 02% Silwet L-77) 溶液懸浮沉淀，得滲透液；(2)將盛花期擬南芥花序浸入步驟(1)制得的滲透液中，浸泡5分鐘；(3)收獲經(jīng)浸泡花序的擬南芥的種子并在篩選培養(yǎng)基上篩選，得到抗性植株；(4)培育步驟(3)制得的抗性植株，獲得Tl代純合株系種子并種植于培養(yǎng)室，2月后觀察生長狀況。實施例6轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得(1)收獲實施例4種植的擬南芥的種子，種植該種子并收獲第二代種子；(2)萌發(fā)少量第二代種子，通過提取DNA進(jìn)行PCR檢測、Southern雜交方法，驗證轉(zhuǎn)基因植株，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥；(3)測定轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中脂肪酸的含量。表1為經(jīng)氣象色譜檢測的擬南芥種子中脂肪酸含量。表 1
C16:0C16:lC18:0C18:lC18:2C18:3C20:0C20:lC20:2C20:3WT2.077.953.913.7329.3717.52.8520.371.810.45FatA 正2.018.072.0218.8530.5615.212.4319.491.150.21FatA 反2.357.84.511.729.8517.563.0720.12.320.75注WT 為野生型擬南芥種子；FatA正轉(zhuǎn)正義花生Ahi^atA基因得T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子；FatA反轉(zhuǎn)反義花生Ahi^atA基因得T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。由表1可看出，與野生型相比，轉(zhuǎn)正義Ahi^atA的擬南芥種子中C18:1含量增加了 4. 92%，進(jìn)而使擬南芥種子中C18:2含量也稍有升高；轉(zhuǎn)反義Ahi^atA的擬南芥種子中 C18:l 含量下降了 2. 03%，而其它脂肪酸如 C16:0、C16:1、C18:0、C18:2、C18:3、C20:0 無明顯變化。表明過量表達(dá)花生硫脂酶基因AhhtA可以有效提高轉(zhuǎn)基因作物中脂肪酸中C18:l 的含量，同時可有效提高種子含油量。對于改良作物品質(zhì)，提高生物量具有重要的意義。
權(quán)利要求
1.一種花生Ahi^atA蛋白編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種插入了包含SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。
3.一種插入了包含SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列載體的重組細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述花生Ahi^atA蛋白編碼基因表達(dá)的Ahi^atA蛋白，具有SEQID NO. 2 所示氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的花生Ahi^atA蛋白編碼基因、權(quán)利要求2所述的載體或權(quán)利要求3 所述的重組細(xì)胞在花生品質(zhì)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及花生AhFatA蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。一種花生AhFatA蛋白編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示由上述花生AhFatA蛋白編碼基因表達(dá)的AhFatA蛋白，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。本發(fā)明為下一步在花生中對AhFatA基因進(jìn)行過量表達(dá)及抑制表達(dá)研究，提高花生種子含油量和實現(xiàn)花生品質(zhì)改良的研究奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/15GK102492704SQ201110368839
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者單雷, 唐桂英, 張斌, 彭振英, 李蘭, 畢玉平, 陳高 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心